一种控制油菜菌核病的基因及其应用的制作方法

一种控制油菜菌核病的基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种控制甘蓝型油菜菌核病基因及其应用，具体涉及一种控制甘蓝型油菜菌核病的基因BnWRKY33的分离克隆、功能验证和应用。BnWRKY33基因具有控制作物菌核病的功能，在菌核病处理甘蓝型油菜时BnWRKY33的表达量显著提高。通过基因工程技术提高BnWRKY33基因的表达量能够控制油菜菌核病，从而对提高甘蓝型油菜及其他作物的菌核病抗性和产量具有重要的应用前景。
【专利说明】—种控制油菜菌核病的基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种控制油菜菌核病的基因及其应用，具体涉及一种控制甘蓝型油菜菌核病的基因和含有该基因或其同源基因的载体，并涉及利用该基因或其功能类似物调控植物抗菌核病在农业生产中的应用，属于植物基因工程领域。
【背景技术】
[0002]油菜作为一种重要的油料作物，在中国的油料生产中占有重要的地位。我国油菜年种植面积700万公顷(I亿亩)，占全世界的1/3，居世界首位，其所产菜籽油占我国整个食用植物油供应的40% (沈金雄等，中国油菜生产及遗传改良潜力与油菜生物柴油发展前景[J]，华中农业大学学报，2007年，26卷6期894-899页)。此外，菜籽油也是适宜于生产生物柴油，油菜已被欧美各国作为解决全球能源短缺的重要原料作物。因此油菜不仅是食用油的主要来源，也是解决全球能源短缺的重要原料作物，具有十分重要的战略地位。
[0003]然而，我国的菜籽生产量目前仅能满足国内2/3的消费需求，大量依赖进口。我国2005年进口植物油600多万吨，是世界上最大的油料进口国，随着人口数量的增长和人民生活水平的提高，按目前的生产规模，缺口将会变得更大(王汉中，中国油料产业发展的现状、问题与对策[J]，中国油料作物学报，2005年，27卷4期100-105页)。在当前和今后相当长的时间内，我国都将面临食用油和化石能源短缺的严峻局面。
[0004]油菜菌核病(5b7<9roii/?iasclerotiorum (Lib.) de Bary)是限制我国油菜生产的主要因子之一。在长江中下游及东南沿海油菜主产区，油菜菌核病的发生率很高，产量损失高达50%以上；全国发生面积在7000万亩以上，产量损失高达30%，严重时达到50-80%。目前油菜菌核病的防治方法主要是化学防治技术和抗病品种的选育，但化学防治存在防效不高、病原难以根除、花期喷药困难以及农药残留、环境污染等诸多问题；常规育种因难以找到有效的抗性材料以及速度非常缓慢等缺点，也很难有效解决抗病问题。由此，对抗菌核病油菜品种进行分子改良，快速培育抗菌核病品种，是提高菜籽单位面积产量的重要策略。
[0005]基因工程方法是按预先设计好的目标和计划，通过遗传操作，在分子水平上改良品种的技术。中国农业科学院作物科学研究所发现了一个植物抗病基因为基因a或基因b，将基因a或基因b修饰后对植物的抗性有显著提高(申请号:201110048518.9，2011)。而像油菜菌核病这类在寄主植物种内难于找到抗原的病害，基因工程方法提供了一种解决问题的途径。
[0006] WRKY转录因子家族是近年来研究较广泛的一类重要的转录因子，它存在于整个绿色植物系中，在调控植物生物胁迫反应及其相关信号转导途径中具有重要作用(AsaiT et al.,, MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity [J],Nature, 2002年，415卷6875期977-983页)。FMTJJ转录因子是WRKY转录因子家族中的重要一员，含有两个WRKY蛋白结构域，属于第I类WRKY蛋白(Eulgem et al.，The WRKYsuperfamily of plant transcription factors[J], Trends Plant Sci,2000 年，5 卷 5期199-206页)。已有研究表明转录因子是腐生型真菌抗性所必需的，它能够与(T) TGACC(A / T)序列(w-box)发生特异性作用，调节启动子中含W — box元件的调苄基因或功能基因的表达(Lippok B et al., Expression of AtWRKY33 encoding a pathogen-or PAMP-responsive WRKY transcription factor is regulated by a composite DNAmotif containing W box elements[J] ,Mol Plant Microbe Interact,2007年，20卷4期420-429页)。中国科学院植物研究所研究发现，WRKY的多肽Glyma02g39870能够调控植物中水杨酸的合成，从而增强植物的抗病性(金京波等，2012 ;申请号:201010541600.0)。拟南芥通过遞与AtMPK4形成一个复合体，当受到病原菌侵害时，AtWRKY33和AtMPK4从AtMKSl中脱离，从而引起下游一些激素相关的基因，如PRl、TOF1.2等的表达(Jin-Long Qiu et al, Arabidopsis MAP Kinase 4 regulates gene expression viatranscription factor release in the nucleus [J], EMBO Journal, 2008 年，27 卷 16 期2214 - 2221页)。将大白菜过表达后，大白菜呈现出对软腐病一定的抗性(范荣伟等，大白菜份fMTJJ基因上游调控序列的克隆及其功能研究[J]，农业生物技术学报，2010年，18卷4期670-675页)。而对于油菜的作用，目前还未见有文献及专利的报道。在本研究中我们发现，菌核病对油菜胁迫处理之后，的表达显著提高，进而，甘蓝型油菜转基因过表达植株显著增强菌核病抗性，这一结果在增强油菜菌核病抗性和提高菜籽油产量上具有重要的应用前景。
[0007]
【发明内容】

[0008]本发明的目的在于提供一种控制作物菌核病的基因BnWRKY33。
[0009]一种来源于油菜的基因及其核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示。
[0010]本发明还公开了基因编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2所
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[0011]本发明还公开了带有BnWRKY33基因的重组载体1300-35S-WRKY33-N0S。在载体pCAMBIA1300 (购于北京鼎国昌盛生物公司)的上游EcoRI/Kpnl酶切位点处加入CaMV35S强启动子，其下游BamHI/Hindlll酶切位点处加上CaMV Nos终止子，将其改造成载体pCAMBIA1300-35S-Nos。而重组载体 1300-35S-WRKY33-N0S 热:X BnWRKY33_? (5' -ggtaccATGGCTGCTTCTTCCCTTC-3' ) ,BnWRKY33~R{^' -ggatccTCAAGACAAAAACGAATCAAAG-3')为引物扩增出目的基因及?腸，进而按照gateway试剂盒(Gateway? LR Clonase?II EnzymeMix , Invitrogen Corporation)操作，将目的基因克隆到 pCAMBIA1300-35S_Nos 的酶切位点 KpnI/BamHI，得到 1300-35S-WRKY33-N0S。
[0012]本发明进一步提供了所述BnWRKY33基因在提高油菜对菌核病的抗性中的应用，本发明通过过量表达该基因来达到提高甘蓝型油菜对死体营养型病菌菌核病的抗性。具体实验技术步骤如下:
创建甘蓝型油菜cDNA文库，从cDNA文库中PCR扩增出与AtWRKY33同源的cDNA，进行测序，发现这个cDNA克隆为1452bp,在GenBank数据库对其Blast核苷酸比对,发现这个cDNA序列与拟南芥、烟草等的转录因子WRKY33在核苷酸水平上有很高的同源性。为了初步探测WRKY33对菌核病侵染的反应，用核盘菌(从江苏镇江油菜中分离)接种油菜叶片，分别在接种0、12、24、36、48 h时采样然后提取叶片总RNA，然后使用实时荧光定量PCR检测BnWRKY33的表达量。用携带有1300-35S-WRKY33-N0S载体的农杆菌以浸花法转化甘蓝型油菜，采用PCR技术鉴定出转基因株系，通过RT -PCR技术鉴定出表达水平显著高于非转基因株系的过表达转基因株系。菌核病抗病评价实验表明，与非转基因株系相比，BnWRKY33过表达转基因株系显著提高菌核病抗性。这些结果表明BnWRKY33基因在增强油菜菌核病抗性上具有重要的应用前景。
[0013]本发明的优点:
1.本发明中所采用的从油菜CDNA文库来克隆基因，可靠性高、速度快、效率高。
[0014]2.本发明中所采用的花粉管通道法转化油菜，速度快、成本低、操作简单。
[0015]3.本发明中克隆得到的基因，为其它作物抗病育种提供了新的基因源；为研究怎样提高其它作物的菌核病抗性具有指导借鉴作用。
[0016]4.本发明所获得的转基因材料，为进一步培育高度菌核病抗性的油菜新品种提供新的育种材料。
[0017]5.BnWRKV33转基因油菜植株显著提高菌核病抗性，对油菜的生产具有重要意义。
[0018]^.BnVRKY33被鉴定为油菜菌核病抗性基因，对阐明BnWRKY33基因的生物学功能
有重要意义。
[0019]7.BnWRKY33这一油菜菌核病抗性基因的发现，为发掘和鉴定作物抗菌核病基因，并深入探讨抗菌核病基因的分子作用机理，具有重要的理论指导意义；在作物抗菌核病的育种实践、品种改良及品种推广均具有重要的实践指导价值。
[0020]【专利附图】

【附图说明】:
图1为与其它物种WRKY33的氨基酸序列比对；其中各物种的缩写为:Bn {Brassica 似/瓜^):甘蓝型油菜；Bo ( Brassica oJeracea):花椰菜；Cr {Capsellarubella ):莽菜；AtPu_protein (Thellungi el la halophila unnamed protein):小盐芥；AtPu—protein (.Arabidopsis thaliana putative WRKY33):拟南芥；A1 (.Arabidopsis深山南介；RcTF(TPicizw1S communis transcription factor):蓖麻；Jc?/rcM):桐油树。黑色区域显示的为相同的氨基酸，灰色区域显示的为类似的氨基酸，WRKYGQK为WRKY结构域，用方框标出。
[0021 ] 图2为BnWRKY33对核盘菌侵染的反应。
[0022]图3 为 BnWRKY33 表达载体 1300-35S-WRKY33-N0S 构建示意图；
图4为油菜转基因株系的鉴定；“正”为1300-35S-WRKY33-N0S载体的PCR阳性对照。#1到#20分别为20个转基因株系。“负”为非转基因野生型对照。
[0023]图5为RT-PCR检测转基因过表达株系与非转基因野生型株系中表达水平的比较；WT为非转基因野生型对照；#6、#8、#10为独立的转基因株系。
[0024]图6为过表达转基因株系与非转基因野生型株系的菌核病抗性比较；WT为非转基因野生型对照；#8为转基因株系。
[0025]图7为过表达转基因株系与非转基因野生型株系菌核病病斑扩展的比较；WT为非转基因野生型对照；#6、#8、#10为独立的转基因株系。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1: BnWRKY33基因的分离克隆(I)BnWRKY33基因的分离和克隆
以甘蓝型油菜的中双9号品种作为实验材料，生长条件为:温度为20 土 2° C;湿度为60-90% ;每天光周期为光照8 h黑暗16 h ;光照强度为44 μ mo I m_2 s — 1。
[0027]油菜叶片总RNA的提取和cDNA的合成采用UNIQ- 10柱式Trizol试剂盒(购于上海英俊生物技术有限公司)，使用DNase I (宝生物工程(大连)有限公司)除去总RNA中混有的少量DNA，最后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。cDNA的合成按照MMLV反转录酶试剂盒(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)的操作说明进行，引物用50μ mol/L Oligo (dT) 18 (Thermo Fisher Scientific)。然后使用引物(5'-ATGGCTGCTTCTTCCCTTC-3')和及(5' - TCAAGACAAAAACGAATCAAAG-3')来扩增目的条带，然后将PCR产物克隆进pMD18-T载体(宝生物工程(大连)有限公司)。目的片段的回收、连接与转化参照UNIQ- 10柱式DNA胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)进行操作。目的片段与T载体的连接体系为:4.6 UL目的片段、0.4 ULPMD-18T载体、5 μ L Solution I (宝生物工程(大连)有限公司)在16°C下连接过夜。将其送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
[0028]基因序列结构分析
经测序，发现这个基因的核苷酸序列长为1452bp，含有一个全长的开放阅读框，使用ClustalX (Thompson et al., 1997 )程序进行多种氨基酸序列的比对发现,这个目的条带与拟南芥、花椰菜、荠菜、小盐芥、深山南介、蓖麻和桐油树的WRKY33在氨基酸水平上有很高的同源性(图1)。因此，这个基因被命名为将其提交到GenBank，登录号为KF712488。BnWRKY33含有两个WRKY结构域，其上携带有各自的CXt5CX22I3HX1H的锌指结构，属于 WRKY 转录因子家族的 I 类(Eulgem et al., The WRKY superfamily of planttranscription factors [J], Trends Plant Sci, 2000 年，5 卷 5 期 199-206 页)。比对发现，这些序列在C末端的WRKY结构域保守位点都具有与蛋白互作相关的关键残基天冬氨酸(Cheng et al., Structural and Functional Analysis of VQ Motif-ContainingProteins in Arabidopsis as Interacting Proteins of WRKY Transcription Factors[J], Plant Physiology, 2012年，159卷2期810-825页)。同时，在相对保守的N-末端，都含有4-5个丝氨酸-脯氨酸残基位点，其可能为潜在的MAP激酶磷酸化位点(Shairockset al., Docking domains and substrate-specificity determination for MAPkinases [J], Trends Biochem Sci, 2000 年，25 卷 9 期 448-453 页)。通过软件 PSORT II预测发现，这些蛋白序列中含有高度保守的核定位信号。
[0029]实施例2:对核盘菌的反应
(I)核盘菌的处理
对油菜幼苗(四叶一心期时)第三叶进行菌核病病原菌核盘菌的接种处理，处理前将植株进行23°C恒温培养4~5天，然后叶片置于黑暗环境保湿24 h。然后用核盘菌的菌丝块进行接种，对照接以无菌培养基块。分别在接种后O h、12 h、24 h、36 h、48 h采样。
[0030](2)甘蓝型油菜RNA的提取
利用植物Trizol (上海英俊生物技术有限公司)试剂抽提其总RNA。
[0031](3)实时定量PCR
突光定量 PCR 使用 SYBR? Green Realtime PCR Master Mix - Plus -试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)，采用汉 napusUBC21 (ubiquitin-conjugating enzyme 21)作为内标基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。UBC21的引物是F:5’ -CCTCTGCAGCCTCCTCAAGT-3 ’和 5Λ - CATATCTCCCCTGTCTTGAAATGC-3'，BnVRKY33 基因的引物序列:5Λ- AGAGGACGGTTACAACTGGAGAAA-3^ and 5^- TGTCGGACAGCTTGGGAAAG- 3Λ。荧光定量反应体系为20 μι:含有SYBR Mix 10 μL，正反向引物(10 Mmol/L)各0.8 μL，模板2 μL和DEPC处理过的无菌水。扩增条件为:95°C，30sec ;然后95°C 5s,60°C 30 s，72°C 27s，40个循环；每个循环于72°C复性末端进行荧光检测。反应结束后先加热到95°C，然后降至720C，再缓慢升温至95°C，记录荧光信号的变化，得出扩增产物的熔解曲线。每组实验均完成三个生物学重复,每个生物学重复至少做三次技术重复。检测分别在油菜核盘菌诱导的叶片0-48 h的动态表达变化。
[0032]首先以溶解曲线为标准，利用ABI (美国应用生物系统公司)型号为QPCR7300仪所自带的软件7300 System-SDSS hell，优化内标基因和目的基因PCR反应条件，使之扩增产物特异。本实验以油菜BnUBC21为内标基因，分别测定BnUBC21和目的基因的Ct值，取其平均值，用比较Ct法得到目的基因对内标基因的DCt，然后以水处理的叶片为参照(即将其值转换成I)分别获得其它处理的DDCt，最后通过2-DDCt估算目的基因的相对表达值，并且求出系统误差。[0033]结果显示，当核盘菌侵染24h树,BnWRKY33的转录水平升高9.1倍，当核盘菌侵染48h树,BnWRKY33的表达量相较于未接种核盘菌菌株提高11倍(图2)。说明油菜
对核盘菌的侵染有显著的响应。
[0034]实施例3:过表达转基因油菜植株的获得
(I)植物表达载体构建
设计引 物 5 ' -gaattcTTAATTAAGAGCTCGCATGCC-3 ' 和5 ' -ggtaccGTCCCCGTGTTCTCTCCAA-3 '，采用PCR的手段从pEGAD载体(购于宝生物工程(大连)有限公司)中扩增得到CaMV 35S片段，然后将其连接到pCAMBIA1300载体(购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)的EcoRI/Kpnl酶切位点；同时设计引物5'-ggatccGAATTTCCCCGATCGTTCAA ' -3 '和 5 ' -aagcttGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3 '，用PCR从pEGAD载体中扩增得到CaMV Nos片段，将其连接到pCAMBIA1300载体的Bamm/NindlII 酶切位点，则得到 pCAMBIA1300-35S_Nos 载体。所用内切酶 EcoR1、KpnI^afflHI及均购于宝生物工程(大连)有限公司，酶切条件为37°C静置12h。接着设计引物 5' -ggtaccATGGCTGCTTCTTCCCTTC-3 '和5' -ggatccTCAAGACAAAAACGAATCAAAG-3'，以甘蓝型油菜cDNA为模板进行PCR扩增，得到所需的长为1473kb的目的片断，将其连接到pCAMBIA1300-35S-Nos的KpnI/BamHI酶切位点上，反应体系为:1.KpnI I ul,10*Hbufferlul, DNA Iul (2ug)，ddH20 7ul ；I1.BamHI I ul,10*Kbufferlul, DNA Iul(2ug)，ddH20 7ul，将其置于37°C静置12h。从而创建到甘蓝型油菜转基因过量表达载体1300-35S-WRKY33-N0S，在其T-DNA区内含有抗潮霉素的筛选标记，过量表达的启动子为35s启动子(图3)。
[0035](2)油菜的遗传转化
将1300-35S-WRKY33-N0S转入农杆菌GV3101，浸染油菜花三次，每次五分钟。浸染步骤
为:(I)在含有相应抗生素的LB液体培养基的试管中培养含有重组质粒的农杆菌GV3101，然后按10%的比例接入含有相应抗生素的LB液体培养基的三角瓶使农杆菌培养液终浓度为0D600约为2.0左右。
[0036](2)在培养基内加入转化缓冲液:
0.1%Silwet-77
2ng/L6-BA
8mg/L乙酰丁香酮
(3)把油菜的整个未开的花蕾部分浸泡在农杆菌溶液中3-5min，同时轻轻摇动使花蕾充分接触农杆菌液。把浸泡过的花蕾套入羊皮纸袋24h，以保持花蕾具有较高的湿度，避免花蕾在过量的阳光中暴晒，防止农杆菌失去活性。
[0037](4)隔一天重复步骤(3)，并把整个花蕾套在羊皮纸袋中48h。
[0038](5)浸花结束后，去掉花序上的羊皮纸袋，剪切新生出的侧枝花序以及经过浸花的花序其顶端新萌发的花蕾，并利用彩色丝线对浸染过农杆菌的花序进行系线标记，不同重组质粒的构建进行标签标记。
[0039](6)正常的浇灌培养植株，并定时剪除新生的侧枝花序以及新生花蕾，直到种子成熟时停止灌溉。收获干种子。通过重组质粒上携带的选择标记进行转化子的筛选。通过此方法筛选出大量的转基因植株。
[0040](3)转基因植株鉴定
收获的种子出苗以后先用25mg/L的潮霉素筛选，选取抗潮霉素的植株，提取基因组，用 PCR 进行鉴定，所用的引物为 5’ -CTTCGCAAGACCCTTCCTC-3’ 和 5’ -ggatccTCAAGACAAAAACGAATCAAAG-3’。对照为野生型非转基因植株(WT)。
[0041]检测结果表明(图4)，阳性对照和#1-#2，#4-#9，#11-#15，#17_#20这17个转化植株均能够扩增出预期大小的电泳条带(1021bp)，而阴性对照则没有电泳条带，表明转基因油菜基因组中已经含有外源基因DNA片段。
[0042](4)边mkBnWRKY33转基因油菜的RT-PCR鉴定
为了确定在油菜中是否过量表达，采样RT-PCR方法进行分析，BnWRKY33的扩增引物为 5’ AGAGGACGGTTACAACTGGAGAAA 3’ 和 5’ TGTCGGACAGCTTGGGAAAG3’，内参基因为 UBC21，其扩增引物 5’ - CCTCTGCAGCCTCCTCAAGT -3’ 和 5’ -CATATCTCCCCTGTCTTGAAATGC-3’，上海生工合成。PCR程序:95°C预变性30S，然后经40个循环(95°C 10s、57°C 10s、72°C 26s)。
[0043]如图所示，#6、#8、#10株系的表达水平显著高于非转基因的野生型对照，表明#6、#8、#10株系为三个独立的过表达转基因株系。
[0044]实施例4 MRKY33过表达转基因油菜抗菌核病的评价
取上述PCR检测为阳性的四叶一心期的转他腸光7幻阳性植株的第四片真叶进行离体接种。叶片剪下置于白瓷盘中，每个转基因植株叶片与非转基因对照并排置于一个盘中，叶片下铺一层湿纱布，取新鲜制备的Φ5πιπι菌丝块，有菌丝的面朝下，接种于叶片中部稍稍偏离主脉的位置，每叶接种两个菌丝块。用透气膜蒙上盘口利于保湿，然后置22°C黑暗培养。
[0045]菌丝培养后12 h 开始观察记录菌丝的发生情况，培养后24 h开始观测记录菌斑生长量，每隔24 h一次，直至菌丝长到离体叶边缘为止。[0046]离体叶片接种鉴定结果显示转基因植株明显增强菌核病抗性。如图6和图7所示，核盘菌病斑在BnWRKY33过表达转基因株系中的生长面积要比非转基因株系中小很多，损伤组织的面积也要小。根据核盘菌的生长面积可以发现，软腐坏死发生在核盘菌接种24h后，且在36-48 h期间生长迅速，在48 h时其生长面积达到最大。#6，#8和#10这三个独立株系一直保持相同的趋势，且对核盘菌的抗性表型相同。在接种48小时时，BnWRKY33转基因植株#6，#8和#10叶片病斑仅为野生型对照的一半。在病菌的扩散速度方面，可以发现过表达转基因株系的扩散速度要明显缓于非转基因株系中病斑的扩散速度，在油菜中BnWRKY33具有提高菌核病抗性的作用。
【权利要求】
1.一种控制油菜菌核病的基因，其序列为SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。
2.一种控制油菜菌核病的基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID N0.2所示氨基酸序列。
3.一种重组载体1300-35S-WRKY33-N0S，它含有权利要求1所述的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的一种控制油菜菌核病的基因，其特征在于，该基因在控制油菜菌核病 中的应用。
【文档编号】A01H5/00GK103911384SQ201410026575
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2014年1月21日
【发明者】王政, 方和娣, 谭小力, 陈克平, 张志燕, 陈宇, 李冠英, 顾守来 申请人:江苏大学