一种茄子花药培养直接获得植株的方法和培养基与流程

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种茄子花药培养直接获得植株的方法和培养基。

背景技术：

花药培养是获得单倍体植株的重要途径，通过该技术可以快速获得纯合二倍体，具有缩短育种周期、提高选择效率、克服远缘杂种的不育性等优势，还可以作为分子标记和遗传图谱绘制研究的良好材料。

由花药培养或游离小孢子培养获得茄子单倍体植株主要有三种途径：1、先脱分化形成愈伤组织，再诱导愈伤组织分化形成胚状体，最后由胚状体发育成完整植株；2、由诱导形成的愈伤组织直接分化出不定芽，不定芽再发育为完整的植株；3、直接获得胚状体，发育成完整植株。

茄子花药培养研究开展较早，自从Raina和Iyer等于1973年首次报道通过花药培养经愈伤组织途径获得茄子单倍体植株以来，茄子花药培养和小孢子培养都有成功报道。虽然不少茄子品种或杂交种已获得了DH植株，但远没有像茄科另一作物烟草那样具有高效的单倍体再生系统，从而阻碍了该技术在茄子生产中大规模应用。

目前茄子花药培养大多经过脱分化形成愈伤组织和愈伤组织分化胚状体或不定芽这两个阶段，需要置于两种不同的培养基上进行培养，转接工作量大，但愈伤组织的分化频率却较低；游离小孢子培养可以直接获得胚状体，但方法较为繁琐，且胚状体的诱导频率低，不能完全满足生产上对单倍体植株的需求。因此，如何建立高效、简捷的胚状体诱导体系，获得大量单倍体植株，是现在茄子育种亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于公开了一种茄子花药培养直接获得植株的方法.

本发明另一个目的在于公开了用于茄子花药培养直接获得植株的方法的培养基。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种茄子花药培养直接获得植株的方法，包括下述步骤：

(1)、胚状体的获得：将单核靠边期的无菌花药接种于花药培养固体培养基中，33～37℃黑暗培养2～8天，转至25-28℃光照培养30-40天，可见胚状体由裂开的花药壁内萌发出来；

所述花药培养固体培养基的组成为：950mg/L KNO₃、825mg/L NH₄NO₃、332.02mg/L CaCl₂、180.54mg/L MgSO₄、170mg/L KH₂PO₄、36.7mg/L FeNaEDTA、0.83mg/L KI、6.2mg/L H₃BO₃、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、100mg/L肌醇、5mg/L烟酸、2mg/L甘氨酸、0.5mg/L盐酸硫氨(维生素B1)、0.5mg/L盐酸吡哆素(维生素B6)、0.5mg/L叶酸、0.05mg/L生物素、800mg/L谷氨酰胺、100mg/L丝氨酸、30mg/L谷胱甘肽(GSH)、0.1～1mg/L KT、0.1～1mg/L IAA、0.01～0.05mg/L NAA、0.1％～0.3％活性炭、3％～6％蔗糖和0.6％～0.8％琼脂；固体培养基的pH值为5.8；

(2)、再生单倍体植株的获得：当胚状体生长到子叶型胚状体阶段，将其转接至健苗生根固体培养基中继续培养，长成完整植株；

所述健苗生根固体培养基的组成为：1900mg/L KNO₃、1650mg/L NH₄NO₃、332.02mg/L CaCl₂、180.54mg/L MgSO₄、170mg/L KH₂PO₄、36.7mg/L FeNaEDTA、0.83mg/L KI、6.2mg/L H₃BO₃、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、100mg/L肌醇、0.5mg/L烟酸、2mg/L甘氨酸、0.1mg/L盐酸硫氨(维生素B1)、0.5mg/L盐酸吡哆素(维生素B6)、0.01～0.1mg/L KT、0.1～0.5mg/L IBA、3％蔗糖和0.8％琼脂；健苗生根固体培养基的pH值为5.8。

上述技术方案所述的一种茄子花药培养直接获得植株的方法，其中，在所述方法之前还包括下述步骤：

(1)、新鲜花蕾的选取：选取小孢子处于单核靠边期的花蕾，通过DAPI染色确定花粉发育时期为单核靠边期；

(2)、花蕾的表面消毒、无菌花药的获得：花蕾用75％酒精浸泡0.5-1分钟，5％的次氯酸钠溶液浸泡3-5分钟，无菌水冲洗3-5次，无菌滤纸吸干水分。

上述技术方案所述培养方法中培养无菌花药的培养基，其中，所述无菌花药培养固体培养基的组成为：950mg/L KNO₃、825mg/L NH₄NO₃、332.02mg/L CaCl₂、180.54mg/L MgSO₄、170mg/L KH₂PO₄、36.7mg/L FeNaEDTA、0.83mg/L KI、6.2mg/L H₃BO₃、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、100mg/L肌醇、5mg/L烟酸、2mg/L甘氨酸、0.5mg/L盐酸硫氨(维生素B1)、0.5mg/L盐酸吡哆素(维生素B6)、0.5mg/L叶酸、0.05mg/L生物素、800mg/L谷氨酰胺、100mg/L丝氨酸、30mg/L谷胱甘肽(GSH)、0.1～1mg/L KT、0.1～1mg/L IAA、0.01～0.05mg/L NAA、0.1％～0.3％活性炭、3％～6％蔗糖和0.6％～0.8％琼脂；固体培养基的pH值为5.8。

上述技术方案所述培养方法中健苗生根的培养基，其中，所述健苗生根固体培养基的组成为：1900mg/L KNO₃、1650mg/L NH₄NO₃、332.02mg/L CaCl₂、180.54mg/L MgSO₄、170mg/L KH₂PO₄、36.7mg/L FeNaEDTA、0.83mg/L KI、6.2mg/L H₃BO₃、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、100mg/L肌醇、0.5mg/L烟酸、2mg/L甘氨酸、0.1mg/L盐酸硫氨(维生素B1)、0.5mg/L盐酸吡哆素(维生素B6)、0.01～0.1mg/L KT、0.1～0.5mg/L IBA、3％蔗糖和0.8％琼脂；健苗生根固体培养基的pH值为5.8。

本发明具有以下有益效果：

(1)、本发明所采用的培养方法步骤少、简单易行，由花药离体培养直接诱导胚状体获得单倍体植株。由于本发明采用的方法不经过愈伤组织过程，所以不存在愈伤组织分化问题，避免了花药培养诱导形成的愈伤组织转接至分化培养基，再诱导形成再生植株的过程；也避免了由花药壁等二倍体体细胞参与愈伤组织形成而出现的倍性混杂现象。

(2)、本发明采用的方法具有单倍体植株再生周期短、诱导频率高、省时省力等优点。同时克服了基因型障碍，不同基因型紫色和绿色圆茄、长茄的花药培养都获得了较高的胚状体诱导率。

(3)、现有技术中采用小孢子培养可以直接获得胚状体，虽然不受花药壁等二倍体细胞的干扰，但培养技术难度较大、不易操作，而且胚状体诱导率较低，一般都在10％以下，而采用本发明的方法，胚状体诱导频率一般在20％-40％。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明一种茄子花药培养直接获得植株的方法和培养基作进一步的说明。

实施例1：紫萼片紫色圆茄的花药培养：

2015年5-6月间，从种植大棚取回花蕾，花粉经DAPI(4，6-联脒-2-苯基吲哚)染色确认发育时期为单核靠边期。花蕾经75％酒精1分钟，5％次氯酸钠5分钟表面消毒，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干水分。用小镊子小心地将花药取出，置于花药培养固体培养基中，37℃黑暗培养3天后转至25℃光照下继续培养；30天左右，肉眼可见白色胚状体从裂开的花药壁内萌发出来；

当胚状体分化出两片小子叶时将其转至健苗生根固体培养基中上继续生长，进行壮苗及生根。1130个花药共产出胚状体446个，胚状体诱导率为39.5％；

其中，无菌花药培养固体培养基的组成为：950mg/L KNO₃、825mg/L NH₄NO₃、332.02mg/L CaCl₂、180.54mg/L MgSO₄、170mg/L KH₂PO₄、36.7mg/L FeNaEDTA、0.83mg/L KI、6.2mg/L H₃BO₃、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、100mg/L肌醇、5mg/L烟酸、2mg/L甘氨酸、0.5mg/L盐酸硫氨(维生素B1)、0.5mg/L盐酸吡哆素(维生素B6)、0.5mg/L叶酸、0.05mg/L生物素、800mg/L谷氨酰胺、100mg/L丝氨酸、30mg/L谷胱甘肽(GSH)、0.1～1mg/L KT、0.1～1mg/L IAA、0.01～0.05mg/L NAA、0.1％～0.3％活性炭、3％～6％蔗糖和0.6％～0.8％琼脂；固体培养基的pH值为5.8；

其中，健苗生根固体培养基的组成为：1900mg/L KNO₃、1650mg/L NH₄NO₃、332.02mg/L CaCl₂、180.54mg/L MgSO₄、170mg/L KH₂PO₄、36.7mg/L FeNaEDTA、0.83mg/L KI、6.2mg/L H₃BO₃、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、100mg/L肌醇、0.5mg/L烟酸、2mg/L甘氨酸、0.1mg/L盐酸硫氨(维生素B1)、0.5mg/L盐酸吡哆素(维生素B6)、0.01～0.1mg/L KT、0.1～0.5mg/L IBA、3％蔗糖和0.8％琼脂；健苗生根固体培养基的pH值为5.8。

实施例2：

按照实施例1的实施过程，2013-2016年间对13种不同基因型的茄子分别进行了实验，其中对4个茄子杂交种(A、C、G、J)进行了重复实验，结果如表2所示，表2中杂交种A于2014年和2015年进行了重复实验；杂交种C于2015年和2016年进行了重复实验；杂交种G于2014年和2015年进行了重复实验；杂交种J于2015年和2016年进行了重复实验：

表2不同基因型茄子花药培养的胚状体诱导结果

由表2可知，采用本发明的方法，胚状体诱导频率一般在20％-40％。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。