受水稻白叶枯病菌与细菌性条斑病菌诱导的启动子及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种受水稻白叶枯病菌与细菌性条斑病菌诱导的启动子及应用。本发明所提供的启动子是下述a）-c）中任一的DNA片段：a）序列表中序列1所示DNA片段；b）与a）限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；c）在严格条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。实验证明，将本发明启动子驱动Gus基因的植物表达载体导入水稻中，获得转基因水稻；接种水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌，发现转基因水稻叶片的Gus可受水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌诱导表达。本发明所提供的启动子对于培育食用安全的转基因植物抗病新品种具有重要的意义。
【专利说明】受水稻白叶枯病菌与细菌性条斑病菌诱导的启动子及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种受水稻白叶枯病菌与细菌性条斑病菌诱导的启动子及应用。
【背景技术】
[0002]植物在生长过程中经常各种病虫害的危害。因此通过基因工程手段获得抗病种质将极大的促进农业生产及消除病害的防治时施用农药带来的环境污染。
[0003]基因的表达与启动子密切相关，自1983年第一株转基因植物问世以来，启动子一直是基因工程的研究热点，选择合适并有效表达的启动子将为基因工程的研究奠定坚实的基础。诱导型表达启动子可以使外源基因对某些信号产生响应，只在特殊的信号刺激下表达。这些启动子的最大优点是:它克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异性的持续、高效表达所的浪费。
[0004]TALEs (transcription activator - like effectors)是在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中发现的一种转录激活子样效应因子,TALEs的发现和结合DNA的特点为开发更简易的新型基因组定点修饰技术提供了新途径。植物病原体黄单胞菌将TALEs蛋白通过III型分泌系统注入植物细胞，TALEs细菌蛋白与转录因子行为相似，穿过核膜进入细胞核内与特定的UPT (Up-regulated by TALE)盒结合，调控植物基因组中与疾病和抵抗力相关基因的表达。目前，在植物 病原菌中发现的该类蛋白已达到10余种。TALEs具有特殊的结构特征，包括N端分泌信号、中央的DNA结合域、I个核定位信号和C端的激活域。通过对目前发现的所有TALEs蛋白分析发现，TALEs蛋白中DNA结合域有I个共同的特点，不同的TALEs蛋白的DNA结合域是由数目不同的(12~30)、高度保守的重复单元组成，每个重复单元含有33~35个氨基酸。这些重复单元的氨基酸组成相当保守，除了第12和13位氨基酸可变外，其它氨基酸都是相同的，这两个可变氨基酸被称为重复序列可变的双氨基酸残基(repeatvariable d1-residues,RVD)。TALEs识别DNA的机制在于每个重复序列的2个RVD可以特异识别DNA的4个碱基中的I个，目前发现的RVD共有26种.统计分析发现，HD (氨基酸名称)主要特异识别C碱基，NI主要识别A碱基，NK主要识别G碱基，NG主要识别T喊基等。
[0005]水稻是最重要的粮食作物之一，属于黄单胞菌属的水稻白叶枯病与细菌性条斑病是严重影响水稻生产的病害，受两种病害诱导表达的启动子的出现将助于抗病品种的培育。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种受水稻白叶枯病菌与细菌性条斑病菌诱导的启动子及应用。
[0007]本发明所提供的启动子，是下述a) -c)中任一的DNA片段:
[0008]a)序列表中序列I的第7-359位核苷酸所示DNA片段；
[0009]b)与a)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段；[0010]c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。
[0011]上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC，
0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0012]含有所述DNA分子(启动子)的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0013]在本发明中，所述重组载体为用所述DNA分子(启动子)替换掉PCAMBIA1301载体中自身启动子后得到的重组质粒(ptale promoter::Gus载体)。
[0014]更加具体的，所 述重组载体为用所述DNA分子(启动子)替换掉PCAMBIA1301载体的Kpn I和Noc I之间的小片段后所形成的重组质粒
[0015]所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。
[0016]在本发明的一个实施例中，所述表达盒中的所述目的基因具体为Gus基因(来源于所述PCAMBIA1301载体)；所述表达盒中的所述转录终止序列具体为NOS转录终止子(来源于所述 PCAMBIA1301)。
[0017]所述DNA分子(启动子)在启动目的基因表达中的应用也属于本发明的保护范围。
[0018]在所述应用中，所述表达具体为受水稻白叶枯病菌或/和水稻细菌性条斑病菌诱导表达。
[0019]在所述应用中,所述表达可为植物体内表达；如在植物叶片表达。
[0020]进一步，在本发明中，所述诱导具体为:将转入所述DNA分子(启动子)和所述目的基因的植株或器官(如叶片)置于浓度为109CFU/mL的水稻白叶枯病菌的菌悬液或浓度为109CFU/mL的水稻细菌性条斑病菌的菌悬液中进行诱导。诱导的时间可为2天，温度可为28°C，光周期可为L16:D8 (16h光，8h暗)。
[0021]所述DNA分子(启动子)在如下任一种的应用也属于本发明的保护范围:
[0022]( I)提高植物抗病性；
[0023](2)培育抗病性提高的转基因植物。
[0024]在(2)所述应用中，所述培育抗病性提高的转基因植物，为:将含有所述DNA分子(启动子)的表达盒导入目的植物中，得到所述转基因植物；所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的抗病基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述抗病基因连接，且所述抗病基因与所述转录终止序列连接。
[0025]在所述应用中，所述病为由黄单胞菌属菌株引起的病；所述黄单胞菌属菌株具体为水稻白叶枯病菌或/和水稻细菌性条斑病菌。
[0026]在本发明中，以上所有的所述水稻白叶枯病菌均为水稻白叶枯病菌PX099 ;以上所有的所述水稻细菌性条斑病菌均为水稻细菌性条斑病菌RS105。
[0027]在所述应用中，所述目的基因可为Gus基因，所述抗病基因为Xa27基因(序列2)。所述植物可为双子叶植物或单子叶植物；在本发明的一个实施例中，所述植物具体为水稻，如水稻品种台北309。
[0028]实验证明，将本发明启动子驱动Gus基因的植物表达载体导入水稻中，获得转基因水稻；接种水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌，发现转基因水稻叶片的Gus可受水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌诱导表达。本发明所提供的启动子对于培育抗病性更强的植物新品种具有重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1Tale promoter启动子结构示意图。其中，KpnI, NcoI, BamHI为限制性内切酶；Xoc开头为水稻细菌性条斑病菌的Tale识别序列；其他为水稻白叶枯病菌的Tale识别序列。
[0030]图2为部分转基因水稻的分子检测结果。其中，A为潮霉素基因hpt的PCR分子鉴定结果；B为目标基因Tale promoter的鉴定结果；A和B中，泳道1_12为Ttl代转ptalepromoter::Gus 水稻，泳道 Tale::GUS 为阳性对照(重组载体 ptale promoter::Gus),泳道TP309CK为阴性对照(未转基因的水稻品种台北309)，泳道Marker为DNA分子量标准为DL2000，从大到小的条带的大小分别为 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp0
[0031]图3为部分转基因水稻Gus染色结果。其中，Line2、Line3和Line7为经实施例3步骤二鉴定阳性的3个Ttl代转ptale promoter::Gus。H2O为水对照,Xoo P6为水稻白叶枯病菌PX099，Xoc RS105为水稻细菌性条斑病菌RS105。
【具体实施方式】
[0032]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0033]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034]水稻白叶枯病菌PX099:记载在“夏志辉，赵显峰，范海阔，金良，高利芬，罗越华，翟文学.分子标记辅助选择Xa23基因改良杂交稻亲本的白叶枯病抗性，分子植物育种，2010, 8 (4): 652-656 ”一文中，公众可从海南大学和中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
[0035]水稻细菌性条斑病菌RS105:记载在“陈现朝，黄立钰，周永力.分水稻类受体激酶基因OsBAKIL调控细胞坏死机制，作物学报，2013，39 (11): 1992-1999”一文中，公众可从海南大学和中国科学院遗传与发育生物学研究所。
[0036]pCAMBIA1301载体:购于上海捷兰生物技术有限公司，货号CPC054。
[0037]水稻品种台北309:记载在“曹孟良.农杆菌介导的水稻高效遗传转化体系的建立；湖南农业大学学报，1999，25 (5):349-356" 一文中，公众可从海南大学和中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
[0038]农杆菌LBA4404:宝生物工程(大连)有限公司:产品号:D9115。
[0039]下述实施例中所涉及的培养基配方如下:
[0040]基本培养基配方
【权利要求】
1.DNA分子，是下述a)-C)中任一的DNA片段: a)序列表中序列I的第7-359位核苷酸所示DNA片段； b)与a)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA片段； c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。
2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为用权利要求1所述DNA分子替换掉pCAMBIA1301载体中自身启动子后得到的重组质粒。
4.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于:所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。
5.权利要求1所述DNA分子启动目的基因表达中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:所述表达为受水稻白叶枯病菌或/和水稻细菌性条斑病菌诱导表达。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于:所述表达为植物体内表达。
8.权利要求1所述DNA分子在如下任一种的应用: (1)提高植物抗病性； (2)培育抗病性提高的 转基因植物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述病为由黄单胞菌属菌株引起的病； 所述黄单胞菌属菌株具体为水稻白叶枯病菌或/和水稻细菌性条斑病菌。
10.根据权利要求7-9中任一所述的应用，其特征在于:所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
【文档编号】A01H5/00GK103740723SQ201410017746
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月15日 优先权日:2014年1月15日
【发明者】夏志辉, 赵天龙, 景晓辉, 翟文学, 李明容, 黄惜, 何朝族 申请人:海南大学, 中国科学院遗传与发育生物学研究所