一种光响应性农药纳米胶束及其制备方法与用途与流程

本发明涉及纳米农药制剂，特别是一种光响应性农药纳米胶束及其制备方法与用途。

背景技术：

农药在维护人类的粮食安全中做出了重要贡献。然而，农药的长期使用也导致了一系列的负面效应：如农药的残留毒性、病虫产生的抗药性、次要害虫的大量发生、环境污染、生态破坏等，成为人们迫切需要解决的问题。开发新型农药(即高效、低毒、低残留的农药新品种)及各种环保型农药制剂是农药研究的重点。由于致力于已有农药品种的环保化研究和开发具有省时和经费投入量小的优点，成为当前农药研究的一个重要方向。我国现行农药制剂的水平比较落后，乳油、可湿性粉剂、粉剂、颗粒等4种传统制剂的产量占到了75％。这些制剂导致每年投入自然环境中的有害溶剂如甲苯、二甲苯及氟利昂等达到30万吨以上，给环境带来了沉重的负担。在我国，每年因农药使用不当而导致的年经济损失就达数十亿，而且病虫害抗药性猛烈上升，农民用药负担加重，影响了我国农业的持续发展。由此可见，重视和发展农药制剂，尤其是环保型农药制剂的研究、开发和生产是当前农药领域十分紧迫的任务。

光响应纳米粒是一种能响应外界光刺激而发生形态或结构改变的微粒。这种纳米粒用作药物载体，能在时空上很方便地调节药物释放，因而在药物传递领域引起了科学家的高度关注。一般来讲，构建光响应纳米粒需要用到一个光触发基团(phototrigger)诸如4-香豆素亚甲氧基、2-硝基苯甲氧基和7-硝基吲哚啉等。在这些光触发基团中，2-硝基苯甲氧基特别引人关注，因为它能在紫外光或近红外光下发生光解反应，破坏含有2-硝基苯甲氧基的两亲性聚合物的亲疏平衡，导致自组装体系的破裂。例如，Meng L等设计合成了基于含有2-硝基苯甲氧基的两亲性壳聚糖的胶束系统，该系统能响应紫外光刺激释放疏水抗癌药物喜树碱，对MCF-7癌细胞显示出良好的细胞毒性。然而，至今文献中所报道的光响应纳米粒主要用作控释药物的载体，用于农药控制释放的设计尚未见报道。

控释剂型发展至今，其包载药物的方式主要有化学键合与物理包埋两种。由于基于物理包埋的方式很难避免系统在传递活性物质过程中发生药物泄露，所以发展以共价键连接的两亲性光响应性农药聚合物前体，在水溶液中自组装成纳米胶束，实现在避光下施药、在到达靶植物体内后响应太阳光刺激释药，对解决农药的利用率低下具有重要意义。

技术实现要素：

本发明解决其技术问题是：为了解决现有技术中存在的问题，提供一种新型的光响应性控释农药纳米胶束制剂及其制备方法和应用。该方法不仅工艺简单，操作简便，而且制备的纳米农药制剂具有较好的光响应性，可以通过喷雾或喷洒作用于靶植物的表面，通过內吞作用进入靶植物细胞，响应太阳光刺激释放农药。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的光响应性农药纳米胶束，其有效组成为：3-硝基-4-溴甲基苯甲酸先与数均分子量为4000的PEG反应生成NBA-PEG；然后NBA-PEG与农药2,4-D反应得到PEG前体农药；该前体农药在水溶液中自组装得到光响应性农药纳米胶束。

所述的3-硝基-4-溴甲基苯甲酸先与数均分子量为4000的PEG的摩尔比例为1:1.0～1.9:1.0。

所述的农药2,4-D与NBA-PEG的摩尔比为1:1～2.0:1。

本发明提供的光响应性农药纳米胶束的制备方法，其步骤包括：

(1)NBA-PEG的制备：

先按摩尔比为1:1.0～1.9:1.0称取3-硝基-4-溴甲基苯甲酸与PEG-4000，将其溶于10ml摩尔浓度为12.9mol/L的DMF后加入催化剂EDC与DMAP，在室温下反应24h；反应结束后在冰浴条件下缓慢滴加摩尔浓度为10mol/L乙醚析出固体，将此固体溶于摩尔浓度为15.6mol/L二氯甲烷中，经摩尔浓度为1.0×10^-5mol/ml稀盐酸洗涤，再用摩尔浓度为0.89mol/L饱和的碳酸氢钠溶液调整pH至中性，分除水相，之后用旋蒸方法除去有机相制得NBA-PEG；

(2)光响应性聚合物前体农药的制备：

先按摩尔比为1:1～2.0:1称取2,4-D与NBA-PEG，将其溶于10ml摩尔浓度为12.9mol/L的DMF中，之后加入催化剂KI和TEA，50～100℃条件下反应8h，再加入摩尔浓度为10mol/L乙醚析出光响应性聚合物前体农药；

(3)光响应性农药纳米胶束的制备：

将光响应性聚合物前体农药溶于去离子水中，超声处理，得到均匀分布的光响应性农药纳米胶束。

所述的3-硝基-4-溴甲基苯甲酸与PEG，其在1.7:1.0的条件下时，NBA-PEG的产率最高，为76.1％。

所述的催化剂EDC和DMAP，其与PEG的摩尔比为1.5:0.15:1.0。

所述的2,4-D与NBA-PEG，其在摩尔比为1.5:1的条件下时，光响应性聚合物前体农药的产率最高，为64.8％。

所述的催化剂KI和TEA，其与NBA-PEG的摩尔比为1.1:1.1:1.0。

所述的超声处理，其工艺为：将所制备的光响应性聚合物前体农药溶于去离子水中，100w下超声，使其自组装，即得均匀分布的光响应农药纳米胶束溶液。

本发明提供的光响应性农药纳米胶束，其在避光条件下通过喷雾或喷洒作用于靶植物的表面，然后在太阳光刺激下缓慢释放出农药。

本发明提供的上述方法制备的光响应性农药纳米胶束，其在避光条件下通过喷雾或喷洒作用于靶植物的表面，然后在太阳光刺激下缓慢释放出农药。

本发明与现有技术相比具有以下的主要优点：

(1)本发明采用化学键合载药的方法制备的PEG农药前药，能实现原位载药，且能稳固的包载药物，防止药物提前泄露。而以往采用的化学光交联法制备的壳聚糖纳米凝胶，无法对带有胺基的药物或活性分子实现原位载药。

(2)本发明采用的是物理方法超声条件下使聚合物农药前药自组装形成纳米胶束，操作简单，且未引入有毒物质，而以往的发明采用的是戊二醛交联剂制备纳米凝胶，此交联剂剧毒，通过透析方法也不乏完全除去。

(3)本发明采用聚乙二醇(PEG)为控释材料，PEG具有低毒性、很弱的免疫原性和抗原性、优良的生物相容性、不易被蛋白质吸附、聚醚主链的稳定性以及无论是在水溶液还是许多的有机溶剂中良好的溶解性等优点。以PEG制备成的两亲性胶束水溶性好、流动性高、稳定性强，是一种制备控释制剂的良好材料。

(4)本制剂使用的除草剂为二氯苯氧乙酸(2,4-D)，2,4-D药物利用度低，自身会降解且进入地下水后会对环境造成污染，对人体造成危害。本发明中农药2.4-D与载体以化学键合，在无照条件下施用，能避免药物泄露，从而降低对环境危害。

(5)本制剂具有光响应性，在光照达到一定强度后才释放药物。故喷施进入靶植物体内后，能够响应太阳光刺激释放药物，从而避免农药在夜间和无阳光的白天释放，有利于大大提高农药的利用率。

(6)工艺简单，容易操作，适于工业化生产。

附图说明

图1为本发明制备的光响应性农药前药光照十分钟后的核磁共振图谱。

图2为本发明制备的光响应性农药纳米胶束光照前的透射电镜图。

图3为本发明制备的光响应性农药纳米胶束光照后的透射电镜图。

图4为本发明实施例3制备的光响应性农药纳米胶束在水溶液中的释药曲线。

具体实施方式

本发明首先采用无毒水溶性良好的PEG-4000与3-硝基-4-溴甲基苯甲酸在催化剂EDC与DMAP依次作用下反应制得中间产物(NBA-PEG)；然后与农药二氯苯氧乙酸(2,4-D)在DMF溶液中混合，加入催化剂KI与TEA，反应制得光响应性聚合物前体农药；最后光响应性聚合物前体农药在水溶液中自组装形成农药纳米胶束制剂。

下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明，但不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1：

取3-硝基-4-溴甲基苯甲酸(0.39g，1.5mmol)与PEG4000(4.00g，1.00mmol)溶于10ml的摩尔浓度为12.9mol/L DMF中，依次加入EDC(0.288g，1.5mmol)与DMAP(0.0183g，0.15mmol)，在室温下搅拌反应24h。随后，在0℃下滴加摩尔浓度为10mol/L的乙醚析出白色固体。过滤后将白色固体溶于摩尔浓度为15.6mol/L的二氯甲烷中，用1.0×10^-5mol/ml的稀盐酸洗三次，然后用0.89mol/L的饱和的碳酸氢钠溶液调整pH至中性。取有机层用旋转蒸发仪蒸发大部分二氯甲烷，得到白色透明浓缩液，在冰浴下向浓缩液中滴加10mol/L的乙醚，重新析出白色沉淀，过滤，干燥，即得NBA-PEG。产率约为75.3％。上述所有反应都在暗环境下进行。

取NBA-PEG(2.122g，0.5mmol)溶于10ml的摩尔浓度为12.9mol/L DMF中，随后加入2,4-D(0.1658g，0.75mmol)，催化剂KI(0.0913g，0.55mmol)和TEA(0.077ml，0.55mmol)，在75℃反应8h。反应结束后，降温至0℃，滴加摩尔浓度为10mol/L的乙醚析出淡黄色沉淀。产率约为64.8％。取淡黄色固体10.00mg溶于2ml去离子水中，超声(100W)处理30分钟，即得光响应性的农药纳米胶束溶液。上述所有反应都在暗环境下进行。

实施例2：

取3-硝基-4-溴甲基苯甲酸(0.26g，1.0mmol)与PEG4000(4.00g，1.00mmol)溶于10ml的摩尔浓度为12.9mol/L DMF中，依次加入EDC(0.288g，1.5mmol)与DMAP(0.0183g，0.15mmol)，在室温下搅拌反应24h。随后，在0℃下滴加10mol/L的乙醚析出白色固体。过滤后将白色固体溶于摩尔浓度为15.6mol/L的二氯甲烷中，用1.0×10-5mol/ml的稀盐酸洗三次，然后用0.89mol/L饱和的碳酸氢钠溶液调整pH至中性。取有机层用旋转蒸发仪蒸发大部分二氯甲烷，得到白色透明浓缩液，在冰浴下向浓缩液中滴加10mol/L的乙醚，重新析出白色沉淀，过滤，干燥，即得NBA-PEG。产率约为67.2％。上述所有反应都在暗环境下进行。

取NBA-PEG(2.122g，0.5mmol)溶于10ml的摩尔浓度为12.9mol/L DMF中，随后加入2,4-D(0.1658g，0.75mmol)，催化剂KI(0.0913g，0.55mmol)和TEA(0.077ml，0.55mmol)，在75℃反应8h。反应结束后，降温至0℃，滴加10mol/L的乙醚析出淡黄色沉淀。产率约为64.1％。取淡黄色固体10.00mg溶于2ml去离子水中，超声(100W)处理30分钟，即得光响应性的农药纳米胶束溶液。上述所有反应都在暗环境下进行。

实施例3：

将3-硝基-4-溴甲基苯甲酸(0.442g，1.7mmol)与PEG4000(4.00g，1.00mmol)溶于10ml的摩尔浓度为12.9mol/L DMF中，依次加入EDC(0.288g，1.5mmol)与DMAP(0.0183g，0.15mmol)，在室温下搅拌反应24h。随后，在0℃下滴加10mol/L的乙醚析出白色固体。过滤后将白色固体溶于摩尔浓度为15.6mol/L的二氯甲烷中，用1.0×10-5mol/ml的稀盐酸洗三次，然后用0.89mol/L饱和的碳酸氢钠溶液调整pH至中性。取有机层用旋转蒸发仪蒸发大部分二氯甲烷，得到白色透明浓缩液，在冰浴下向浓缩液中滴加10mol/L的乙醚，重新析出白色沉淀，过滤，干燥，即得NBA-PEG。产率约为76.1％。上述所有反应都在暗环境下进行。

取NBA-PEG(2.122g，0.5mmol)溶于10ml的摩尔浓度为12.9mol/L DMF中，随后加入2,4-D(0.1658g，0.75mmol)，催化剂KI(0.0913g，0.55mmol)和TEA(0.077ml，0.55mmol)，在75℃反应8h。反应结束后，降温至0℃，滴加10mol/L的乙醚析出淡黄色沉淀。产率约为64.3％。取淡黄色固体10.00mg溶于2ml去离子水中，超声(100W)处理30分钟，即得光响应性的农药纳米胶束溶液。上述所有反应都在暗环境下进行。

实施例4：

将3-硝基-4-溴甲基苯甲酸(0.442g，1.7mmol)与PEG4000(4.00g，1.00mmol)溶于10ml的摩尔浓度为12.9mol/L DMF中，依次加入EDC(0.288g，1.5mmol)与DMAP(0.0183g，0.15mmol)，在室温下搅拌反应24h。随后，在0℃下滴加10mol/L的乙醚析出白色固体。过滤后将白色固体溶于摩尔浓度为15.6mol/L的二氯甲烷中，用1.0×10-5mol/ml的稀盐酸洗三次，然后用0.89mol/L饱和的碳酸氢钠溶液调整pH至中性。取有机层用旋转蒸发仪蒸发大部分二氯甲烷，得到白色透明浓缩液，在冰浴下向浓缩液中滴加10mol/L的乙醚，重新析出白色沉淀，过滤，干燥，即得NBA-PEG。产率约为76.1％。上述所有反应都在暗环境下进行。

将NBA-PEG(2.122g，0.5mmol)溶于10ml的摩尔浓度为12.9mol/L DMF中，随后加入2,4-D(0.1106g，0.5mmol)，催化剂KI(0.0913g，0.55mmol)和TEA(0.077ml，0.55mmol)，在75℃反应8h。反应结束后，降温至0℃，滴加10mol/L的乙醚析出淡黄色沉淀。产率约为55.1％。取淡黄色固体10.00mg溶于2ml去离子水中，超声(100W)处理30分钟，即得光响应性的农药纳米胶束溶液。上述所有反应都在暗环境下进行。

实施例5：

将3-硝基-4-溴甲基苯甲酸(0.442g，1.7mmol)与PEG4000(4.00g，1.00mmol)溶于10ml的摩尔浓度为12.9mol/L DMF中，依次加入EDC(0.288g，1.5mmol)与DMAP(0.0183g，0.15mmol)，在室温下搅拌反应24h。随后，在0℃下滴加10mol/L的乙醚析出白色固体。过滤后将白色固体溶于摩尔浓度为15.6mol/L的二氯甲烷中，用1.0×10-5mol/ml的稀盐酸洗三次，然后用0.89mol/L饱和的碳酸氢钠溶液调整pH至中性。取有机层用旋转蒸发仪蒸发大部分二氯甲烷，得到白色透明浓缩液，在冰浴下向浓缩液中滴加10mol/L的乙醚，重新析出白色沉淀，过滤，干燥，即得NBA-PEG。产率约为76.1％。上述所有反应都在暗环境下进行。

将NBA-PEG(2.122g，0.5mmol)溶于10ml的摩尔浓度为12.9mol/L DMF中，随后加入2,4-D(0.2211g，1.0mmol)，催化剂KI(0.0913g，0.55mmol)和TEA(0.077ml，0.55mmol)，在75℃反应8h。反应结束后，降温至0℃，滴加10mol/L的乙醚析出淡黄色沉淀。产率约为64.7％。取淡黄色固体10.00mg溶于2ml去离子水中，超声(100W)处理30分钟，即得光响应性的农药纳米胶束溶液。上述所有反应都在暗环境下进行。

实施例6：

将3-硝基-4-溴甲基苯甲酸(0.442g，1.5mmol)与PEG4000(4.00g，1.00mmol)溶于10ml的摩尔浓度为12.9mol/L DMF中，依次加入EDC(0.288g，1.5mmol)与DMAP(0.0183g，0.15mmol)，在室温下搅拌反应24h。随后，在0℃下滴加10mol/L的乙醚析出白色固体。过滤后将白色固体溶于摩尔浓度为15.6mol/L的二氯甲烷中，用1.0×10-5mol/ml的稀盐酸洗三次，然后用0.89mol/L饱和的碳酸氢钠溶液调整pH至中性。取有机层用旋转蒸发仪蒸发大部分二氯甲烷，得到白色透明浓缩液，在冰浴下向浓缩液中滴加10mol/L的乙醚，重新析出白色沉淀，过滤，干燥，即得NBA-PEG。产率约为75.2％。上述所有反应都在暗环境下进行。

将NBA-PEG(2.122g，0.5mmol)溶于10ml的摩尔浓度为12.9mol/L DMF中，随后加入2,4-D(0.1658g，0.75mmol)，催化剂KI(0.0913g，0.55mmol)和碳酸钾(0.07602g，0.55mmol)，在75℃反应8h。反应结束后，降温至0℃，滴加10mol/L的乙醚析出淡黄色沉淀。产率约为15.5％。取淡黄色固体10.00mg溶于2ml去离子水中，超声(100W)处理30分钟，即得光响应性的农药纳米胶束溶液。上述所有反应都在暗环境下进行。

实施例7：

将3-硝基-4-溴甲基苯甲酸(0.442g，1.5mmol)与PEG4000(4.00g，1.00mmol)溶于10ml的摩尔浓度为12.9mol/L DMF中，依次加入EDC(0.288g，1.5mmol)与DMAP(0.0183g，0.15mmol)，在室温下搅拌反应24h。随后，在0℃下滴加10mol/L的乙醚析出白色固体。过滤后将白色固体溶于摩尔浓度为15.6mol/L的二氯甲烷中，用1.0×10-5mol/ml的稀盐酸洗三次，然后用0.89mol/L饱和的碳酸氢钠溶液调整pH至中性。取有机层用旋转蒸发仪蒸发大部分二氯甲烷，得到白色透明浓缩液，在冰浴下向浓缩液中滴加10mol/L的乙醚，重新析出白色沉淀，过滤，干燥，即得NBA-PEG。产率约为75.2％。上述所有反应都在暗环境下进行。

将NBA-PEG(2.122g，0.5mmol)溶于10ml的摩尔浓度为12.9mol/L DMF中，随后加入2,4-D(0.1658g，0.75mmol)，催化剂KI(0.0913g，0.55mmol)和TEA(0.077ml，0.55mmol)，在100℃反应8h。反应结束后，降温至0℃，滴加10mol/L的乙醚析出淡黄色沉淀。产率约为64.6％。取淡黄色固体10.00mg溶于2ml去离子水中，超声(100W)处理30分钟，即得光响应性的农药纳米胶束溶液。上述所有反应都在暗环境下进行。

图1显示了实例1制备的光响应PEG农药前药分别在以下试剂中光照十分钟的核磁共振图谱：(a)D₂O，(b)DMSO-d₆/D₂O(1:5,v/v)，(c)DMSO-d₆/D₂O(1:5,v/v)。曲线a与曲线b相比，在δ＝6.60～8.60处归属于芳香环上氢核质子的振动信号峰在曲线a中没有观察到。这一点表明了两亲性的PEG农药前药在D₂O中形成了胶束，而且2,4-D的疏水端被亲水性的PEG主链部分屏蔽，形成了具有疏水性的内核，故使得2,4-D的H核信号被屏蔽，检测不出H核信号。曲线c与曲线b相比，曲线b中δ＝5.10归属于亚甲基(2H，ArCH₂OCO)的信号峰在曲线c中消失了，同时曲线c中δ＝10.24与11.00出了两个分别归属于(H，CHO)与(H，COOH)的信号峰，表明PEG-NBA农药前药的光响应基团邻硝基苄基的断裂，同时生成了新的物质。

图2显示了实例3制备的光响应性纳米农药胶束光照前的透射电镜图，平均粒径约为34nm。

图3显示了实例9制备的光响应性纳米农药胶束光照后的透射电镜图，平均粒径约为24nm。

图2和图3结果表明，光照前后PEG农药前药胶束的平均粒径减少了10nm左右，这可归因于两亲性的PEG农药前药纳米胶束在被紫外光照射后发生光裂反应，脱去了二氯苯氧乙酸。另外，光解后的产物仍然是一个两亲性的化合物，在水溶液中仍然可以自组装形成胶束，所以电镜照片显示出核壳形态，只是粒径略微变小。

图4显示了实例3制备的光响应性农药纳米胶束在水溶液中的释药曲线。在未光照的条件下，未观察到2,4-D从纳米胶束中释放出来。然而，在紫外光照射下，在2分钟的时候，就已经有51.8％的2,4-D从纳米胶束中释放出来，并且随着暴露在紫外光下的时间进一步延长，2,4-D的释放继续增加，累积释放率在9分钟达到99.5％。在模拟太阳光照射下，光响应性纳米农药胶束的药物释放则表现出了一定的缓释性能，在经过9小时后，累计释放率达到99.6％。

尽管这里参考给出的实施方案说明并且描述了本发明的某些方面，但并不是为了将所附的权利要求限定到所显示的细节中。相反，可以预料本领域的技术人员可以对这些细节进行不同的修改，其中这些修改应该还在所要求的主题的精神和范围内，并且是为了相应地解释这些权利要求。