一种土木香悬浮细胞的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种土木香悬浮细胞的快速繁殖方法，包括土木香无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞的培养等步骤，本发明方法以土木香叶片为外植体，在不同的激素培养条件下进行离体培养，旨在找出最佳培养基和激素配比，建立土木香悬浮细胞培养体系，为利用悬浮细胞进行选育优良品种奠定基础。
【专利说明】一种土木香悬浮细胞的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种土木香悬浮培养的快繁方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]土木香又称祁木香、青木香,菊科,土木香含阵发油1%?3%,油中主要成分为土木香内酯、异土木香内酯(异土木香内酯有较好的驱蛔虫作用，国外已用于临床)、土木香醇、土木香酸、二氢土木香内酯等，另含达马树脂醇乙脂及菊糖约40%。中医认为土木香的功能主治健脾和胃，调气解郁，止痛安胎，用于胸胁、脘腹作痛，呕吐泻痢，胸胁挫伤，岔气作痛，眙动不安。土木香多野生于山沟、河谷以及田埂边，喜光照强烈的湿润环境。耐涝不耐旱，植株耐寒性较强。在一 15°C左右的低温下也能正常越冬；对土壤要求不高，一般土壤就可以栽种。土木香可以用种子繁殖和分根栽种两种方式进行种植。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种土木香悬浮细胞的快速繁殖方法，由该方法所制备的土木香在不同的激素培养条件下进行离体培养，旨在找出最佳培养基和激素配t匕，建立土木香悬浮细胞培养体系，为利用悬浮细胞进行选育优良品种奠定基础。
[0004]本发明所要解决的技术问题是通过以下方案来实现的:
取土木香幼嫩的叶片，肥皂水中浸泡lOmin，毛刷去除表面污垢，流水冲洗2.5h，在超净工作台上过氧化氢处理16min，流水冲洗6次，吸水纸吸干表面水分，消毒处理过的土木香幼嫩的叶片接入BM+NAA0.2mg/L+KTl.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH5.9，光照强度8001x，光照时间9h/d，温度25°C，诱导出来的愈伤组织放入液体培养基BM+2.5-3.0mg/LTDZ+0.4-0.5mg/L2, 4_D进行液体悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，pH5.9，悬浮细胞培养的条件为接种量为2g，每250mL锥形瓶放入45ml培养基，水平震荡培养，振幅3cm，光照32001x，光照时间13h/d，温度25°C，继代培养2代的悬浮细胞加入5-15mol/L的氯化钠进行悬浮细胞的调控。
[0005]采用本发明制备的悬浮细胞增长率高，周期短，产量大，污染小，利于大规模种植。
[0006]下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0007]实施例1
取土木香幼嫩的叶片，肥皂水中浸泡lOmin，毛刷去除表面污垢，流水冲洗2.5h，在超净工作台上过氧化氢处理16min，流水冲洗6次，吸水纸吸干表面水分，消毒处理过的土木香幼嫩的叶片接入BM+NAA0.2mg/L+KTl.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH5.9，光照强度8001x，光照时间9h/d，温度25°C，诱导出来的愈伤组织放入液体培养基BM +2.5mg/LTDZ+0.4mg/L2, 4_D进行液体悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，pH5.9，悬浮细胞培养的条件为接种量为2g，每250mL锥形瓶放入45ml培养基，水平震荡培养，振幅3cm，光照32001x，光照时间13h/d，温度25°C，继代培养2代的悬浮细胞加入5mol/L的氯化钠进行悬浮细胞的调控，增长率提高65%。
[0008]实施例2
取土木香幼嫩的叶片，肥皂水中浸泡lOmin，毛刷去除表面污垢，流水冲洗2.5h，在超净工作台上过氧化氢处理16min，流水冲洗6次，吸水纸吸干表面水分，消毒处理过的土木香幼嫩的叶片接入BM+NAA0.2mg/L+KTl.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L,琼脂6.5g/L，pH5.9，光照强度8001x，光照时间9h/d，温度25 °C，诱导出来的愈伤组织放入液体培养基BM +3.0mg/LTDZ+0.5mg/L2, 4_D进行液体悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，pH5.9，悬浮细胞培养的条件为接种量为2g,每250mL锥形瓶放入45ml培养基，水平震荡培养，振幅3cm，光照32001x，光照时间13h/d，温度25°C，继代培养2代的悬浮细胞加入15mol/L的氯化钠进行悬浮细胞的调控，增长率提高60%。
[0009]实施例3
取土木香幼嫩的叶片，肥皂水中浸泡lOmin，毛刷去除表面污垢，流水冲洗2.5h，在超净工作台上过氧化氢处理16min，流水冲洗6次，吸水纸吸干表面水分，消毒处理过的土木香幼嫩的叶片接入BM+NAA0.2mg/L+KTl.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L,琼脂6.5g/L，pH5.9，光照强度8001x，光照时间9h/d，温度25 °C，诱导出来的愈伤组织放入液体培养基BM +3.0mg/LTDZ+0.5mg/L2, 4_D进行液体悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，pH5.9，悬浮细胞培养的条件为接种量为2g,每250mL锥形瓶放入45ml培养基，水平震荡培养，振幅3cm，光照32001x，光照时间13h/d，温度25°C，继代培养2代的悬浮细胞加入10mol/L的氯化钠进行悬浮细胞的调控，增长率提高62%。
【权利要求】
1.一种土木香悬浮细胞的快速繁殖方法，包括土木香无菌叶片的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞的培养等，其主要步骤如下: (1)取土木香幼嫩的叶片，进行消毒处理； (2)取步骤(I)消毒处理过的土木香幼嫩的叶片接入BM+NAA0.2mg/L+KTl.0mg/L培养基中进行愈伤组织诱导，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH5.9，光照强度8001x，光照时间9h/d，温度 25 0C ； (3)取步骤(2)诱导出来的愈伤组织放入液体培养基BM+2.5-3.0mg/LTDZ+0.4-0.5mg/L2, 4-D进行液体悬浮细胞培养，附加蔗糖30g/L，pH5.9，光照32001x，光照时间13h/d，温度25 0C ； (4)取步骤(3)继代培养2代的悬浮细胞加入5-15mol/L的氯化钠进行悬浮细胞的调控。
2.按照权利要求1所述的一种土木香悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(O中所述土木香无菌叶片的获得为取土木香幼嫩的叶片，肥皂水中浸泡lOmin，毛刷去除表面污垢，流水冲洗2.5h，在超净工作台上过氧化氢处理16min，流水冲洗6次，吸水纸吸干表面水分。
3.按照权利要求1所述的一种土木香悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(3)中土木香悬浮细胞培养的条件为接种量为2g，每250mL锥形瓶放入45ml培养基，水平震荡培养，振幅3cm。
【文档编号】A01H4/00GK104304012SQ201410540416
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月14日 优先权日:2014年10月14日
【发明者】刘东锋, 杨成东 申请人:南京帝道农业科技有限公司