一种血管瘤动物模型的建系方法
【专利摘要】本发明涉及一种血管瘤动物模型的建系方法，包括：(1)血管内皮细胞特异表达的PyMT基因质粒的构建；(2)将上述构建好的质粒经PvuI酶切线性化，然后显微注射到小鼠受精卵中；(3)将出生的小鼠进行PCR鉴定，得到鉴定结果为阳性的转基因小鼠；所述的转基因小鼠出现血管瘤样表型；(4)将上述转基因小鼠作为培育转基因动物品系基础种群的首建鼠建立血管瘤动物模型。本发明中目的基因PyMT仅表达于血管内皮细胞中，避免了其在其他组织中诱导发生恶性肿瘤，模型动物表型专一，显示典型的血管瘤样改变；明显改善了PyMT基因的胚胎毒性，产生的阳性首建鼠的数量明显高于传统方法，可以稳定传代、建系，子代鼠也均有血管瘤表型。
【专利说明】一种血管瘤动物模型的建系方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于心血管疾病的研究领域，特别涉及一种血管瘤动物模型的建系方法。
【背景技术】
[0002] 良性先天性血管肿瘤是婴幼儿的常见疾病。新生儿的发病率为1?2%，1岁左右 发病率上升至12%，而在体重低于1000g的早产儿中，发病率可高达23%。为了突破血管 瘤研究瓶颈，更有效地认识血管瘤的发生、发展规律，建立一个理想的血管瘤动物模型是当 务之急。
[0003] 血管瘤的动物模型最早采用的是鸡冠模型，但是其组织发生和结构与血管瘤有 着巨大差异，这一模型已被淘汰。目前，国内、外学者普遍接受的血管瘤动物模型的建立 方法主要有2种：①通过接种血管瘤组织或内皮细胞，使动物产生与来源细胞生物学性 状接近的血管瘤模型。虽然这种方法操作简便，成功率高，但是产生的动物模型仅模拟了 血管瘤的局部疾病状态，无法在机体整体水平反映疾病发展过程中的系统生物网络变化 规律，并且其产生的血管瘤与疾病的自然发生过程也存在较大的差异。②通过病毒感染、 转基因技术将某些基因导入动物基因组，产生血管瘤表型。Williams最早采用多瘤病毒 MiddleT(Polyomavirus Middle T，PyMT)基因建立了转基因血管瘤小鼠模型，诱发的动物 模型在出生后2周左右出现血管瘤样表型，与自然发生的血管瘤极为相似。但是，采用PyMT 转基因方法建立血管瘤小鼠模型存在2个明显缺陷：（l)PyMT转基因后不仅引起血管瘤的 发生，也会诱发动物产生多种其他恶性肿瘤，导致模型的专一性差，降低其在血管瘤研究中 的价值。（2)PyMT基因具有胚胎致死性，转基因阳性动物的出生率极低，且动物生殖力低下， 造成难以获得足够数量的模型动物由于后续研究。这些问题的发生是因为PyMT基因在不 同的组织中表达可以造成不同的病理变化，例如，在血管内皮中表达造成血管瘤表型，在乳 腺组织中表达可以导致乳腺癌的发生，胚胎组织广泛表达PyMT基因造成严重的胚胎毒性， 生殖细胞表达该基因造成小鼠生殖能力低下。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种血管瘤动物模型的建系方法，该方法制作 的血管瘤动物模型的目的基因 PyMT仅表达于血管内皮细胞中，避免了其在其他组织中诱 导发生恶性肿瘤，模型动物表型专一,显示典型的血管瘤样改变。
[0005] 本发明的一种血管瘤动物模型的建系方法，包括：
[0006] (1)血管内皮细胞特异表达的PyMT基因质粒的构建；
[0007] 所述质粒中包含血管内皮细胞特异表达的启动子Tie2、真核生物转录所需Kozak 序列、PyMT基因全序列、SV40 polyA信号和Tie2增强子序列；
[0008] (2)将上述构建好的质粒经Pvul酶切线性化，回收7. Okb的DNA片段；然后将上 述DNA片段注射到受精卵的雄原核中，再移植到0. 5天假孕鼠的输卵管中，得小鼠；
[0009] (3)将出生的小鼠进行PCR鉴定，得到鉴定结果为阳性的转基因小鼠；所述的转基 因小鼠出现血管瘤样表型；
[0010] (4)将上述转基因小鼠作为培育转基因动物品系基础种群的首建鼠建立血管瘤动 物模型。
[0011] 步骤（1)中所述的血管内皮细胞特异表达的PyMT基因质粒构建的具体操作方法 为：实验小鼠为C57BL/6J转基因小鼠，由上海南方模式生物科技发展有限公司提供和繁 育，小鼠基因组的制备：取出生10天左右新生鼠的鼠尾0. 3cm，加450μ 1裂解液及50μ 1蛋 白酶K(10mg/ml)，56°C消化过夜；离心取上清，无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤，稍晾干后溶 解于200 μ 1纯水中；
[0012] 以鼠尾DNA为模板，分别PCR扩增Tie2启动子，Tie2增强子，以pPymt为模板PCR 扩增PyMT基因全长，以pGL3-Basic为模板扩增A ;PCR体系为：模板DNA : 1 μ 1，5xPCR缓冲 液：4 μ 1，三磷酸脱氧核糖核苷：1 μ 1，PCR引物混合物：2 μ 1，PCR聚合酶：0. 2 μ 1，双蒸水： 11·8μ 1 ;反应程序为：95°C 3 分钟，98°C 15 秒，55°C -68°C 15 秒，72°C 90 秒，72°C 5 分钟， 35个循环；用ΚρηΙ和Sail酶切Tie2启动子序列，Xhol和Nhel酶切PyMT基因序列，Xbal 和Clal酶切载体连接片段序列，Clal和Sail酶切Tie2增强子，依次连接到pGL3-Basic载 体上；
[0013] 上述构建用引物如下：
[0014] Tie2 启动子上游引物 catggtaccgcggaagcttactaagatctaatgaaaatc ;
[0015] Tie2 启动子下游引物 catgtcgacTTCAACAACTCACAACTTTGCG ;
[0016] Pymt 上游引物 catctcgagagcctcaccaccatcATGGATAGAGTTCTGAGCAGAG ;
[0017] Pymt 下游引物 catgctagcCTAGAAATGCCGGGAACG ;
[0018] 载体连接片段上游引物GTGTAATTCTAGAGTCGGGGC ;
[0019] 载体连接片段下游引物 CGACGGATCCTTATCGATTTTACC ;
[0020] Tie2 增强子上游引物 catatcgatctcgaggtccagtatggcttc ;
[0021] Tie2 增强子下游引物 catgtcgacgtaccattattgttttacttgggagg。
[0022] 步骤⑴中所述的血管内皮细胞特异表达的启动子Tie2的序列为：
[0023] AAGCTTACTAAGATCTAATGAAAATCAAGATGTTAGGCACAGTGCCAGATACTTTAACATAGTAATATG ACTCTTTAGAGTTTTGAGACAGGGCCTCATATAGTTTATGATGAATTCACTGTTTTGTCAAAGATGACCTTGAACTC TTAATCCATTCCCAAAGTGTTGTTGTCATATGTTTGCACCACTCCTGGCTTCATAGTGTTTTTAAAACACCCATGGA GAGTCGGGTGTGAAGATCCACACGTCTAACCTCAGCATCTGGTGAATCAAGGCAGGAGGGCGGGTGGTTGCAGGCTG GCTATAATATCTAAGTTTCAGTTAGTAAGGGCTGCATAATGAAACACTGTCTTAAACACAAAACCAAAACCCATGAA GGAGATACTATTGCCATTTAAAAGTCTCTGGAATGGAAATAGCTATCATAATCTTACCTCTGAGCCAGTGTCTGCCC TCAGGTGTGCCTGAGGACTGAACAGGGCTATGCACTCCTCAGGTTGGAAACATTACTAGTCCTCAGTGTCTGCTCTT GACCTGTTAACAGCTGAGTCAGGGTCTGCCCTCAGCTGTGCCTGAGGACAGAGCTGAGCTATCTACCCCTGCAGATT GGAAGCATTACAGGCACTCAAGATCAGCCCTGAAGTGATAAAACCTAAGGCAGAAATCCACCAAGACTAGCAGTGCC TCCGTGTCTCTTCCTGTGGCTGGTGGGAAAGGGAGGGGCAGTCCTTCCTTGATGCAAGGTCGTGTGTCTAGTGGCAT GCTTGCTTCATTCCCAGTGAGAGCAAGTGATCACCTGGGTAAGGAAGGTTCAGGTGCCTGAGCTTGCTGGAGAATTC ATCACTCATCCATCACTCTGCTCCTGTAGACATAATCACTTCTGTTGGGTCTTTATAGAGATGATTTATAACTTTGT TGTTTATAGTTTTTATGAATGTGTGTATTCATTTAGGTCACATGGGAGGTGCACATTTTCAGGTGTCTGTCTTTCCA TCACACGGGCTTTGAATTAAACTCAGTCTTGGTTTTACCGGCTGAGCCATCTCACCTGCCTGATTATTTAAAAATCT CCGGAGTAATCCAAGAGTGTGGTTTATGATTGTAGTATCAACACTCGGGAGGCTGAGGGAGCATCGTTATCATGAGC TCCAGGCTAGTTCCAGGCTTGCCTAAGCTGTAGAGCAAGTCACTCTCTTAAAAAGTGCCTCTCCCATATTTTTGTAT ATAATTTGCATCTGAAATTCTGTTTGCCAATAACTATGAAATTATTCACATTACTAAAATCTTCCTGTGCCAAGTTC TCCAACGAATTAGATCACACTCAGATGAAATGCTAATAAAAATTAAAGCTGTAGCCAGTAGCATGCGTATATTTGGG CTCAGGGCCAACAGGCAGGCGATCTGGGTGTAAGAAAATAGGCTAATGGCTGTGGAATCTGGTCTCTAGTGGCTCCG CTGAGAGCTGACCTCAACCACGCTCCCTCAAATTGATTGCCTTCCAGGTTATGATTTCTCATCACAGGAAACTTTGT TGCCCAATTCAAACCCTGTGAGTGAAAACAAAAACAGGAGAGCAAGTGCTGCTCCCCGTGCCCCAAAGCCCCTTCTG TCAGGGATCCCAAATGCACCCCAGAGAACAGCTTAGCCTGCAAGGGCTGGTCCTCATCGCATACCATACATAGGTGG AGGGCTTGTTATTCAATTCCTGGCCTATGAGAGGATACCCCTATTGTTCCTGAAAATGCTGACCAGGACCTTACTTG TAACAAAGATCCCTCTGCCCCACAATCCAGTTAAGGCAGGAGCAGGAGCCGGAGCAGGAGCAGAAGATAAGCCTTGG ATGAAGGGCAAGATGGATAGGGCTCGCTCTGCCCCAAGCCCTGCTGATACCAAGTGCCTTTAAGATACAGCCTTTCC CATCCTAATCTGCAAAGGAAACAGGAAAAAGGAACTTAACCCTCCCTGTGCTCAGACAGAAATGAGACTGTTACCGC CTGCTTCTGTGGTGTTTCTCCTTGCCGCCAACTTGTAAACAAGAGCGAGTGGACCATGCGAGCGGGAAGTCGCAAAG TTGTGAGTTGTTGAA。
[0024] 步骤⑴中所述的真核生物转录所需Kozak的序列为：
[0025] AGCCTCACCACCATC。
[0026] 步骤（1)中所述的PyMT基因的全序列为：
[0027] ATGGATAGAGTTCTGAGCAGAGCTGACAAAGAAAGGCTGCTAGAACTTCTAAAACT
[0028] TCCCAGACAACTATGGGGGGATTTTGGAAGAATGCAGCAGGCATATAAGCAGCAGT
[0029] CACTGCTACTGCACCCAGACAAAGGTGGAAGCCATGCCTTAATGCAGGAATTGAAC
[0030] AGTCTCTGGGGAACATTTAAAACTGAAGTATACAATCTGAGAATGAATCTAGGAGGAACCGGCTTCCAG GTAAGAAGGCTACATGCGGATGGGTGGAATCTAAGTACCAAAGACACCTTTGGTGATAGATACTACCAGCGGTTCTG CAGAATGCCTCTTACCTGCCTAGTAAATGTTAAATACAGCTCATGTAGTTGTATATTATGCCTGCTTAGAAAGCAAC ATAGAGAGCTCAAAGACAAATGTGATGCCAGGTGCCTAGTACTTGGAGAATGTTTTTGTCTTGAATGTTACATGCAA TGGTTTGGAACACCAACCCGAGATGTGCTGAACCTGTATGCAGACTTCATTGCAAGCATGCCTATAGACTGGCTGGA CCTGGATGTGCACAGCGTGTATAATCCAAAACGGCGGAGCGAGGAACTGAGGAGAGCGGCCACAGTCCACTACACGA TGACTACTGGTCATTCAGCTATGGAAGCAAGTACTTCACAAGGGAATGGAATGATTTCTTCAGAAAGTGGGACCCCA GCTACCAGTCGCCGCCTAAGACTGCCGAGTCTTCTGAGCAACCCGACCTATTCTGTTATGAGGAGCCACTCCTATCC CCCAACCCGAGTTCTCCAACAGATACACCCGCACATACTGCTGGAAGAAGACGAAATCCTTGTGTTGCTGAGCCCGA TGACAGCATATCCCCGGACCCCCCCAGAACTCCTGTATCCAGAAAGCGACCAAGACCAGCTGGAGCCACTGGAGGAG GAGGAGGAGGAGTACATGCCAATGGAGGATCTGTATTTGGACATCCTACCGGGGGAACAAGTACCCCAGCTCATCCC CCCCCCTATCATTCCCAGGGCGGGTCTGAGTCCATGGGAGGGTCTGATTCTTCGGGATTTGCAGAGGGCTCATTTCG ATCCGATCCTAGATGCGAGTCAGAGAATGAGAGCTACTCACAGAGCTGCTCTCAGAGCTCATTCAATGCAACGCCAC CTAAGAAGGCTAGGGAGGACCCTGCTCCTAGTGACTTTCCTAGCAGCCTTACTGGGTATTTGTCTCATGCTATTTAT TCTAATAAAACGTTCCCGGCATTTCTAG。
[0031] 步骤⑴中所述的Tie2增强子的序列为：
[0032] CTCGAGGTCCAGTATGGCTTCTCAACCTTCTTGGCAAGAAGGCTGCAGGGACGACCAGGAAGTTTGAAA CAGTCTTAGAAGAAAATGCTGGCTTAGAGACAGGTGGCAATGGGGGATGGGGAGCAGTATTCTGGTTTGCATAGAGG CAGAGTCCTTCCAAGTGCTGGGAAACAAGGCAGGAGGGCAGGGATAGAGCAAATGATGGCTCTGTATGTGTCCCTGT TCAGTTTGCATTTAATCTGAGCAAAATTTGGCTTTTGACATCTGCAACTCAAAAGAAGGTAATTAGGCAAATGACTG ACACATAGATATCTTAATAGTCAAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAGAGTTAGCAGTCAGGGGATGGTAGA AACTGCAAAACCAATCCGTATTCTTTCTTGAGATTTTTAGACAGTTGATGCTACTAGCCACAAAAAGAGTTTTAAGT GGGAGGAGAGTAAGATGCAGGCACCAAGGTGACAGGCTCCAGGTCTGTAGCATTAGCTTACAGATGAGATTCTTTAC AGAGAGCCAGGCAGCTGCATTGGCTAAAGCAGATCTGGGAGGGGGCCAGGAGATCAGCTGGCGGCACTCCCAGCCTC CAGGAAAGGCAACCCTTATTTCTGGAATTTTAAACTGATAACCCAATTCCCACCAGCCTGGCCAGGCTCTTCCTTAG CTCACATCACAAACACAGAAGGATTGTTTTAGATGGAGTCATGCTTGATTCTTTCTATACCTACTTCCAAGACCAAT TTTATAAAAGTTTATTTACCGCCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCATGGTATATATGGACGTCAGAGTT TGGTTCTCTCCTTCTGCAGTGTGGCTCTTAGAGATTGAACTCAGATCATGAGCAAGCACCTTGCTGCCTGCTATGTC CCTCCAGCAGTCTGACCATGTTCCTTCCCCCAAGATTGTGGAAGCTGGACTGAAGATCACAATCTGCCAGATGGGCA GAATCTTTACTCTTTGGCACATTTGTTGCTGATGGGGAGTGAATACCCATGGGGACATGGCTGTCATGGTGTGGAAG TGATAGAAATGAAAACATGTATGGATCTGTCACAGGAGCTGGTGAGGCTGATGGGTGTGTGGGTGGCCACTGTTTGC TCTCTGCTTGTCACAGCCTCTTGTTCAGGGCTTGATCAGGGAGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGGTCACACCCATCT CAGCAGATCTGTCAGCTTTCCCGCTTTTGTTAGAGGGTGATATCATGCTTCCTGGGGGGAGCTCTGGAAGACAATGA GCAGCCACTTTCCTCTAGATACAATAGGCGGAGTCAGGAAGGTAGTATTGACATTGCTGGGGCCTAGGAGCTACTCA CTGCTCGGTGGCCGTCAGATGGTGAACCGGCGTAACCTTGGCACACAGGCCTGGGCTGTACAAGGCGTCTGGCTGCA GGGCCAAAGAGGACTCCACCCTAGGGACAGGAGTACTTCAGACATCTGGGAATCTGGGATGGGTTTTAAAATTCAGA TCCCAATATAAAAAAACAACTCCCAAACAAACAGCAGCAATTAAAAAAAAAAAAAAAACCAGCCTCCCAAGTAAAAC AATAATGGTAC。
[0033] 步骤（3)中所述的PCR鉴定的具体操作为：取鼠尾0.3cm，加450 μ 1裂解液及 10mg/ml的蛋白酶Κ50μ 1，56°C消化过夜；离心取上清，无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤，稍晾 干后溶解于200μ 1纯水中；Pymt上设计引物Midct2和Midcl，反应条件为：95°C 3min变性 后，95°C 30s，60°C 30s，65°C 3min进行35个循环后，65°C lOmin，阳性小鼠应扩增出260bp 片段；
[0034] 小鼠基因型鉴定用引物：
[0035] 鉴定上游引物 GAACAAGTACCCCAGCTCATCCCCCCCCCTATCATTC ;
[0036] 鉴定下游引物 CTAGAAATGCCGGGAACG。
[0037] 步骤（3)中所述的血管瘤样表型的主要表达部位为小鼠的耳、舌、皮肤、黏膜、肝 等部位。
[0038] 步骤（4)中所述的建立血管瘤动物模型的具体操作为：将上述转基因小鼠作为培 育转基因动物品系基础种群的首建鼠，与同一种系的正常小鼠交配，得到F1代子鼠；将上 述F1代子鼠与同一种系的正常小鼠交配，得到F2代子鼠。
[0039] 本发明采用血管内皮细胞表达的组织特异性启动子Tie2,控制目的基因 PyMT在 转基因动物体内的表达仅限于血管内皮部位。该种方法制作的血管瘤动物模型，由于目的 基因 PyMT仅表达于血管内皮细胞中，避免了其在其他组织中诱导发生恶性肿瘤，模型动物 表型专一，显示典型的血管瘤样改变；同时，由于限制了 PyMT基因在胚胎中的表达范围和 水平，明显改善了 PyMT基因的胚胎毒性，该方法产生的阳性首建鼠（Founder鼠）的数量明 显高于传统方法；并且，控制PyMT基因在血管内皮细胞特异性表达避免了目的基因对于小 鼠生殖能力的影响，小鼠繁殖能力较传统方法增加，可以稳定传代、建系，且子代鼠也均有 血管瘤表型。
[0040] 本发明建立的血管瘤转基因鼠模型动物可以稳定传代并且子代基因型阳性动物 也可出现血管瘤样新生物表型。动物平均生存时间（5. 5个月）较无启动子控制的PyMT转 基因动物（0.5个月）明显增加。但是，阳性动物的生殖能力较普通野生型小鼠低，影响小 鼠的建系。这可能是由于转基因对于动物生殖细胞的影响。
[0041] 有益效果：
[0042] (1)本发明中目的基因 PyMT仅表达于血管内皮细胞中，避免了其在其他组织中诱 导发生恶性肿瘤，模型动物表型专一,显示典型的血管瘤样改变；
[0043] (2)由于限制了 PyMT基因在胚胎中的表达范围和水平，明显改善了 PyMT基因的胚 胎毒性，该方法产生的阳性首建鼠（Founder鼠）的数量明显高于传统方法；
[0044] (3)控制PyMT基因在血管内皮细胞特异性表达避免了目的基因对于小鼠生殖能 力的影响，小鼠繁殖能力较传统方法增加，可以稳定传代、建系，且子代鼠也均有血管瘤表 型。
【专利附图】
【附图说明】
[0045] 图1血管内皮细胞特异表达的pGL3_PyMT基因质粒的构建。
[0046] 图2转基因动物大体表型，箭头指示在耳及掌心等皮肤部位存在血管瘤样新生 物。
[0047] 图3转基因动物血管瘤发生部位的表型、组织学变化及PyMT基因表达情况。
[0048] 图4Tie2启动子驱动的PyMT转基因血管瘤动物建系情况。
[0049] 图5代表性的F1及F2小鼠表型，箭头所指为鼠耳血管瘤样新生物。
【具体实施方式】
[0050] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0051] 实施例1
[0052] (1)血管内皮细胞特异表达的PyMT基因质粒的构建（如图1)。
[0053] PyMT基因质粒构建方法
[0054] a.材料
[0055] 质粒与菌株：质粒pGL3_Basic购自Promega公司。D-H5 α为天根产品。pPymt购 自 ATCC。
[0056] 试剂：各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、T4DNA polymerase、Taq酶及PCR相关试 剂购自Takara及NEB公司；胶回收Kit购自天根生物公司；质粒抽提Kit购于Qiagen公 司；
[0057] 小鼠：C57BL/6J小鼠以及转基因小鼠由上海南方模式生物科技发展有限公司提 供和繁育，所有动物实验均遵循NIH制定的关于动物饲养和使用的规定，并得到上海南方 模式生物研究中心动物饲养和使用管理委员会的批准。
[0058] 引物：由上海英俊生物公司合成 [0059] 构建用引物：
[0060] Tie2 启动子上游引物 catggtaccgcggaagcttactaagatctaatgaaaatc
[0061] Tie2 启动子下游引物 catgtcgacTTCAACAACTCACAACTTTGCG
[0062] Pymt 上游引物 catctcgagagcctcaccaccatcATGGATAGAGTTCT
[0063] GAGCAGAG
[0064] Pymt 下游引物 catgctagcCTAGAAATGCCGGGAACG
[0065] 载体连接片段上游引物 GTGTAATTCTAGAGTCGGGGC
[0066] 载体连接片段下游引物 CGACGGATCCTTATCGATTTTACC
[0067] Tie2 增强子上游引物 catatcgatctcgaggtccagtatggcttc
[0068] Tie2 增强子下游引物 catgtcgacgtaccattattgttttacttgggagg
[0069] b.方法：转基因质粒的构建：以鼠尾DNA为模板，分别PCR扩增Tie2启动子 (2086bp)，Tie2 增强子（1620bp)，以 pPymt 为模板 PCR 扩增 PyMT 基因全长（1266bp)，以 pGL3-Basic 为模板扩增 A (260bp)。PCR 体系为：模板 DNA : 1 μ 1，5*PrimeSTAR buffer : 4 μ 1, dNTP ： 1 μ 1, Primer mix ：2μ 1, PrimeSTAR HS DNA Polymerase ：0.2 μ 1, dH20 ： 11. 8μ 1。反应程序为：95 °C 3min，98 °C 15sec，55 °C -68 °C 15sec，72 °C lmin30sec， 72°C 5min，35个循环。用Kpnl和Sail酶切Tie2启动子序列，Xhol和Nhel酶切PyMT基 因序列，Xbal和Clal酶切载体连接片段序列，Clal和Sail酶切Tie2增强子，依次连接到 pGL3-Basic载体上。通过酶切及测序验证最终载体。
[0070] c.结果：Pymt，TIE2 promotor，TIE2 enhancer 基因克隆到 pGL3 载体中，经酶切 和序列分析证实，各组成元件正确，且阅读框正确。转基因质粒结构见图1。
[0071] 该质粒包含血管内皮细胞特异表达的启动子Tie2,真核生物转录所需Kozak序 列），PyMT基因全序列见上，SV40polyA信号（质粒自带），Tie2增强子序列。
[0072] (2)转基因小鼠的制备：以Pvul酶切（Takara公司，大连）转上述基因质粒，回收 7. Okb的DNA片段用于显微注射。取5-6周龄C57BL/6J雌鼠超排后与性成熟的C57BL/6J 雄鼠交配，挑选见栓鼠取受精卵，培养在M16培养液中，纯化后的质粒DNA溶解在TE缓冲液 中，浓度为5ng/ μ 1，以M2为体外操作液，将DNA注射到受精卵的雄原核中，注射后的受精卵 移植到0. 5天假孕鼠的输卵管，每只假孕鼠输卵管单侧移卵约25枚。
[0073] 小鼠基因组的制备：移植后的假孕鼠饲养于SPF级动物房，待仔鼠出生10天左右 剪取鼠尾0. 3cm，加45〇μ 1裂解液及5〇μ 1蛋白酶K(10mg/ml)，56°C消化过夜。离心取上 清，无水乙醇沉淀，70 %乙醇洗涤，稍晾干后溶解于200 μ 1纯水中。
[0074] PCR鉴定转基因阳性鼠：Pymt上设计引物Midct2和Midcl，反应条件为：95°C 3min 变性后，95°C 30s，60°C 30s，65°C 3min进行35个循环后，65°C 10min，阳性小鼠应扩增出 260bp片段
[0075] 小鼠基因型鉴定用引物：
[0076] 鉴定上游引物 GAACAAGTACCCCAGCTCATCCCCCCCCC
[0077] TATCATTC
[0078] 鉴定下游引物 CTAGAAATGCCGGGAACG
[0079] 转基因动物显微注射及出生情况：采用C57BL/6品系小鼠（中科院上海实验动物 中心）作为转基因模型动物。注射受精卵440枚，出生转基因动物82只，其中基因型鉴定 为阳性的转基因首建鼠7只，动物出生率（出生动物数/注射受精卵数）18. 6 %，转基因的 总效率（阳性子代动物/注射受精卵总数）为1. 6%。与无启动子控制的PyMT转基因动物 比较，采用Tie2启动子控制目的基因表达的策略，其动物出生率增加3. 9倍，转基因动物的 总效率增加2. 7倍（之前报道，无启动子控制的PyMT转基因动物出生率为4. 8%，转基因 总效率为〇· 5%，Transgenic Res (2009) 18:399 - 406)。该结果表明，采用启动子调控表达 的PyMT基因，其胚胎致死性及胚胎毒性较无启动子控制的基因明显下降，从而有助于获得 更多的阳性动物。
[0080] (3)转基因动物的表型：出生小鼠基因型经PCR鉴定证实阳性的7只转基因小鼠， 均出现血管瘤样表型（图2)。新生物主要表达部位在小鼠的耳、舌、皮肤、黏膜、肝等部位， 组织学检查证实为血管瘤样改变，免疫组织化学方法鉴定证实新生物的内皮细胞部位表达 PyMT蛋白（图3)。证实，采用Tie2启动子控制策略不会妨碍转基因动物发生血管瘤表型。
[0081] (4)转基因动物的存活及建系：利用基因型鉴定为阳性的7只转基因首建鼠作为 培育转基因动物品系的基础种群。将首建鼠与同一种系的C57BL/6正常小鼠交配，得到F1 代子鼠，鼠尾DNA制备及基因型鉴定，证实并建立3个品系的阳性F1代小鼠，3个品系的F1 代小鼠与同一种系正常小鼠交配，经基因型鉴定，得到F2代子鼠（图4)，F1代与F2代小鼠 表型与首建鼠相似，在皮肤、黏膜部位可见血管瘤样新生物（图5)。证实采用本策略的转基 因方法获得的动物表型可以稳定传代。
【权利要求】
1. 一种血管瘤动物模型的建系方法，包括： (1)血管内皮细胞特异表达的PyMT基因质粒的构建； 所述质粒中包含血管内皮细胞特异表达的启动子Tie2、真核生物转录所需Kozak序 列、PyMT基因全序列、SV40polyA信号和Tie2增强子序列； ⑵将上述构建好的质粒经Pvul酶切线性化，回收7. Okb的DNA片段；然后将上述DNA 片段注射到受精卵的雄原核中，再移植到0. 5天假孕鼠的输卵管中，得小鼠； (3) 将出生的小鼠进行PCR鉴定，得到鉴定结果为阳性的转基因小鼠；所述的转基因小 鼠出现血管瘤样表型； (4) 将上述转基因小鼠作为培育转基因动物品系基础种群的首建鼠建立血管瘤动物模 型。
2. 根据权利要求1所述的血管瘤动物模型的建系方法，其特征在于：步骤（1)中所述 的血管内皮细胞特异表达的PyMT基因质粒构建的具体操作方法为： 以鼠尾DNA为模板，分别PCR扩增Tie2启动子，Tie2增强子，以pPymt为模板PCR扩 增PyMT基因全长，以pGL3-Basic为模板扩增A ;PCR体系为：模板DNA :1 μ 1，5xPCR缓冲 液：4 μ 1，三磷酸脱氧核糖核苷：1 μ 1，PCR引物混合物：2 μ 1，PCR聚合酶：0. 2 μ 1，双蒸水： 11·8μ 1 ;反应程序为：95°C 3 分钟，98°C 15 秒，55°C -68°C 15 秒，72°C 90 秒，72°C 5 分钟， 35个循环；用ΚρηΙ和Sail酶切Tie2启动子序列，Xhol和Nhel酶切PyMT基因序列，Xbal 和Clal酶切载体连接片段序列，Clal和Sail酶切Tie2增强子，依次连接到pGL3-Basic载 体上； 上述构建用引物如下： Tie2 弓 catggtaccgcggaagcttactaagatctaatgaaaatc ； Tie2 启动子下游引物 catgtcgacTTCAACAACTCACAACTTTGCG ; Pymt 上游引物 catctcgagagcctcaccaccatcATGGATAGAGTTCTGAGCAGAG ; Pymt 下游引物 catgctagcCTAGAAATGCCGGGAACG ; 载体连接片段上游引物GTGTAATTCTAGAGTCGGGGC ; 载体连接片段下游引物CGACGGATCCTTATCGATTTTACC ; Tie2 增强子上游引物 catatcgatctcgaggtccagtatggcttc ; Tie2 增强子下游引物 catgtcgacgtaccattattgttttacttgggagg。
3. 根据权利要求2所述的血管瘤动物模型的建系方法，其特征在于：所述鼠尾DNA的 制备如下：取出生10天的C57BL/6J小鼠鼠尾0. 3cm，加 450 μ 1裂解液及10mg/ml的50 μ 1 蛋白酶Κ，56°C消化过夜；离心取上清液，无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤，稍晾干后溶解于 200 μ 1纯水中，即可。
4. 根据权利要求1所述的血管瘤动物模型的建系方法，其特征在于：步骤（1)中所述 的血管内皮细胞特异表达的启动子Tie2的序列为： AAGCTTACTAAGATCTAATGAAAATCAAGATGTTAGGCACAGTGCCAGATACTTTAACATAGTAATATGACT CTTTAGAGTTTTGAGACAGGGCCTCATATAGTTTATGATGAATTCACTGTTTTGTCAAAGATGACCTTGAACTCTTA ATCCATTCCCAAAGTGTTGTTGTCATATGTTTGCACCACTCCTGGCTTCATAGTGTTTTTAAAACACCCATGGAGAG TCGGGTGTGAAGATCCACACGTCTAACCTCAGCATCTGGTGAATCAAGGCAGGAGGGCGGGTGGTTGCAGGCTGGCT ATAATATCTAAGTTTCAGTTAGTAAGGGCTGCATAATGAAACACTGTCTTAAACACAAAACCAAAACCCATGAAGGA GATACTATTGCCATTTAAAAGTCTCTGGAATGGAAATAGCTATCATAATCTTACCTCTGAGCCAGTGTCTGCCCTCA GGTGTGCCTGAGGACTGAACAGGGCTATGCACTCCTCAGGTTGGAAACATTACTAGTCCTCAGTGTCTGCTCTTGAC CTGTTAACAGCTGAGTCAGGGTCTGCCCTCAGCTGTGCCTGAGGACAGAGCTGAGCTATCTACCCCTGCAGATTGGA AGCATTACAGGCACTCAAGATCAGCCCTGAAGTGATAAAACCTAAGGCAGAAATCCACCAAGACTAGCAGTGCCTCC GTGTCTCTTCCTGTGGCTGGTGGGAAAGGGAGGGGCAGTCCTTCCTTGATGCAAGGTCGTGTGTCTAGTGGCATGCT TGCTTCATTCCCAGTGAGAGCAAGTGATCACCTGGGTAAGGAAGGTTCAGGTGCCTGAGCTTGCTGGAGAATTCATC ACTCATCCATCACTCTGCTCCTGTAGACATAATCACTTCTGTTGGGTCTTTATAGAGATGATTTATAACTTTGTTGT TTATAGTTTTTATGAATGTGTGTATTCATTTAGGTCACATGGGAGGTGCACATTTTCAGGTGTCTGTCTTTCCATCA CACGGGCTTTGAATTAAACTCAGTCTTGGTTTTACCGGCTGAGCCATCTCACCTGCCTGATTATTTAAAAATCTCCG GAGTAATCCAAGAGTGTGGTTTATGATTGTAGTATCAACACTCGGGAGGCTGAGGGAGCATCGTTATCATGAGCTCC AGGCTAGTTCCAGGCTTGCCTAAGCTGTAGAGCAAGTCACTCTCTTAAAAAGTGCCTCTCCCATATTTTTGTATATA ATTTGCATCTGAAATTCTGTTTGCCAATAACTATGAAATTATTCACATTACTAAAATCTTCCTGTGCCAAGTTCTCC AACGAATTAGATCACACTCAGATGAAATGCTAATAAAAATTAAAGCTGTAGCCAGTAGCATGCGTATATTTGGGCTC AGGGCCAACAGGCAGGCGATCTGGGTGTAAGAAAATAGGCTAATGGCTGTGGAATCTGGTCTCTAGTGGCTCCGCTG AGAGCTGACCTCAACCACGCTCCCTCAAATTGATTGCCTTCCAGGTTATGATTTCTCATCACAGGAAACTTTGTTGC CCAATTCAAACCCTGTGAGTGAAAACAAAAACAGGAGAGCAAGTGCTGCTCCCCGTGCCCCAAAGCCCCTTCTGTCA GGGATCCCAAATGCACCCCAGAGAACAGCTTAGCCTGCAAGGGCTGGTCCTCATCGCATACCATACATAGGTGGAGG GCTTGTTATTCAATTCCTGGCCTATGAGAGGATACCCCTATTGTTCCTGAAAATGCTGACCAGGACCTTACTTGTAA CAAAGATCCCTCTGCCCCACAATCCAGTTAAGGCAGGAGCAGGAGCCGGAGCAGGAGCAGAAGATAAGCCTTGGATG AAGGGCAAGATGGATAGGGCTCGCTCTGCCCCAAGCCCTGCTGATACCAAGTGCCTTTAAGATACAGCCTTTCCCAT CCTAATCTGCAAAGGAAACAGGAAAAAGGAACTTAACCCTCCCTGTGCTCAGACAGAAATGAGACTGTTACCGCCTG CTTCTGTGGTGTTTCTCCTTGCCGCCAACTTGTAAACAAGAGCGAGTGGACCATGCGAGCGGGAAGTCGCAAAGTTG TGAGTTGTTGAA。
5.根据权利要求1所述的血管瘤动物模型的建系方法，其特征在于：步骤（1)中所述 的真核生物转录所需Kozak的序列为：AGCCTCACCACCATC ; 步骤（1)中所述的PyMT基因的全序列为： ATGGATAGAGTTCTGAGCAGAGCTGACAAAGAAAGGCTGCTAGAACTTCTAAAACTTCCCAGACAACTATGG GGGGATTTTGGAAGAATGCAGCAGGCATATAAGCAGCAGTCACTGCTACTGCACCCAGACAAAGGTGGAAGCCATGC CTTAATGCAGGAATTGAACAGTCTCTGGGGAACATTTAAAACTGAAGTATACAATCTGAGAATGAATCTAGGAGGAA CCGGCTTCCAGGTAAGAAGGCTACATGCGGATGGGTGGAATCTAAGTACCAAAGACACCTTTGGTGATAGATACTAC CAGCGGTTCTGCAGAATGCCTCTTACCTGCCTAGTAAATGTTAAATACAGCTCATGTAGTTGTATATTATGCCTGCT TAGAAAGCAACATAGAGAGCTCAAAGACAAATGTGATGCCAGGTGCCTAGTACTTGGAGAATGTTTTTGTCTTGAAT GTTACATGCAATGGTTTGGAACACCAACCCGAGATGTGCTGAACCTGTATGCAGACTTCATTGCAAGCATGCCTATA GACTGGCTGGACCTGGATGTGCACAGCGTGTATAATCCAAAACGGCGGAGCGAGGAACTGAGGAGAGCGGCCACAGT CCACTACACGATGACTACTGGTCATTCAGCTATGGAAGCAAGTACTTCACAAGGGAATGGAATGATTTCTTCAGAAA GTGGGACCCCAGCTACCAGTCGCCGCCTAAGACTGCCGAGTCTTCTGAGCAACCCGACCTATTCTGTTATGAGGAGC CACTCCTATCCCCCAACCCGAGTTCTCCAACAGATACACCCGCACATACTGCTGGAAGAAGACGAAATCCTTGTGTT GCTGAGCCCGATGACAGCATATCCCCGGACCCCCCCAGAACTCCTGTATCCAGAAAGCGACCAAGACCAGCTGGAGC CACTGGAGGAGGAGGAGGAGGAGTACATGCCAATGGAGGATCTGTATTTGGACATCCTACCGGGGGAACAAGTACCC CAGCTCATCCCCCCCCCTATCATTCCCAGGGCGGGTCTGAGTCCATGGGAGGGTCTGATTCTTCGGGATTTGCAGAG GGCTCATTTCGATCCGATCCTAGATGCGAGTCAGAGAATGAGAGCTACTCACAGAGCTGCTCTCAGAGCTCATTCAA TGCAACGCCACCTAAGAAGGCTAGGGAGGACCCTGCTCCTAGTGACTTTCCTAGCAGCCTTACTGGGTATTTGTCTC ATGCTATTTATTCTAATAAAACGTTCCCGGCATTTCTAG。
6. 根据权利要求1所述的血管瘤动物模型的建系方法，其特征在于：步骤（1)中所述 的Tie2增强子的序列为： CTCGAGGTCCAGTATGGCTTCTCAACCTTCTTGGCAAGAAGGCTGCAGGGACGACCAGGAAGTTTGAAACAG TCTTAGAAGAAAATGCTGGCTTAGAGACAGGTGGCAATGGGGGATGGGGAGCAGTATTCTGGTTTGCATAGAGGCAG AGTCCTTCCAAGTGCTGGGAAACAAGGCAGGAGGGCAGGGATAGAGCAAATGATGGCTCTGTATGTGTCCCTGTTCA GTTTGCATTTAATCTGAGCAAAATTTGGCTTTTGACATCTGCAACTCAAAAGAAGGTAATTAGGCAAATGACTGACA CATAGATATCTTAATAGTCAAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAGAGTTAGCAGTCAGGGGATGGTAGAAAC TGCAAAACCAATCCGTATTCTTTCTTGAGATTTTTAGACAGTTGATGCTACTAGCCACAAAAAGAGTTTTAAGTGGG AGGAGAGTAAGATGCAGGCACCAAGGTGACAGGCTCCAGGTCTGTAGCATTAGCTTACAGATGAGATTCTTTACAGA GAGCCAGGCAGCTGCATTGGCTAAAGCAGATCTGGGAGGGGGCCAGGAGATCAGCTGGCGGCACTCCCAGCCTCCAG GAAAGGCAACCCTTATTTCTGGAATTTTAAACTGATAACCCAATTCCCACCAGCCTGGCCAGGCTCTTCCTTAGCTC ACATCACAAACACAGAAGGATTGTTTTAGATGGAGTCATGCTTGATTCTTTCTATACCTACTTCCAAGACCAATTTT ATAAAAGTTTATTTACCGCCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCATGGTATATATGGACGTCAGAGTTTGG TTCTCTCCTTCTGCAGTGTGGCTCTTAGAGATTGAACTCAGATCATGAGCAAGCACCTTGCTGCCTGCTATGTCCCT CCAGCAGTCTGACCATGTTCCTTCCCCCAAGATTGTGGAAGCTGGACTGAAGATCACAATCTGCCAGATGGGCAGAA TCTTTACTCTTTGGCACATTTGTTGCTGATGGGGAGTGAATACCCATGGGGACATGGCTGTCATGGTGTGGAAGTGA TAGAAATGAAAACATGTATGGATCTGTCACAGGAGCTGGTGAGGCTGATGGGTGTGTGGGTGGCCACTGTTTGCTCT CTGCTTGTCACAGCCTCTTGTTCAGGGCTTGATCAGGGAGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGGTCACACCCATCTCAG CAGATCTGTCAGCTTTCCCGCTTTTGTTAGAGGGTGATATCATGCTTCCTGGGGGGAGCTCTGGAAGACAATGAGCA GCCACTTTCCTCTAGATACAATAGGCGGAGTCAGGAAGGTAGTATTGACATTGCTGGGGCCTAGGAGCTACTCACTG CTCGGTGGCCGTCAGATGGTGAACCGGCGTAACCTTGGCACACAGGCCTGGGCTGTACAAGGCGTCTGGCTGCAGGG CCAAAGAGGACTCCACCCTAGGGACAGGAGTACTTCAGACATCTGGGAATCTGGGATGGGTTTTAAAATTCAGATCC CAATATAAAAAAACAACTCCCAAACAAACAGCAGCAATTAAAAAAAAAAAAAAAACCAGCCTCCCAAGTAAAACAAT AATGGTAC。
7. 根据权利要求1所述的血管瘤动物模型的建系方法，其特征在于：步骤（2)中受精 卵的制备方法为：取5-6周龄C57BL/6J雌鼠超排后与性成熟的C57BL/6J雄鼠交配，挑选见 栓鼠取受精卵，培养在M16培养液中。
8. 根据权利要求1所述的血管瘤动物模型的建系方法，其特征在于：步骤（3)中所述 的PCR鉴定的具体操作为：取鼠尾0. 3cm，加450 μ 1裂解液及10mg/ml的蛋白酶K50 μ 1， 56°C消化过夜；离心取上清，无水乙醇沉淀，70 %乙醇洗涤，稍晾干后溶解于200 μ 1纯水 中；Pymt上设计引物Midct2和Midcl，反应条件为：95°C 3min变性后，95°C 30s，60°C 30s， 65°C 3min进行35个循环后，65°C lOmin，阳性小鼠应扩增出260bp片段； 小鼠基因型鉴定用引物： 鉴定上游引物 GAACAAGTACCCCAGCTCATCCCCCCCCCTATCATTC ; 鉴定下游引物 CTAGAAATGCCGGGAACG。
9. 根据权利要求1所述的血管瘤动物模型的建系方法，其特征在于：步骤（3)中所述 的血管瘤样表型的主要表达部位为小鼠的耳、舌、皮肤、黏膜、肝。
10. 根据权利要求1所述的血管瘤动物模型的建系方法，其特征在于：步骤（4)中所述 的建立血管瘤动物模型的具体操作为：将上述转基因小鼠作为培育转基因动物品系基础种 群的首建鼠，与同一种系的正常小鼠交配，得到F1代子鼠；将上述F1代子鼠与同一种系的 正常小鼠交配，得到F2代子鼠。
【文档编号】A01K67/027GK104087615SQ201410315187
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月3日 优先权日:2014年7月3日
【发明者】徐骎, 谢芙蓉, 余婧爽, 陈万涛 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院