苏云金芽胞杆菌分泌杀虫基因sip1A,表达蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及“苏云金芽胞杆菌sip1A基因，表达蛋白及其应用”，属于生物防治【技术领域】。杀虫蛋白，具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，及编码该杀虫蛋白的基因，优选所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。上述基因对鞘翅目害虫具有高毒力，以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。CGMCC No964120140905
【专利说明】苏云金芽胞杆菌分泌杀虫基因 sip1A，表达蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物防治【技术领域】，特别是进一步，本发明涉及对鞘翅目农业害虫具 有高毒力的Bt分泌杀虫基因及由该基因所编码的蛋白质。
【背景技术】
[0002] 苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布广泛的革兰 氏阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人 无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种 害虫有活性。Bt在芽胞形成期可形成杀虫晶体蛋白（Insecticidal CrystalProteins, ICPs)，也称δ-内毒素（delta-endotoxin),它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切 关系[Schnepf. E, Crickmore. N, Van Rie. J. , Lereclus. D, Baum. J, Feitelson. J, Zeigler. D.R. , Dean. D. H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystalproteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev, 1998, 62(3) :775-806.]。自 1981 年 Schnepf 等克隆了 Bt 的第 一个ICPs基因，并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列起，目前 (2014年4月）共776个，其中cry基因738个，cry模式基因289个；cyt基因38个，cyt模 式基因11个。当今，采用喷施化学农药防治手段固然可以减轻害虫对农作物的为害，但化 学农药造成环境污染，长期以来，大量喷施化学杀虫剂，不仅会增强害虫的抗药性，使益 虫及其它生态区系遭受破坏，而且严重污染环境，提高生产成本，破坏生态平衡。苏云金 芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、安全、高效等优点而被广泛的应用于虫害防治。苏 云金芽胞杆菌除了直接作为生物农药以外，1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获 准应用，它使用的基因来自Bt crylAc。在接下来的几年里，转crylAb基因的抗虫玉米，转 cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国，自1998年开始正式推广含有crylAc/crylAb 基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年（1996-2007)中， 由于能得到持续稳定的收益，农民种植转基因作物量逐年增加。2013年，27个国家的1800 万农民种植了 1.752亿公顷（4. 33亿英亩）的转基因作物，比2012年持续增长了 3%，即 500万公顷（1200万英亩）。1800万农民从转基因作物中获益，其中90%为资源匮乏的小农 户。前五个种植转基因作物的发展中国家是亚洲的中国和印度、拉丁美洲的巴西和阿根廷 以及非洲的南非，共种植8270万公顷的转基因作物，占全球转基因作物种植面积的47%， 并且这五个国家的人口约占全球70亿人口的41%。中国750万资源匮乏的小农户种植了 420万公顷的Bt棉花，采用率为90%，平均每户农民种植0. 5公顷的Bt棉花。转基因作物 商业化给工业化国家和发展中国家的农民都带来了经济和环境效益。苏云金芽胞杆菌及 其基因发掘已成为可持续发展农业中重要课题。
[0003] 由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，如此大面积推广种 植存在害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基 因组合来避免害虫抗药性上升的风险。因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，可 以丰富杀虫基因资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的 抗虫效果，并且可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要 的经济、社会和生态效益。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种对鞘翅目害虫大猿叶甲高毒力的苏云金芽胞杆菌QZL38,及其杀 虫新基因分泌基因 siplA和其晶体杀虫蛋白，以应用于转化微生物和植物，使之表现出对 相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。
[0005] 苏云金芽胞杆菌菌株QZL38,其保藏编号为：CGMCC No. 9641。
[0006] 苏云金芽胞杆菌菌株QZL38在杀灭鞘翅目农业害虫中的应用。
[0007] 杀虫分泌蛋白SiplA，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0008] siplA基因，编码杀虫蛋白SiplA。
[0009] 优选其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。
[0010] -种表达载体，其特征是含有siplA基因。
[0011] 所述表达载体为pEB-siplA，其骨架载体为pEB，其结构如图6所示；或者所述表达 载体为pET21b-crylCa，其骨架载体为pET21b，其结构如图7所示。
[0012] 一种微生物转化体，其特征是含有siplA基因。
[0013] siplA基因在杀灭大猿叶甲等鞘翅目农业害虫中的应用。
[0014] 所述应用是将siplA基因表达的蛋白作为生物杀虫剂的有效成分。
[0015] 本发明从辽宁千山圆通观附近土壤中分离得到一株苏云金芽胞杆菌菌株QZL38， 其保藏编号为CGMCC No. 9641，该菌株生物学特性为在生长周期中可以产生芽胞，并且同时 产生有毒杀鞘翅目害虫作用的伴胞晶体，其对大猿叶甲具有很强的杀灭能力；从该菌株中 得到一个新基因的阳性克隆，即pEB-sip (见图6)，对其进行测序分析，发现克隆SiplA中含 有1188个碱基，见SEQ ID N01，编码395个氨基酸，见SEQ ID N02。从上述阳性克隆提取 质粒，转入受体菌，得到表达菌株，测定基因的表达蛋白的活性，基因表达的SiplA蛋白对 大猿叶甲的初筛生测结果为校正死亡率为100%，见表1。
[0016] SiplA基因可按生物技术的常规方法转化微生物、植物，表现出对相关翘翅目害虫 的毒性。
[0017] 将上述基因转化菌株，表达得到的蛋白可以制成生物农药用于杀死鞘翅目害虫。 同时，可以转入植物构建抗虫转基因植物，用于害虫的防治。
[0018] 本发明分离克隆的Bt sip基因序列及其基因表达产物能够对鞘翅目大猿叶甲，榆 蓝叶甲害虫产生强毒力，特别是对大猿叶甲有高活性，是很好的生物杀虫基因，有很广泛的 应用前景。通过该sip基因与crylAc、crylAb、crylBa、cry2Ab等基因表达产物组合，可扩 大对鞘翅目害虫的杀虫谱。通过应用于转化微生物和植物，使它们表现出对相关害虫的毒 性，可克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。
[0019] 菌株保藏信息：
[0020] 菌种分类命名：苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringensis)
[0021] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0022] 保藏日期：2014年09月5日
[0023] 保藏编号：CGMCC No. 9641
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1光学显微镜下观察菌株QZL38菌体的形态，
[0025] 图2电镜下菌株QZL38菌体形态，
[0026] 图3含有目的基因的基因组PCR鉴定，
[0027] M:Marker(100、200、500、750、1000、2000、3000、5000bp)
[0028] 图4siplAa基因全长PCR结果，
[0029] M:Marker(100、200、500、750、1000、2000、3000、5000bp)，
[0030] 图5siplAa基因在大肠杆菌中表达蛋白的SDS-PAGE，
[0031] 其中a为pEB-siplA重组质粒的表达，b为pET-siplA重组质粒的表达，
[0032] I :IPTG诱导的pEB-siplA蛋白；2 :IPTG诱导的pEB空载体蛋白；
[0033] 3 :IPTG诱导的pET21b-siplA蛋白；4 :IPTG诱导的pET21b空载体非可溶组分；
[0034] 图6重组载体pEB-sip IA的结构图，
[0035] 图7重组载体pET2 lb-sip IA的结构图。
【具体实施方式】
[0036] 实施例1、分离得到苏云金芽胞杆菌菌株QZL38
[0037] 本 申请人:的实验室工作人员从辽宁省千山土壤中分离的得到一株苏云金芽胞杆 菌，苏云金芽胞杆菌的芽胞由外向内依次为芽胞外壁、芽胞衣、皮层、芽胞内壁，原生质膜和 原生质体。其中皮层的主要成分是肽聚糖，不含营养细胞的多聚糖磷壁酸，它保持着芽胞的 脱水状态和耐热性，另一方面，芽胞形成过程中，会产生大量DPA-Ca鳌合物，使得芽胞中 的生物大分子形成耐热凝胶，在80°C下热处理20min，苏云金芽胞杆菌芽胞也不会死亡并 且休眠的芽胞在75°C的亚致死温度下处理15min，活化效果最好，不但促其快速萌发，还可 提高芽胞的成活率（喻子牛1990)。依据这一特性，可实施温度筛选（Knowles B H，Ellar D J. Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanism of action of Bacillus thuringiensis d-endotoxins with different specificity[J]. Biochimica et biophysica acta，1987, 924:509-518.;戴莲韵，王学聘等.中国八个自然保护区森林土壤 中苏云金芽胞杆的分布[J].微生物学报，1994,30(2) 117-121)。
[0038] 1、1菌株的分离
[0039] 1)取分装的土样加入到50ml大离心管中，至锥形管锥形处。
[0040] 2)加灭菌水至15ml处，放入玻璃珠5?10颗。
[0041] 3)用振荡器将土样打碎。
[0042] 4)放入水浴锅中80°C，20分钟。
[0043] 5)取I. 5ml的EP管，每个管中加 Iml灭菌水，再从50ml管中取10微升菌液加入 到EP管中混匀。
[0044] 6)从EP管中取100微升喷到1/2LB培养基中，涂匀。
[0045] 7)放入到30°C温箱中培养2?3天。
[0046] 8)镜检观察。
[0047] 晶体观察
[0048] 光学显微镜：
[0049] 将胞晶混合液滴于载玻片上，涂抹均匀，烘干固定，石炭酸复红染液染色3min， 清水冲洗，IOOx油镜进行镜检，石炭酸复红染液配制方法参见文献（Baroy F，Lecadet M M, Deleluse A. Cloning and sequencing of three new putative toxin genes from Clostridium bifermentans[J]· Gene, 1998,211:293-295)。见图 I 所示。在 1/2LB 培养基 上培养48h后形成单菌落，光学显微镜下观察到菌株QZL38菌体为长杆状，芽胞为长圆棒 状，晶体为双锥形。
[0050] 电镜显微观察：
[0051] 扫描电镜制样：孢晶混合液滴于玻璃片上，干燥，经锇酸固定，而后经酒精梯度脱 水，临界点干燥，离子溅射喷金（2nm厚），New Bio-TEM H-7500扫描电镜观察拍照。如图2 所示。
[0052] 生物学测定表明，对小菜蛾、甜菜夜蛾的初筛生测结果为校正死亡率为100%。
[0053] 将该菌株保藏，其保藏编号CGMCC No. 9641。
[0054] 实施例2.获得新基因
[0055] 2. 1利用sip类基因通用引物检测菌株QZL38,引物如下
[0056] SP5 GTTGCTCTATAATATGGATTAGCAC
[0057] SP3 CTGGTAAACCAATAAATATGCAAG
[0058]
【权利要求】
1. 苏云金芽胞杆菌菌株QZL38,其保藏编号为：CGMCC No. 9641。
2. 苏云金芽胞杆菌菌株QZL38在杀灭鞘翅目害虫中的应用。
3. 杀虫蛋白SiplAa，其氣基酸序列如SEQ ID NO 2所不。 4. siplAa基因，编码杀虫蛋白SiplAa。
5. 权利要求4所述的siplAa基因，其核苷酸序列如SEQ ID N01所示。
6. -种表达载体，其特征是含有权利要求4或5所述的siplAa基因。
7. 权利要求6所述的表达载体为pEB-siplAa，其骨架载体为pEB，其结构如图6所示； 或者所述表达载体为pET21b-crylCa，其骨架载体为pET21b，其结构如图7所示。
8. -种微生物转化体，其特征是含有权利要求4或5所述的siplAa基因。
9. 权利要求4或5所述的siplAa基因在杀灭大猿叶甲，榆蓝叶甲，金龟子害虫中的应 用。
10. 权利要求9所述应用，是将权利要求4或5所述的siplAa基因表达的蛋白作为生 物杀虫剂的有效成分。
【文档编号】A01P7/04GK104388349SQ201410675353
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月21日 优先权日:2014年11月21日
【发明者】李海涛, 高继国, 刘荣梅, 张金波, 张 杰 申请人:东北农业大学