具有鳞翅目活性的新苏云金芽孢杆菌基因的制作方法

具有鳞翅目活性的新苏云金芽孢杆菌基因的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有鳞翅目活性的新苏云金芽孢杆菌基因。本发明提供了编码多肽的得自苏云金芽孢杆菌菌株的核酸及其变体和片段，所述多肽具有针对昆虫害虫包括鳞翅目的杀虫活性。本发明的特定实施方案提供了编码杀虫蛋白质的分离的核酸、杀虫组合物、DNA构建体以及包括实施方案的核酸的转化的微生物和植物。这些组合物在用于控制害虫特别是植物害虫的方法中有用。
【专利说明】具有鱗翅目活性的新苏云金芽孢杆菌基因 [0001] 本申请为申请号201080012854. 1的分案申请，要求2009年1月23日的优先权。 发明领域
[0002] 本发明涉及得自新苏云金芽孢杆菌基因的天然存在 和重组的核酸，其编码特征在于针对昆虫害虫的杀虫活性的杀虫多肽。本发明的组合物和 方法利用所公开的核酸，及其编码的杀虫多肽，以控制植物害虫。
[0003] 发明背景 昆虫害虫是世界农作物损失中的主要因素。例如，黏虫摄食、小地老虎损害或玉米螟损 害对于农业生产者可以是经济上破坏性的。来自对单独的田间和甜玉米的玉米螟攻击的昆 虫害虫相关作物损失在损害和控制费用方面已达到每年约10亿美元。
[0004] 传统上，用于影响昆虫害虫群体的主要方法是广谱化学杀昆虫剂的应用。然而，消 费者和政府管理者同样变得越来越关注与合成化学杀虫剂的生产和使用相关的环境危害。 因为此种关注，管理者已禁止或限制一些较危险杀虫剂的使用。因此，存在开发可替代杀虫 剂的重大兴趣。
[0005] 使用微生物试剂例如真菌、细菌或另一个昆虫物种生物学控制具有农业重要性的 昆虫害虫提供了对合成化学杀虫剂的环境友好和商业上有吸引力的替代物。一般来说，生 物杀虫剂的使用呈现了污染和环境危害的较低危险，并且生物杀虫剂提供了比传统广谱化 学杀昆虫剂特有的更大的靶特异性。此外，生物杀虫剂经常生产成本更少，并且因此改善关 于广泛多样作物的经济产量。
[0006] 已知芽孢杆菌属UaciBm)的微生物的特定物种具有针对广泛范围的昆虫 害虫的杀虫活性，所述昆虫害虫包括鳞翅目)、双翅目Outers )、鞘翅 目半翅目等。苏云金芽孢杆菌和日本甲虫芽孢杆菌 (ifeciBiAs papiBiae)在迄今为止发现的最成功的生物控制试剂中。昆虫致病性也已归 因于幼虫类芽孢杆菌C5. 缓病芽孢杆菌C5. 球形芽孢杆菌(汉 (Harwook，编辑（（1989(Plenum Press)，306)、和錯状芽抱杆菌(汉 ceremKWO 96/10083)的菌株。杀虫活性看起来集中于伴孢结晶蛋白质内含物，尽管杀虫 蛋白质已也从芽孢杆菌属的营养生长阶段中分离。编码这些杀虫蛋白质的几种基因已得到 分离和表征(参见例如美国专利号5, 366, 892和5, 840, 868)。
[0007] 微生物杀昆虫剂特别是得自芽孢杆菌属菌株的那些，作为化学害虫控制的替代物 已在农业中起重要作用。近来，通过基因工程改造作物植物以产生来自芽孢杆菌属的杀虫 蛋白质，农业科学家已开发了具有增强的昆虫抗性的作物植物。例如，玉米和棉花植物已 进行基因工程改造，以产生从沒?的菌株中分离的杀虫蛋白质（参见例如，Aronson (2002) Cell Mol. Life Sci.沿 ·Α\?-Α25 办c\me0 等}明、Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3):775-806)。这些基因工程改造的作物目前广泛用于美国农业中，并且已给农民提供 了对传统昆虫控制方法的环境友好的替代物。此外，基因工程改造为包含杀虫Cry毒素的 马铃薯已销售给美国农民。虽然它们已被证明是在经济上非常成功的，但这些基因工程改 造的、昆虫抗性的作物植物仅提供针对狭窄范围的经济上重要的昆虫害虫的抗性。
[0008] 因此，仍需要具有针对昆虫害虫的更广泛范围的杀昆虫活性的新Α?毒素，例如针 对来自鳞翅目的更多种昆虫有活性的毒素。此外，仍需要具有针对多种昆虫害虫的活性的 生物杀虫剂和具有改善的杀昆虫活性的生物杀虫剂。
[0009] 发明概述 提供了用于影响昆虫害虫的组合物和方法。更具体而言，本发明的实施方案涉及利 用编码杀昆虫肽的核苷酸序列影响昆虫的方法，以产生表达实施方案的杀昆虫多肽的转 化的微生物和植物。此种害虫包括农业上重要的昆虫，例如：玉米螟(玉米螟 和西南玉米杆草螟（西南玉米杆草螟CZT/airaea 在一些实 施方案中，核苷酸序列编码对于属于鳞翅目的至少一种昆虫是杀虫的多肽。
[0010] 实施方案提供了核酸及其片段和变体，其编码具有针对昆虫害虫的杀虫活性的多 肽(例如分别编码SEQIDN0:2、4、6、8、10、12或14的SEQIDN0:1、3、5、7、9、11或13)。得 自的实施方案的野生型(例如天然存在的）核苷酸序列编码新杀昆虫肽。实施方案进一 步提供了所公开的核苷酸序列的片段和变体，其编码生物学活性(例如杀昆虫）多肽。
[0011] 实施方案进一步提供了由实施方案的天然存在或修饰的(例如诱变处理或操作 的）核酸编码的分离的杀虫(例如杀昆虫）多肽。在特定例子中，实施方案的杀虫蛋白质包 括全长蛋白质和多肽的片段，其由设计为将特定氨基酸序列引入实施方案的多肽内的诱变 处理的核酸产生。在特定实施方案中，相对于它们衍生自其的天然存在的多肽的活性，多肽 具有增强的杀虫活性。
[0012] 实施方案的核酸还可以用于产生转基因(例如转化的）单子叶或双子叶植物，其特 征在于包括至少一种稳定掺入的核苷酸构建体的基因组，所述核苷酸构建体包括与启动子 可操作地连接的实施方案的编码序列，所述启动子驱动所编码的杀虫多肽的表达。因此，还 提供了转化的植物细胞、植物组织、植物及其种子。
[0013] 在具体实施方案中，可以使用已对于在宿主植物中增加的表达最佳化的核酸产生 转化的植物。例如，实施方案的杀虫多肽之一可以进行反翻译（back-translate)，以产生包 括对于在特定宿主中的表达最佳化的密码子的核酸，例如作物植物例如玉米(玉蜀黍（Zea 植物。由此种转化的植物(例如双子叶植物或单子叶植物）的编码序列的表达将导 致杀虫多肽的产生，且对植物赋予增加的昆虫抗性。一些实施方案提供了表达杀虫多肽的 转基因植物，这在用于影响各种昆虫害虫的方法中有用。
[0014] 实施方案进一步包括包含实施方案的杀昆虫多肽的杀虫或杀昆虫组合物，并且可 以任选包括进一步的杀昆虫肽。实施方案包含此种组合物对昆虫害虫环境的应用，以影响 昆虫害虫。
[0015] 发明详述 本发明的实施方案涉及用于影响昆虫害虫特别是植物害虫的组合物和方法。更具体 而言，实施方案的分离的核酸及其片段和变体包括编码杀虫多肽(例如蛋白质）的核苷酸序 列。所公开的杀虫蛋白质针对昆虫害虫例如但不限于鳞翅目的昆虫害虫是生物学活性的 (例如杀虫的）。目的昆虫害虫包括但不限于：玉米螟(玉米螟)和西 南玉米杆草螟(Afairaea (西南玉米杆草螟)。
[0016] 实施方案的组合物包括分离的核酸及其片段和变体，其编码杀虫多肽，包括实施 方案的核苷酸序列的表达盒，分离的杀虫蛋白质和杀虫组合物。一些实施方案提供了特征 在于相对于相应野生型蛋白质的杀虫活性，针对鳞翅目改善的杀昆虫活性的修饰的杀虫多 肽。实施方案进一步提供了用这些新核酸转化的植物和微生物，和涉及此种核酸、杀虫组合 物、转化的生物及其产物在影响昆虫害虫中的使用的方法。
[0017] 实施方案的核酸和核苷酸序列可以用于转化任何生物，以产生所编码的杀虫蛋白 质。提供了涉及使用此种转化的生物来影响或控制植物害虫的方法。实施方案的核酸和 核苷酸序列还可以用于转化细胞器例如叶绿体（McBride等人（1995)/^0(6^/70/(?^ 13 : 362-365;和 Kota 等人（1999)/￥oc. JcatZ 5bi."说 96:1840-1845)。
[0018] 实施方案进一步涉及天然存在的编码序列的片段和变体的鉴定，其编码生物学活 性的杀虫蛋白质。实施方案的核苷酸序列在用于影响害虫的方法中直接有用，所述害虫特 别是昆虫害虫，例如鳞翅目的害虫。因此，实施方案提供了用于影响昆虫害虫的新方法，其 不依赖于传统的、合成化学杀昆虫剂的使用。实施方案涉及天然存在的、生物可降解的杀虫 剂和编码其的基因的发现。
[0019] 实施方案进一步提供了天然存在的编码序列的片段和变体，其也编码生物学活性 (例如杀虫)多肽。实施方案的核酸包含已对于通过特定生物的细胞表达最佳化的核酸或核 苷酸序列，例如基于具有增强的杀虫活性的多肽的氨基酸序列，已使用植物优选的密码子 反翻译（即反向翻译)的核酸序列。实施方案进一步提供了对实施方案的多肽赋予改善或改 变的性质的突变。参见例如，于2003年6月25日提交的共同未决的美国申请号10/606, 320 和于2003年12月24日提交的10/746, 914。
[0020] 在下文说明书中，广泛使用了许多术语。提供了下述定义以促进实施方案的理解。
[0021] 单位、前缀和符号可以以其SI公认形式表示。除非另有说明，否则分别地，核酸以 5'到3'方向从左往右书写；氨基酸序列以氨基到羧基方向从左往右书写。数字范围包括 限定范围的数字。氨基酸在本文中可以通过其通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生 物化学命名委员会（Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号提及。同 样地，核苷酸可以通过其通常公认的单字母编码提及。上述术语通过参考就整体而言的说 明书更全面地定义。
[0022] 如本文使用的，"核酸"包括提及单或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸 聚合物，并且除非另有说明，否则包含具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物(例如肽核 酸)，因为它们以与天然存在的核苷酸的那种相似的方式与单链核酸杂交。
[0023] 如本文使用的，术语"编码"或"编码的"当在特定核酸背景中使用时，意指核酸包 括指导核苷酸序列翻译成特定蛋白质的必需信息。蛋白质由其编码的信息由密码子的使用 指定。编码蛋白质的核酸可以包括在核酸的翻译区内的非翻译序列(例如内含子)，或可以 缺乏此种间插非翻译序列(例如如在cDNA中）。
[0024] 如本文使用的，关于指定多核苷酸或其编码的蛋白质的"全长序列"意指具有自然 (非合成)、内源序列的完整核酸序列或完整氨基酸序列。全长多核苷酸编码全长、催化活性 形式的指定蛋白质。
[0025] 如本文使用的，在核苷酸序列方向背景中使用的术语"反义"指以反义链被转录的 方向与启动子可操作地连接的双链体多核苷酸序列。反义链与内源转录产物足够互补，从 而使得内源转录产物的翻译经常被抑制。因此，当术语"反义"在特定核苷酸序列背景中使 用时，该术语指参考转录产物的互补链。
[0026] 术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本文中可互换使用，以指氨基酸残基的聚合物。 该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的 氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。
[0027] 术语"残基"或"氨基酸残基"或"氨基酸"在本文中可互换使用，以指掺入蛋白质、 多肽或肽(总起来说"蛋白质"）内的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另 有限定，否则可以包含天然氨基酸的已知类似物，其可以以与天然存在的氨基酸相似的方 式起作用。
[0028] 实施方案的多肽可以由本文公开的核酸或使用标准分子生物学技术产生。例如， 实施方案的蛋白质可以通过实施方案的重组核酸在合适宿主细胞中的表达或可替代地通 过先体外后体内程序的组合产生。
[0029] 如本文使用的，术语"分离的"和"纯化的"可互换使用，以指实质上或基本上不含 这样的组分的核酸或多肽或其生物学活性部分，所述组分正常伴随核酸或多肽或与核酸或 多肽相互作用，如在其天然存在的环境中发现的。因此，分离或纯化的核酸或多肽当通过重 组技术产生时，基本上不含其他细胞材料或培养基，或当化学合成时，基本上不含化学前体 或其他化学试剂。
[0030] "分离的"核酸一般不含在核酸由其衍生的生物的基因组DNA中天然侧接核酸的序 列(例如蛋白质编码序列)(即位于核酸5'和3'末端的序列)。例如，在各种实施方案中，分 离的核酸可以包含小于约5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、l kb、0. 5 kb或0. 1 kb核苷酸序列，其在 核酸由其衍生的细胞的基因组DNA中天然侧接核酸。
[0031] 如本文使用的，当其用于指实施方案的多肽时，术语"分离的"或"纯化的"指分离 的蛋白质基本上不含细胞材料，并且包括具有小于约30%、20%、10%或5% (按干重计)污 染蛋白质的蛋白质制剂。当实施方案的蛋白质或其生物学活性部分重组产生时，培养基相 当于小于约30^^20^^10%或5% (按干重计）化学前体或非目的蛋白质化学试剂。
[0032] 说明书自始至终，单词"包括"或其变形应理解为暗示包括所述元件、整数或步骤， 或元件、整数或步骤组，但不排除任何其他元件、整数或步骤，或元件、整数或步骤组。
[0033] 如本文使用的，术语"影响昆虫害虫"指在任何发育阶段时实现昆虫摄食、生长和 /或行为中的改变，包括但不限于：杀死昆虫；延缓生长；阻止生殖能力；拒食剂活性；等。 [0034] 如本文使用的，术语"杀虫活性"和"杀昆虫活性"同义使用，以指生物或物质(例 如蛋白质）的活性，这可以通过但不限于下述进行测量：在摄食和暴露合适时间长度后的害 虫死亡率、害虫重量减轻、害虫驱性以及害虫的其他行为和身体改变。因此，具有杀虫活性 的生物或物质不利地影响害虫适合度的至少一个可测量参数。例如，"杀虫蛋白质"是自身 或与其他蛋白质组合展示出杀虫活性的蛋白质。
[0035] 如本文使用的，术语"杀虫有效量"意味着当存在于害虫的环境中时，具有杀虫活 性的物质或生物的量。对于每种物质或生物，杀虫有效量对于特定环境中受影响的每种害 虫以经验为根据进行测定。类似地，"杀昆虫有效量"可以用于指当害虫是昆虫害虫时的"杀 虫有效量"。
[0036] 如本文使用的，术语"重组工程改造的"或"工程改造的"意味着利用重组DNA技 术，以引入(例如工程改造）蛋白质结构中的变化，这基于蛋白质作用机制的理解和待引入、 缺失或取代的氨基酸的考虑。
[0037] 如本文使用的，术语"突变型核苷酸序列"或"突变"或"诱变处理的核苷酸序列" 意味着已诱变处理或改变以包含一个或多个核苷酸残基(例如碱基对）的核苷酸序列，所述 核苷酸残基不存在于相应野生型序列中。此种诱变或改变由核酸残基的一个或多个添加、 缺失、或取代或置换组成。当突变通过添加、去除或置换蛋白酶解位点的氨基酸进行时，此 种添加、去除或置换可以在蛋白酶解位点基序内或附近，只要达到突变目的（即只要改变在 位点上的蛋白酶解)。
[0038] 突变型核苷酸序列可以编码显示改善或减少的杀昆虫活性的突变型杀昆虫毒素， 或对包含其的多肽赋予改善或减少的杀昆虫活性的氨基酸序列。如本文使用的，在蛋白质、 多肽或氨基酸序列背景中，术语"突变型"或"突变"指已诱变处理或改变以包含一个或多 个氨基酸残基的序列，所述氨基酸残基不存在于相应野生型序列中。此种诱变或改变由氨 基酸残基的一个或多个添加、缺失、或取代或置换组成。突变型多肽显示改善或减少的杀昆 虫活性，或代表对包含其的多肽赋予改善的杀昆虫活性的氨基酸序列。因此，术语"突变型" 或"突变"指突变型核苷酸序列和编码的氨基酸之一或两者。突变型可以单独或与实施方 案的其他突变型或其他突变型以任何相容组合使用。"突变型多肽"可以相反地显示杀昆虫 活性中的减少。当超过一个突变加入特定核酸或蛋白质时，突变可以同时或顺次加入；如果 顺次，那么突变可以以任何合适次序加入。
[0039] 如本文使用的，术语"改善的杀昆虫活性"或"改善的杀虫活性"指实施方案的杀昆 虫多肽，相对于其相应野生型蛋白质的活性，其具有增强的杀昆虫活性，和/或针对更广泛 范围的昆虫有效的杀昆虫多肽，和/或对于昆虫具有特异性的杀昆虫多肽，所述昆虫对野 生型蛋白质的毒性不易感。改善或增强的杀虫活性的发现要求相对于针对相同昆虫测定的 野生型杀昆虫多肽的杀虫活性，显示针对昆虫靶至少10%的杀虫活性增加，或至少20%、 25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、100%、150%、200%或 300%或更大的杀虫 活性增加。
[0040] 例如，提供了改善的杀虫或杀昆虫活性，其中相对于受野生型Α?毒素影响的昆虫 范围，更广泛或更狭窄范围的昆虫受多肽影响。当需要通用性时，更广泛范围的影响可能 是希望的，而当例如有益昆虫可能以其他方式受毒素的使用或存在影响时，更狭窄范围的 影响可能是希望的。虽然实施方案不受任何特定作用机制的束缚，但改善的杀虫活性也可 以通过多肽的一种或多种特征中的改变提供；例如相对于相应野生型蛋白质的稳定性或寿 命，多肽在昆虫肠中的稳定性或寿命可以得到增加。
[0041] 如本文使用的，术语"毒素"指显示杀虫活性或杀昆虫活性或改善的杀虫活性或改 善的杀昆虫活性的多肽。"Α?"或"苏云金芽孢杆菌"毒素意欲包括在各种Α?菌株中发现的 更广泛类别的Cry毒素，这包括此种毒素如例如或
[0042] 术语"蛋白酶解位点"或"切割位点"指这样的氨基酸序列，其赋予对于一类蛋白 酶或特定蛋白酶的敏感性，从而使得包含氨基酸序列的多肽由该类蛋白酶或特定蛋白酶消 化。蛋白酶解位点被说成对于识别该位点的一种或多种蛋白酶是"敏感的"。本领域认识到 消化效率将变化，并且消化效率中的减少可以导致多肽在昆虫肠中的稳定性或寿命中的增 力口。因此，蛋白酶解位点可以赋予对于超过一种蛋白酶或一类蛋白酶的敏感性，但在那个位 点由各种蛋白酶的消化效率可以不同。蛋白酶解位点包括例如胰蛋白酶位点、胰凝乳蛋白 酶位点和弹性蛋白酶位点。
[0043] 研究已显示鳞翅目的昆虫肠蛋白酶包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。 参災鄭\如，Lenz 等）Arch. Insect Biochem. Physiol. 16:201-212;和 Hedegus 等人（2003)Arch. /aseci 人 53 :30_47。例如，约 18 种不同膜蛋白酶已 在棉铃虫C/fe/ic〇K6?/77a a/wigera)幼虫中肠中发现(参见Gatehouse等人（1997)/aseci Biochem. Mol. Biol. 27 :929_944)。这些蛋白酶的优选蛋白酶解底物位点已得到研究。 参见例如，Peterson 等人（1995)/as(9ci #〇乂 人 25:765-774。
[0044] 已做出努力以理解毒素的作用机制并且工程改造具有改善性质的毒素。已显 示昆虫肠蛋白酶可以影响价Cry蛋白质对昆虫的影响。一些蛋白酶通过将Cry蛋白质从 "毒素原"形式加工成毒性形式或"毒素"而将其激活。参见Oppert (1999)JrcA Biochem. Phys. 42 :1-12 ;和 Carroll 等人（1997)7； 70 : 41-49。毒素的这种激活可以包括从蛋白质中去除N和C末端肽，并且还可以包括蛋白质的 内部切割。其他蛋白酶可以降解Cry蛋白质。参见Oppert，同上。
[0045] 具有不同特异性的Cry毒素的氨基酸序列比较揭示5个高度保守的序列区段 (block)。在结构上，毒素包括3个独特结构域，其从N到C末端是：牵涉于孔形成的7 α 螺旋簇(被称为"结构域1")、牵涉于细胞结合的3个反平行β折叠(被称为"结构域2")、 和β夹心(被称为"结构域3")。这些结构域的位置和性质是本领域技术人员已知的。参 见例如，Li 等人（1991 305:815-821 和 Morse 等人（2001) Stracitfre，9:409-417。 当提及特定结构域例如结构域1时，应当理解就特定序列而言的结构域的确切终点并不关 键，只要序列或其部分包括提供归因于特定结构域的至少一些功能的序列。因此，例如当提 及"结构域1"时，意指特定序列包括7 α螺旋簇，但就该簇而言使用或提及的序列的确切终 点并不关键。本领域技术人员熟悉此种终点的测定和此种功能的评价。
[0046] 在更佳表征且改善毒素的努力中，研究了细菌的菌株。发现由Α?菌株培养 物制备的晶体制剂具有针对玉米螟的杀虫活性(参见例如实验实施例1)。采取努力以鉴定 编码来自所选菌株的晶体蛋白质的核苷酸序列，并且从这些细菌菌株中分离实施方案的野 生型（即天然存在的）核酸，克隆到表达载体内，并且转化到大肠杆菌(万cWi)内。依赖于 给定制剂的特征，认识到杀虫活性的证实有时需要胰蛋白酶预处理，以激活杀虫蛋白质。因 此，应当理解一些杀虫蛋白质需要蛋白酶消化(例如通过胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等）用于 激活，而其他蛋白质在不存在激活的情况下是生物学活性的(例如杀虫的)。
[0047] 此种分子可以通过例如于2003年6月25日提交的美国申请号10/606, 320和于 2003年12月24日提交的10/746, 914中所述的方法加以改变。此外，核酸序列可以工程改 造为编码包含另外突变的多肽，相对于天然存在的多肽的杀虫活性，所述另外突变赋予改 善或改变的杀虫活性。此种工程改造的核酸的核苷酸序列包括在野生型序列中未发现的突 变。
[0048] 实施方案的突变型多肽一般通过包括下述步骤的方法进行制备：获得编码家 族多肽的核酸序列；基于靶结构域在毒素作用方式中的提议功能的考虑，分析多肽的结构 以鉴定基础基因序列用于诱变的特定"靶"位点；将一个或多个突变引入核酸序列中，以产 生所编码多肽序列的一个或多个氨基酸残基中的所需改变；并且就杀虫活性测定产生的多 肽。
[0049] 许多Bt杀昆虫毒素通过其氨基酸序列和三级结构中的相似性相关至各种程度， 并且用于获得Α?毒素的晶体结构的方法是众所周知的。和多肽的示例性高分 辨率晶体结构解决在参考文献中可获得。基因的解决的结构（Li等人（1991>Vai?r e 353:815-821) 了解了毒素的结构和功能之间的关系。Α?毒素所公开的结构分析和与特定 结构、基序等相关的报道的功能的组合考虑指出毒素的特定区域与蛋白质作用方式的特定 功能和分立的步骤相关。例如，从Α?中分离的许多毒素一般描述为包括3个结构域：与孔 形成有关的7螺旋束、已牵涉于受体结合的3折叠结构域、和β夹心基序（Li等人（1991) Nature 305 :815-821)〇
[0050] 如美国专利号7, 105, 332和于2003年12月24日提交的未决的美国申请号 10/746, 914中报道的，Cry蛋白质的毒性可以通过靶向位于毒素结构域1的α螺旋3和 4之间的区域得到改善。这个理论的前提为关于杀昆虫毒素的大量知识，包括：1)已报道 毒素结构域1的α螺旋4和5插入衬在易感昆虫中肠里的细胞的脂双层内（Gazit 等人（1998)/￥oc. 乂 JcatZ 95 :12289-12294);2)本发明人对胰蛋白酶和胰 凝乳蛋白酶切割位点在野生型蛋白质的氨基酸序列内的位置的了解；3)在通过胰蛋白酶和 胰凝乳蛋白酶处理的体外激活后，野生型蛋白质针对特定昆虫更有活性的观察；和4)毒素 从3'末端消化导致对于昆虫的毒性减少的报道。
[0051] 可以产生一系列突变且将其置于多种背景序列中，以产生具有增强或改变的杀虫 活性的新多肽。参见例如，于2003年6月25日提交、现在放弃的美国申请号10/606, 320 ; 和于2003年12月24日提交的10/746, 914。这些突变包括但不限于：在位于结构域1的螺 旋3和4之间的区域中至少一个更加蛋白酶敏感的位点(例如胰蛋白酶切割位点）的添加； 野生型序列中的原始蛋白酶敏感位点由不同蛋白酶敏感位点的置换；在特定位置中多个蛋 白酶敏感位点的添加；接近一个或多个蛋白酶敏感位点的氨基酸残基的添加，以改变多肽 的折叠且因此增强多肽在一个或多个蛋白酶敏感位点的消化；和添加突变以保护多肽不受 减少毒性的降解性消化(例如制备一系列突变，其中野生型氨基酸由缬氨酸置换，以保护多 肽不受消化)。突变可以单独或以任何组合使用，以提供实施方案的多肽。
[0052] 以这种方式，实施方案提供了包括多种突变的序列，例如包括定位于所编码多肽 结构域1的α螺旋3和4之间的另外或可替代蛋白酶敏感位点的突变。其为另外或可替 代蛋白酶敏感位点的突变可以对几类蛋白酶或酶例如弹性蛋白酶敏感，所述几类蛋白酶例 如丝氨酸蛋白酶，其包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。因此，其为另外或可替代蛋白酶敏感位 点的突变可以这样设计，从而使得位点容易由一类蛋白酶识别和/或切割，所述蛋白酶例 如哺乳动物蛋白酶或昆虫蛋白酶。蛋白酶敏感位点还可以设计为由已知在生物中产生的特 定类别的酶或特定酶切割，例如由谷实夜蛾故zea产生的胰凝乳蛋白酶（Lenz等 人（1991)ArcA /aseci 人 16:201-212)。突变还可以赋予对于蛋白酶 解消化的抗性，例如对于在肽的C末端通过胰凝乳蛋白酶的消化。
[0053] 在所编码多肽的氨基酸序列中的另外和/或可替代蛋白酶敏感位点的存在可以 改善由实施方案的核酸编码的多肽的杀虫活性和/或特异性。因此，实施方案的核苷酸序 列可以进行重组工程改造或操作，以产生与未修饰的野生型毒素的那种相比较，具有改善 或改变的杀昆虫活性和/或特异性的多肽。此外，本文公开的突变可以置于其他核苷酸 序列中或与其他核苷酸序列结合使用，以提供改善的性质。例如，通过昆虫胰凝乳蛋白酶 例如在宿带夜蛾或谷实夜蛾中发现的胰凝乳蛋白酶（Hegedus等人（2003)ArcA Biochem. Physiol ·沿.AWLervL 等）\XV^Y)ArcL· Insect Biochem. Physiol. V6 ·. 201-212)容易切割的蛋白酶敏感位点，可以置于βτ背景序列中，以提供对于那个序列改 善的毒性。以这种方式，实施方案提供了具有改善的性质的毒性多肽。
[0054] 例如，诱变处理的βτ核苷酸序列可以包括另外突变体，其包括将第二个胰蛋白 酶敏感的氨基酸序列（除天然存在的胰蛋白酶位点外)引入所编码多肽内的另外密码子。实 施方案的可替代添加突变体包括设计为将至少一个另外不同的蛋白酶敏感位点引入多肽 内的另外密码子，例如紧接地位于天然存在的胰蛋白酶位点5'或3'的胰凝乳蛋白酶敏感 位点。可替代地，可以产生取代突变体，其中破坏编码天然存在的蛋白酶敏感位点的核酸的 至少一个密码子，并且将可替代密码子引入核酸序列内，以提供不同(例如取代）蛋白酶敏 感位点。置换突变体也可以添加到序列中，其中破坏存在于所编码多肽中的天然存在 的胰蛋白酶切割位点，并且在其位置中引入胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶切割位点。
[0055] 认识到可以使用编码其为蛋白酶解位点或推定的蛋白酶解位点的氨基酸序列（例 如序列如NGSR、RR或LKM)的任何核苷酸序列，并且用于将这些切割位点中的任何一种引入 变体多肽内的密码子的确切特性可以依赖于用途即在特定植物物种中的表达而改变。还认 识到所公开突变中的任何一种可以引入实施方案的任何多核苷酸序列内，其包括关于氨基 酸残基的密码子，所述氨基酸残基提供靶向用于修饰的自然胰蛋白酶切割位点。因此，全长 毒素或其片段的变体可以进行修饰，以包含另外或可替代切割位点，并且这些实施方案预 期由本文公开的实施方案的范围包含。
[0056] 本领域技术人员将认识到任何有用突变可以添加到实施方案的序列中，只要所编 码多肽保留杀虫活性。因此，序列还可以这样进行突变，从而使得所编码多肽对通过胰凝乳 蛋白酶的蛋白酶解消化是抗性的。超过一个识别位点可以以任何组合添加到特定位置中， 并且多个识别位点可以添加到毒素中或从毒素中去除。因此，另外突变可以包括3、4个或 更多个识别位点。应认识到多个突变可以在任何合适多核苷酸序列中进行工程改造；因此， 全长序列或其片段可以进行修饰，以包含另外或可替代切割位点，以及对于蛋白酶解消化 是抗性的。以这种方式，实施方案提供了包含改善杀虫活性的突变的毒素，以及使用其 他沒?毒素用于影响害虫的改善的组合物和方法。
[0057] 突变可以保护多肽不受蛋白酶降解，例如通过去除来自不同区域的推定的蛋白酶 解位点，例如推定的丝氨酸蛋白酶位点和弹性蛋白酶识别位点。此种推定的位点中的一些 或所有可以这样去除或改变，从而使得减少在原始位点的位置的蛋白酶解。通过比较突变 型多肽与野生型毒素、或通过比较在其氨基酸序列中不同的突变型毒素，可以评估蛋白酶 解中的变化。推定的蛋白酶解位点和蛋白酶解位点包括但不限于下述序列：RR，胰蛋白酶切 割位点；LKM，胰凝乳蛋白酶位点；和NGSR，胰蛋白酶位点。这些位点可以通过任何数目和种 类的氨基酸残基的添加或缺失加以改变，只要多肽的杀虫活性得到增加。因此，相对于自然 或背景序列，由包括突变的核苷酸序列编码的多肽将包括至少一个氨基酸改变或添加，或 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、32、35、38、40、45、47、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、 200、210、220、230、240、250、260、270或280个或更多个氨基酸改变或添加。多肽的杀虫活 性还可以通过自然或全长序列的平截加以改善，如本领域已知的。
[0058] 实施方案的组合物包括编码杀虫多肽的核酸、及其片段和变体。特别地，实施方案 提供了分离的核酸分子，其包括编码例如SEQ ID N0 :2中所示的氨基酸序列的核苷酸序列， 或编码所述氨基酸序列的核苷酸序列，例如SEQ ID N0 :1中所示的核苷酸序列，及其片段和 变体。
[0059] 使人感兴趣的是编码实施方案的杀虫蛋白质的最佳化的核苷酸序列。如本文使 用的，短语"最佳化的核苷酸序列"指对于在特定生物例如植物中的表达最佳化的核酸。最 佳化的核苷酸序列可以使用本领域已知的方法对于任何目的生物进行制备。参见例如，于 2003年6月25日提交、现在放弃的美国申请号10/606, 320,和于2003年12月24日提交 的10/746, 914,其描述了编码所公开的杀虫蛋白质的最佳化的核苷酸序列。在这个例子中， 核苷酸序列通过反向翻译蛋白质的氨基酸序列且改变核苷酸序列进行制备，以便包括玉蜀 黍优选的密码子，同时仍编码相同氨基酸序列。这个程序由Murray等人（1989) 17:477-498更详细地描述。最佳化的核苷酸序列在增加杀虫蛋白质在植物中 的表达中有用，所述植物例如禾本科（Gramineae)(禾本科（Poaceae))的单子叶植物，例如 玉蜀黍或玉米植物。
[0060] 实施方案进一步提供了由实施方案的天然存在或修饰的核酸编码的分离的杀虫 (例如杀昆虫）多肽。更具体而言，实施方案提供了包括SEQ ID N0 :2中所示的氨基酸序列 的多肽，和由本文描述的核酸编码的多肽，例如SEQ ID N0 :1中所示的那些，及其片段和变 体，例如编码 SEQ ID N0s:4、6、8、10、12 和 14 中所示的肽的 SEQ ID N0s:3、5、7、9、ll 或 13 中所示的变体。
[0061] 在特定实施方案中，实施方案的杀虫蛋白质提供了全长杀昆虫多肽、全长杀昆虫 多肽的片段、和通过设计为将特定氨基酸序列引入实施方案的多肽内的诱变处理的核酸产 生的变体多肽。在特定实施方案中，引入多肽内的氨基酸序列包括提供了关于酶例如蛋白 酶的切割位点的序列。
[0062] 本领域已知Α?毒素的杀虫活性一般通过肽在昆虫肠中由各种蛋白酶的切割得到 激活。因为肽可能不总是以完全效率在昆虫肠中切割，所以与全长毒素自身相比较，全长毒 素的片段可以具有增强的杀虫活性。因此，实施方案的一些多肽包括全长杀昆虫多肽的片 段，并且相对于它们由其衍生的天然存在的杀昆虫多肽的活性，一些多肽片段、变体和突变 将具有增强的杀虫活性，特别是如果在就活性筛选前天然存在的杀昆虫多肽在体外不由蛋 白酶激活的话。因此，本申请包含序列的截短形式或片段。
[0063] 突变可以置于任何背景序列内，包括此种截短的多肽，只要多肽保留杀虫活性。使 用本领域已知或本文其他地方描述的测定，本领域技术人员可以关于杀虫活性容易地比较 2种或更多种蛋白质。应当理解实施方案的多肽可以通过本文公开的核酸的表达或通过使 用标准分子生物学技术产生。
[0064] 认识到杀虫蛋白质可以是寡聚的，并且将在分子量、残基数目、组分肽、针对特定 害虫的活性和其他特征方面不同。然而，通过本文阐述的方法，可以分离且表征针对多种害 虫有活性的蛋白质。实施方案的杀虫蛋白质可以与其他毒素或其他杀昆虫蛋白质组合 使用，以增加昆虫靶范围。此外，实施方案的杀虫蛋白质与具有不同性质的其他Α?毒素或 其他杀昆虫原理组合使用对于昆虫抗性的预防和/或管理具有特定效用。其他杀昆虫试剂 包括蛋白酶抑制剂(丝氨酸和半胱氨酸类型)、α -淀粉酶和过氧化物酶。
[0065] 核苷酸和由其编码的氨基酸序列及多肽的片段和变体也由实施方案包含。如本文 使用的，术语"片段"指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的部分或多肽的氨基酸序列的部 分。核苷酸序列的片段可以编码保留自然或相应全长蛋白质的生物学活性且因此具有杀虫 活性的蛋白质片段。因此，认识到实施方案的一些多核苷酸和氨基酸序列可以被正确地称 为片段和突变体。
[0066] 应当理解术语"片段"当其用于指实施方案的核酸序列时，还包含作为杂交探针有 用的序列。这类核苷酸序列一般不编码保留生物学活性的片段蛋白质。因此，核苷酸序列 的片段可以范围为至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸、和最高达编码实 施方案的蛋白质的全长核苷酸序列。
[0067] 编码实施方案的杀虫蛋白质的生物学活性部分的实施方案的核苷酸序列片段将 编码至少 15、25、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1，000、1，100 或 1，200 个 邻接氨基酸，或最高达实施方案的杀虫多肽中存在的氨基酸总数目（例如对于SEQ ID N0: 2的1218个氨基酸)。因此，应当理解实施方案还包含这样的多肽，其为实施方案的示例性 杀虫蛋白质的片段，且具有至少 15、25、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、 1，000、1，100或1，200个邻接氨基酸，或最高达实施方案的杀虫多肽中存在的氨基酸总数 目（例如对于SEQ ID N0 :2的1218个氨基酸）的长度。作为杂交探针或PCR引物有用的 实施方案的核苷酸序列片段一般无需编码杀虫蛋白质的生物学活性部分。因此，实施方案 的核酸片段可以编码杀虫蛋白质的生物学活性部分，或它可以是可使用本文公开的方法用 作杂交探针或PCR引物的片段。杀虫蛋白质的生物学活性部分可以通过下述进行制备：分 离实施方案的核苷酸序列之一的部分，表达杀虫蛋白质的编码部分(例如通过体外重组表 达)，且评估杀虫蛋白质的编码部分的活性。
[0068] 其为实施方案的核苷酸序列片段的核酸包括至少16、20、50、75、100、150、200、 250、300、350、400、450、500、600、700、800、1，000、1，200、1，400、1，600、1，800 或 2,000 个 核苷酸，或最高达本文公开的核苷酸序列中存在的核苷酸数目（例如对于SEQ ID N0 :1的 3656个核苷酸)。特定实施方案预想了衍生自（例如由其产生）实施方案的第一种核酸的 片段，其中所述片段编码特征在于杀虫活性的截短的毒素。由实施方案的多核苷酸片段编 码的截短多肽特征在于，相对于通过片段由其衍生的第一种核酸编码的相应全长多肽的活 性，等价或改善的杀虫活性。预想实施方案的此种核酸片段可以在自然或相应全长编码序 列的3'末端上截短。核酸片段还可以在自然或相应全长编码序列的5'和3'末端上截短。 [0069] 术语"变体"在本文中用于指基本上相似的序列。对于核苷酸序列，保守变体包括 由于遗传密码的简并性，编码实施方案的杀虫多肽之一的氨基酸序列的那些序列。天然存 在的等位基因变体例如这些可以借助于众所周知的分子生物学技术进行鉴定，例如如本文 概述的聚合酶链反应（PCR)和杂交技术。
[0070] 变体核苷酸序列还包括合成衍生的核苷酸序列，例如通过使用位点定向诱变生 成，但仍编码实施方案的杀虫蛋白质，例如突变型毒素的那些。一般地，实施方案的特定核 苷酸序列的变体将与那种特定核苷酸序列具有至少约70%、75%、80%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多序列同一性， 如通过本文其他地方描述的序列比对程序使用缺省参数测定的。实施方案的核苷酸序列的 变体可以与那种序列相差少至1-15个核苷酸，少至1-10例如6-10,少至5,少至4、3、2或 甚至1个核苷酸。
[0071] 实施方案的特定核苷酸序列的变体（即示例性核苷酸序列）还可以通过比较由变 体核苷酸序列编码的多肽和由参考核苷酸序列编码的多肽之间的百分比序列同一性进行 评价。因此，例如，公开了编码与SEQ ID N0 :2的多肽具有给定百分比序列同一性的多肽的 分离的核酸。在任何2个多肽之间的百分比序列同一性可以使用本文其他地方描述的序列 比对程序使用缺省参数进行计算。当实施方案的任何给定多核苷酸对通过由它们编码的2 个多肽共享的百分比序列同一性比较进行评价时，2个所编码多肽之间的百分比序列同一 性是至少约 40 %、45 %、50 %、55 %、60 %、65 %、70 %，一般至少约 75 %、80 %、85 %，至少约 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%，或至少约98%、99%或更多序列同一性。
[0072] 如本文使用的，术语"变体蛋白质"包含通过下述衍生自自然蛋白质的多肽：对于 自然蛋白质的N末端和/或C末端的一个或多个氨基酸的缺失(所谓的平截）或添加；在自 然蛋白质中的一个或多个位点上的一个或多个氨基酸的缺失或添加；或在自然蛋白质中的 一个或多个位点上的一个或多个氨基酸的取代。因此，术语"变体蛋白质"包含自然蛋白质 的生物学活性片段，其包括足够数目的邻接氨基酸残基，以保留自然蛋白质的生物学活性， 即具有杀虫活性。相对于自然蛋白质，此种杀虫活性可以是不同或改善的，或它可以是未改 变的，只要杀虫活性被保留。
[0073] 由实施方案包含的变体蛋白质是生物学活性的，即它们继续具有自然蛋白质的所 需生物学活性，即如本文描述的杀虫活性。此种变体可以起因于例如遗传多态性或人为操 作。实施方案的自然杀虫蛋白质的生物学活性变体将与自然蛋白质的氨基酸序列具有至少 约 60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96 %、97 %、98 %、99 %或更多序列同一性，如通过本文其他地方描述的序列比对程序 使用缺省参数测定的。实施方案的蛋白质的生物学活性变体可以与那种蛋白质相差少至 1-15个氨基酸残基，少至1-10例如6-10,少至5,少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。
[0074] 实施方案进一步包含用实施方案的至少一种核酸、包括核酸的表达盒、或包括表 达盒的载体转化的微生物。在一些实施方案中，微生物是在植物上繁殖的那种。本发明的 实施方案涉及被囊化的杀虫蛋白质，其包含能够表达实施方案的至少一种杀虫蛋白质的转 化的微生物。
[0075] 实施方案提供了包括实施方案的转化的微生物的杀虫组合物。在此种实施方案 中，转化的微生物一般连同合适载体一起，以杀虫有效量存在于杀虫组合物中。实施方案还 包含杀虫组合物，其包括连同合适的载体一起，以杀昆虫有效量，单独或与实施方案的转化 的生物和/或实施方案的被囊化的杀虫蛋白质组合的实施方案的分离的蛋白质。
[0076] 实施方案进一步提供了通过使用与至少一种其他或"第二种"杀虫蛋白质组合的 实施方案的杀虫蛋白质增加昆虫靶范围的方法。本领域已知的任何杀虫蛋白质都可以在实 施方案的方法中采用。此种杀虫蛋白质包括但不限于Α?毒素、蛋白酶抑制剂、α-淀粉酶 和过氧化物酶。
[0077] 实施方案还包含包括实施方案的至少一种核苷酸序列的转化的或转基因植物。在 一些实施方案中，植物用核苷酸构建体稳定转化，所述核苷酸构建体包括与启动子可操作 地连接的实施方案的至少一种核苷酸序列，所述启动子驱动在植物细胞中的表达。如本文 使用的，术语"转化的植物"和"转基因植物"指在其基因组内包括异源多核苷酸的植物。一 般地，异源多核苷酸在转基因或转化的植物的基因组内稳定整合，从而使得多核苷酸传递 给连续世代。异源多核苷酸可以单独或作为重组表达盒的部分整合到基因组内。
[0078] 应当理解如本文使用的，术语"转基因的"包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、 植物部分或植物，其基因型已通过异源核酸的存在加以改变，包括最初如此改变的那些转 基因生物以及通过有性杂交或无性繁殖由最初转基因生物产生的那些。如本文使用的，术 语"转基因的"不包含通过常规植物育种方法或通过天然存在的事件的基因组改变(染色体 或染色体外的)，所述天然存在的事件例如随机异体受精、非重组病毒感染、非重组细菌转 化、非重组转座或自发突变。
[0079] 如本文使用的，术语"植物"包括全植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物 细胞及其后代。转基因植物的部分在实施方案的范围内，并且包括例如源于先前用实施方 案的DNA分子转化的转基因植物或其后代且因此至少部分由转基因细胞组成的植物细胞、 原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶和根。
[0080] 如本文使用的，术语植物包括植物细胞、植物原生质体、植物可以由其再生的植物 细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块和植物细胞，其在植物或植物的部分中是完整的， 例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、外壳、莖、根、根尖、花药等。可以在 实施方案的方法中使用的植物类别一般与适合于转化技术的高等植物类别一样广泛，包 括单子叶和双子叶植物。此种植物包括例如马铃薯iMerios--)和玉蜀黍(Zea mays ) 〇
[0081] 虽然实施方案不依赖于特定生物学机制用于增加植物对植物害虫的抗性，但实施 方案的核苷酸序列在植物中的表达可以导致实施方案的杀虫蛋白质的产生和植物对植物 害虫的抗性中的增加。实施方案的植物在农业中在用于影响昆虫害虫的方法中有用。特定 实施方案提供了转化的作物植物，例如玉蜀黍植物，其在用于影响植物的昆虫害虫例如玉 米螟的方法中有用。
[0082] "主题植物或植物细胞"是其中已就目的基因而言实现遗传改变例如转化的那种， 或由如此改变的植物或细胞遗传且包括改变的植物或植物细胞。"对照"或"对照植物"或 "对照植物细胞"提供了用于测量主题植物或植物细胞的表型中的改变的参考点。
[0083] 对照植物或植物细胞可以包括例如：（a)野生型植物或细胞，即具有与用于遗传 改变的原材料相同的基因型，所述遗传改变导致主题植物或细胞；（b)具有与原材料相同 的基因型但已用无效构建体（即用对目的性状不具有已知作用的构建体，例如包括标记基 因的构建体)转化的植物或植物细胞；（c)在主题植物或植物细胞的后代中其为非转化分离 子的植物或植物细胞；（d)在遗传上等同于主题植物或植物细胞但不暴露于将诱导目的基 因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或（e)在其中目的基因不表达的条件下的主题植 物或植物细胞本身。
[0084] 本领域技术人员将容易确认在分子生物学领域中的进展例如位点特异性和随机 诱变、聚合酶链反应方法和蛋白质工程改造技术，提供了适合于用于改变或工程改造有农 业价值的蛋白质的氨基酸序列和基础遗传序列的工具和规程的广泛集合。
[0085] 因此，实施方案的蛋白质可以以各种方式加以改变，包括氨基酸取代、缺失、平截 和插入。用于此种操作的方法是本领域一般已知的。例如，杀虫蛋白质的氨基酸序列变体 可以通过将突变引入合成核酸(例如DNA分子）内进行制备。用于诱变和核酸改变的方法 是本领域众所周知的。例如，设计的改变可以使用寡核苷酸介导的位点定向诱变技术引入。 参见例如，Kunkel (1985)/￥oc.他从 Jcat/· 5bi."说 82:488-492 ;Kunkel 等人（1987) ifeiAotfe i/? 154:367-382;美国专利号 4,873, 192 ;Walker 和 Gaastra，编辑 Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company,New York) 和其中引用的参考文献。
[0086] 实施方案的诱变处理的核苷酸序列可以如此修饰，以便改变所编码的多肽的一级 序列中存在的约1、2、3、4、5、6、8、10、12个或更多个氨基酸。可替代地，来自自然序列的 甚至更多改变可以这样引入，从而使得与相应野生型蛋白质相比较，所编码的蛋白质可以 具有至少约 1%或 2%，或约 3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%，或甚至约 13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%、21%、22%、23%、24%或25%、30%、35% 或40%或更多改变或以其他方式修饰的密码子。以相同方式，与相应野生型蛋白质相比较， 所编码的蛋白质可以具有至少约1%或2%，或约3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、 11 %、12 %，或甚至约 13 %、14 %、15 %、16 %、17 %、18 %、19 %或 20 %、21 %、22 %、23 %、 24%或25%、30%、35%或40%或更多另外的密码子。应当理解实施方案的诱变处理的核 苷酸序列意欲包含生物学功能的等价肽，其具有杀虫活性，例如改善的杀虫活性，如通过针 对玉米螟幼虫的拒食剂性质测定的。此种序列可以由于已知在核酸序列和因此编码的蛋白 质内天然存在的密码子冗余和功能等价性而出现。
[0087] 本领域技术人员可认识到氨基酸添加和/或取代一般基于氨基酸侧链取代基的 相对相似性，例如其疏水性、电荷、大小等。考虑各种前述特征的示例性氨基酸取代组是本 领域技术人员众所周知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨 酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
[0088] 关于不影响目的蛋白质的生物学活性的合适氨基酸取代的指导可以在Dayhoff 1978) At las of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington，D.C.)的模型中找到，其引入本文作为参考。可以进行保守取代例如用具有相 似性质的另一个交换一个氨基酸。
[0089] 因此，实施方案的基因和核苷酸序列包括天然存在的序列和突变体形式。同样地， 实施方案的蛋白质包含天然存在的蛋白质和其变异(例如截短的多肽）及修饰(例如突变 体）形式。此种变体将继续具有所需杀虫活性。明显地，在编码变体的核苷酸序列中将进 行的突变必须不将序列置于阅读框外，并且一般不产生将产生二级mRNA结构的互补区。参 见，EP专利申请
【发明者】R. 阿巴德 A., 董华, M. 卡普卡-基茨曼 D., B. 罗 S., 施晓梅 申请人:先锋国际良种公司