一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法
【专利摘要】本发明涉及干细胞领域，公开了一种制备干细胞外泌体冻干粉的方法，尤其是一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法。本发明所述制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法，以海藻糖作冷冻保护剂与人羊膜间充质干细胞外泌体混合，滤膜过滤除菌，先经超低温预冻后再在一定真空度下低温冷冻。本发明所述制备方法操作简单、安全有效。实验表明，与常规冻干粉制备方法相比，本发明所述制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法能很好保持人羊膜间充质干细胞外泌体的形态和活性，适用于冻存人羊膜间充质干细胞外泌体的长期保存及应用。
【专利说明】_种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种制备干细胞外泌体冻干粉的方法，尤其是 一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法。
【背景技术】
[0002] 外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中，是细胞主动分泌的大小均 一，直径为40?100nm，密度1. 10?I. 18g/ml的囊泡样小体。外泌体的应用主要集中在临 床诊断及抗肿瘤方面。
[0003] 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs)是具有自我更新和多向分化 能力的细胞，产生并释放营养性物质，通过旁分泌途径促进细胞修复及血管生成，在再生 医学领域有重要作用。Lai等通过质谱技术分析发现：MSCs的外泌体中含有丙酮酸激酶 (pyruvate kinase，PK)人乳脂肪球EGF 因子蛋白（milkfat globule_EGFfactor8protein， MFGE8)及跨膜四蛋白等857种蛋白质，它们参与细胞结构的维持运动信息交流以及组织的 修复与再生。许多的研宄表明MSCs外泌体在治疗组织损伤性疾病中具有重要的作用。人 胎盘羊膜组织中含有丰富的间充质干细胞，所获得的人羊膜间充质干细胞（humanamniotic mesenchymal stem cells, hAMSCs)可以在体外条件下稳定培养，细胞活性强，分泌旺盛，其 细胞培养上清液中含有大量的外泌体。同时，所分泌的外泌体来源单一稳定。
[0004] 目前，常用的提取外泌体的方法有：离心法，免疫磁珠法，过滤离心法，密地梯度离 心法等。但想保持外泌体的活性，提取过程不添加其他来源物质以及操作简便方面考虑，离 心法仍然是最常用的方式。所提纯的外泌体目前主要的储存方式为把悬液冰冻保存（_20°C 到-80°C )
[0005] 现有的技术中，外泌体的来源不稳定，多来源于血液等体液或各种来源的细胞，不 能使产品质量稳定可控。另外，由于外泌体需要冷冻保存，这使其在储存，运输及应用方面 带来了许多不便。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种操作简单、安全有 效，同时又能很好保持外泌体活性的制备外泌体冻干粉方法，用于冻存人羊膜间充质干细 胞外泌体。
[0007] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法，取人羊膜间充质干细胞外泌 体，加入海藻糖混匀后，滤膜过滤，分装后超低温冷冻12h，然后在IOPa的真空度、-50°c的 条件下冷冻12h?48h。
[0009] 在一些实施方案中，所述海藻糖的加入量为至海藻糖终浓度为IOwt%。
[0010] 在一些实施方案中，所述滤膜孔径为〇. 22 μ m。
[0011] 在一些实施方案中，所述超低温为-80°C。
[0012] 在一些实施方案中，所述人羊膜间充质干细胞外泌体的提取方法为在4°C下，人羊 膜间充质干细胞培养上清在300g?IOOOOg的离心力下离心去除培养上清中的细胞及细胞 碎片，收集上清，在IOOOOOg的离心力下离心去除培养基中蛋白质收集沉淀获得人羊膜间 充质干细胞的外泌体。
[0013] 进一步，在一些优选实施方案中，所述人羊膜间充质干细胞外泌体的提取方法具 体包括以下步骤：
[0014] (1)、培养上清300g离心lOmin，收集上清液，弃沉淀；
[0015] (2)、上清液2000g?3000g离心20min?30min，收集上清液，弃沉淀；
[0016] (3)、上清液IOOOOg离心60min?lOOmin，收集上清液，弃沉淀；
[0017] (4)、上清液IOOOOOg离心60min?120min，弃上清，收集沉淀；
[0018] (5)、沉淀加入PBS重悬后，IOOOOOg离心60min?120min弃上清，收集沉淀。
[0019] 在一个具体实施例中，本发明采用原子力显微镜对本发明所述制备方法制备得到 的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体与一直超低温保存后融化的外泌体 进行形态学观察，结果显示采用本发明所述制备方法制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌 体冻干粉复溶后的外泌体与一直超低温保存后融化的外泌体的形态大小相似，没有显著性 差异。
[0020] 在一个具体实施例中，本发明采用CCK-8法检测本发明所述制备方法制备得到的 人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体与一直超低温保存后融化的外泌体增 殖能力，结果显示，本发明所述制备方法制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复 溶后的外泌体与一直超低温保存后融化的外泌体对细胞的增殖均有促进作用，且效果没有 显著性差异。
[0021] 进一步的，在一个具体实施例中，本发明采用免疫印迹法分析本发明所述制备方 法制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体与一直超低温保存后融 化的外泌体CD63及CD9的表达，结果显示本发明所述制备方法制备得到的人羊膜间充质干 细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体仍然为外泌体，有⑶63及⑶9的表达。
[0022] 由此可见，采用本发明所述制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法制备人 羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉能够很好保持外泌体的形态及活性。
[0023] 本发明还提供了所述制备方法制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉。
[0024] 在一个具体实施例中，本发明比较本发明所述制备方法与常规的冻干方法对制备 人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的影响，形态鉴定结果显示添加 i〇wt%海藻糖制备的人 羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体，大小均匀，外泌体的尺寸也没有明显的 改变。而添加10wt%葡萄糖及不添加其他物质制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复 溶后的外泌体体积变大，大小不均匀。活性检测结果显示添加 l〇wt%海藻糖制备的人羊膜 间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体活性明显优于添加 l〇wt%葡萄糖及不添加其 他物质制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体活性。表明本发明所述制 备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法明显优于现有的冻干方法。
[0025] 本发明所述制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法，以海藻糖作冷冻保护 剂与人羊膜间充质干细胞外泌体混合，滤膜过滤除菌，先经超低温预冻后再在一定真空度 下低温冷冻。本发明所述制备方法操作简单、安全有效。实验表明，与常规冻干粉制备方法 相比，本发明所述制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法能很好保持人羊膜间充质 干细胞外泌体的形态和活性，适用于冻存人羊膜间充质干细胞外泌体的长期保存及应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0027] 图1示实施例1用于收集培养上清的细胞状态图，其中a放大倍数为40倍，b放 大倍数为100倍；
[0028] 图2示实施例3用原子力显微镜对人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外 泌体和一直超低温保存后融化的外泌体的形态的检测图，其中a为第一组即人羊膜间充质 干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体的形态图，b为第二组即一直超低温保存后融化的外 泌体的形态图；
[0029] 图3示实施例4外泌体的活性检测结果图，其中 .为第一组即人羊膜间充质干 细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体的结果图，+为第二组即一直超低温保存后融化的外 泌体的结果图， .为对照组即不添加外泌体的培养基培养的结果图；
[0030] 图4示实施例5外泌体⑶63及⑶9的表达结果图；
[0031] 图5示实施例6不同冻干方式制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的 外泌体的形态的检测图，其中a为第一组即添加10wt%海藻糖制备的人羊膜间充质干细胞 外泌体冻干粉复溶后的外泌体的形态图；b为第二组即添加10wt%葡萄糖制备的人羊膜间 充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体的形态图；不添加其他物质制备的人羊膜间充质 干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体的形态图；
[0032] 图6示实施例6不同冻干方式制备的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的 活性检测结果图，其中为第一组即添加 l〇wt%海藻糖制备的人羊膜间充质干细胞外泌 体冻干粉复溶后的外泌体的结果图，+为第二组即添加 i〇wt%葡萄糖制备的人羊膜间充 质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体的结果图， 第三组即不添加其他物质制备的 人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后的外泌体的结果图， 为对照组即不添加外 泌体的培养基培养的结果图。
【具体实施方式】
[0033] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0034] 实施例1、人羊膜间充质干细胞的培养及培养上清的收集
[0035] 1、人羊膜间充质干细胞的培养：
[0036] 取生长良好的人羊膜间充质干细胞，用无血清培养基培养，0.25%胰酶消化传代， 传至P2代，待其生长至融合度80%，去除培养液，用PBS洗三遍，加入1640基础培养基，每 天收集培养上清，并更换新鲜的1640培养基，连续收集培养3到5天后收集培养上清用于 外泌体的提取。其中，用于收集培养上清的细胞状态如图1所示。
[0037] 2、外泌体的提取（提取全过程除特别说明外，均在4°C下进行）：
[0038] (1)、将收集的所有培养上清300g离心lOmin，保留上清液，弃沉淀，去除培养液中 的细胞；
[0039] (2)、上清液2000g?3000g离心20min?30min，保留上清液，弃沉淀，去除细胞碎 片；
[0040] (3)、上清液IOOOOg离心60min?lOOmin，保留上清液，弃沉淀，再次去除细胞碎 片；
[0041] (4)、上清液IOOOOOg离心60min?120min，弃上清，保留沉淀；
[0042] (5)、沉淀加入PBS重悬后，IOOOOOg离心60min?120min弃上清，保留沉淀，去除 培养基中蛋白质，所获即为纯化后的人羊膜间充质干细胞的外泌体，用PBS缓冲液重悬，用 BCA试剂盒测蛋白浓度。然后分成两组，第一组-80°C -直保存，第二组用于制备冻干粉。
[0043] 实施例2、人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的制备：
[0044] 取实施例1纯化后的外泌体，加入海藻糖至终浓度为10%，混匀后，过0. 22 μ m滤 膜，分装后置于超低温冰箱（-80°C ) 12h，然后将样品转移至真空冻干仓冻干，冻干的真空 度保持在10Pa，温度在-50°C冷冻12到48h得到人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉。
[0045] 实施例3、外泌体的形态检测：
[0046] 第一组超低温冰箱（_80°C )保存；第二组（实施例2制备得到的人羊膜间充质干 细胞外泌体冻干粉）室温保存。一月后，第一组融化作检测，第二组用PBS缓冲溶液复溶作 检测。
[0047] 采用原子力显微镜对外泌体进行形态学观察。待检测的外泌体经纯水按一定比例 稀释后，取10 μ L稀释液滴加到新解离的云母表面。静置约30min后，用纯水小心冲洗并 用氮气吹干。原子力显微镜成像采用振幅调制轻敲模式（共振频率为56kHz，弹性系数为 0. 24N/m)。结果见图2。
[0048] 由图2结果可见，实施例2制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉复溶后 的外泌体与一直超低温保存后融化的外泌体的形态大小相似，没有显著性差异。
[0049] 实施例4、外泌体的活性检测：
[0050] 用BCA试剂盒分别检测其浓度，分别将两组的外泌体配置成15 μ g/ml浓度，加入 培养基中，用CCK-8法检测其增殖能力：消化第8代的人羊膜间充质干细胞（此代细胞的增 殖能力减弱，活性降低），以每孔2000个细胞接种于96孔板中，取第ld、3d、5d、7d的细胞作 检测，添加10 μ 1染色剂，培养2h。用酶标仪在450nm处检测OD值，以不添加外泌体的培养 基培养作对照，每组6个重复，取平均值。结果如表1和图3所示。
[0051] 表1活性检测结果
[0052]
【权利要求】
1. 一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法，取人羊膜间充质干细胞外泌 体，加入海藻糖混匀后，滤膜过滤，分装后超低温冷冻12h，然后在lOPa的真空度、-50°C的 条件下冷冻12h?48h。
2. 根据权利要求1所述的方法，所述海藻糖的加入量为至海藻糖终浓度为10wt%。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，所述滤膜孔径为0. 22 y m。
4. 根据权利要求1-3任意一项所述的方法，所述超低温为-80°C。
5. 根据权利要求1-4任意一项所述的方法，所述人羊膜间充质干细胞外泌体的提取方 法为在4°C下，人羊膜间充质干细胞培养上清在300g?10000g的离心力下离心去除培养上 清中的细胞及细胞碎片，收集上清，在l〇〇〇〇〇g的离心力下离心去除培养基中蛋白质收集 沉淀获得人羊膜间充质干细胞的外泌体。
6. 根据权利要求5所述的方法，所述人羊膜间充质干细胞外泌体的提取方法具体包括 以下步骤： (1) 、培养上清300g离心lOmin，收集上清液，弃沉淀； (2) 、上清液2000g?3000g离心20min?30min，收集上清液，弃沉淀； (3) 、上清液10000g离心60min?lOOmin，收集上清液，弃沉淀； (4) 、上清液lOOOOOg离心60min?120min，弃上清，收集沉淀； (5) 、沉淀加入PBS重悬后，lOOOOOg离心60min?120min弃上清，收集沉淀。
7. 权利要求1-6任意一项所述方法制备得到的人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉。
【文档编号】A01N1/02GK104488850SQ201410705636
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 麦锦连, 马岩岩, 王小燕, 舒辉萍 申请人:广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司