本发明属于细胞保存技术领域，具体地说，涉及一种对细胞无毒害作用的细胞冻存保护液及其应用。
背景技术：
当前在疫苗生产中，传代细胞的冷冻保存方法，均以含浓度8-10％(v/v)二甲基亚砜的细胞营养液为细胞冷冻保护液，采用缓慢降温的程序，将细胞种子保存于液氮中，实现细胞种子的长期保存。
二甲基亚砜是一种重要的渗透型细胞保护剂。它能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤，因此被广泛应用在传代细胞、干细胞等多类细胞的冷冻保存过程中，但二甲基亚砜超低温时的细胞毒性受到抑制，随着温度的逐渐上升，细胞毒性逐渐增加，因此复苏细胞时尽快洗掉二甲基亚砜，否则会造成对细胞严重的毒性，尽管如此，在细胞冻存过程中渗透进入细胞膜内的二甲基亚砜，仍无法完全去除，只能在以后的细胞传代过程中逐渐减少，使其对细胞毒性作用逐渐降低，这种毒性作用将伴随细胞复苏后的整个生命周期。
二甲基亚砜是目前最好的细胞冻存保护剂，但也是一种细胞毒性很大的化学试验剂，同时本品有局部毒性和低的全身毒性，并且本品与氧化剂有配伍禁忌。研究结果表明，培养液中二甲基亚砜浓度为10％时，细胞生长抑制率近100％，1‰浓度时抑制率为35％，即使是0.04‰的浓度，二甲基亚砜对细胞的生长也有不利的影响；另外，已有的动物试验数据表明，二甲基亚砜急性毒性数据为LD50(小鼠IV)：3.8g/kg,而目前临床输液常用的葡萄糖急性毒性数据为LD50(小鼠IV)：9g/kg，二者相比较，二甲基亚砜的毒性为葡萄糖的2.4倍。综上所述，二甲基亚砜在细胞的传代和保存过程中将始终伴随，并且在细胞生长不同的阶段，存在不同程度的细胞毒性作用，另外二甲基亚砜对动物身体也存在一定的毒性，存在潜在的风险。因此，无论在细胞培养方面，还是临床应用的产品方面，都应远离二甲基亚砜。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种不含二甲基亚砜的细胞冻存保护液，以减少冻存保护液对细胞的毒性作用。
本发明提供一种细胞冻存保护液，含10％-20％牛血清(v/v)、35％-50％蔗糖(w/v)、0.15-0.35mol/L磷酸盐缓冲溶液，pH值为7.0-7.4；该细胞冻存保护液不含二甲基亚砜。
优选地，本发明的细胞冻存保护液含10％-15％牛血清(v/v)、40％-45％蔗糖(w/v)、0.20-0.30mol/L磷酸盐缓冲溶液，pH值为7.0-7.4。
更优选地，本发明的细胞冻存保护液含10％牛血清(v/v)、43.75％蔗糖(w/v)、0.25mol/L磷酸盐缓冲溶液，pH值为7.0-7.4。
本发明提供了上述细胞冻存液在冻存细胞中的应用。
本发明的细胞冻存液适用于人类细胞或哺乳动物细胞。所述人类细胞或哺乳动物细胞包括癌细胞、体细胞和干细胞的至少之一。
本发明提供了上述细胞冻存保护液在生物制品生产中的应用。
本发明还提供一种冻存细胞的方法，包括以下步骤：
(1)将细胞悬液离心，保留细胞沉淀；
(2)以权利要求1-3任一所述的细胞冻存保护液重悬细胞沉淀；
(3)以梯度降温的方式对细胞冻存保护液重悬后的细胞进行降温处理，直至保存于液氮中。
上述方法中，步骤(1)的细胞悬液是将细胞生长至单层后，消化单层细胞至细胞间质打开，细胞分散均匀的细胞悬液。
上述方法中，步骤(2)细胞冻存保护液重悬细胞沉淀使细胞浓度达到104-107/ml。
上述方法中，步骤(3)的梯度降温方法为4℃，3-6小时；-20℃，2-3小时；-70℃，8-12小时；液氮气相部分，2-3小时；液氮液相部分，长期保存。
本领域技术人员应当理解，将上述冻存细胞的方法可进一步应用于生物制品制备技术领域，例如疫苗的生产，因此本发明的冻存细胞的方法在制备生物制品中的应用也属于本发明的保护范围。
基于上述技术，本发明取得了以下有益效果：
(1)本发明的细胞冻存保护液中不含二甲基亚砜，仅使用牛血清、蔗糖、磷酸盐缓冲体系成分，在细胞外环境提供一种高渗的环境，使细胞内水分外流，提高细胞内液的浓度，从而降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤，从而达到在细胞冻存过程中去除二甲基亚砜的目的，即可达到保护细胞的效果，同时其对细胞的保护作用与传统的含二甲基亚砜的细胞冻存保护液无显著性差异，可以实现传代细胞种子批长期、稳定的保存并保持其生物学特性不变。从根本上避免了二甲基亚砜对细胞的毒性作用，以及对疫苗类产品存在的潜在的风险。
(2)本发明的细胞冻存保护液原料来源丰富，配制简单，成本低廉；利用该冻存保护液冻存细胞的方法简便易操作，适用于大规模工业化生产；
(3)本发明细胞冻存保护液不含二甲基亚砜，其他主要成分环境友好，无污染环境，对细胞无毒副作用，安全性良好，适用于生物制品的生产；
(4)本发明细胞冻存保护液保存的细胞按照常规方法复苏后，细胞的复苏存活率达到85％。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1不含二甲基亚砜的细胞冻存保护液对细胞的保存
1、以人胚肺二倍体细胞(SV-1株)为培养基质，连续传代至27代，细胞生长液为含有浓度10％牛血清(v/v)、pH7.2的细胞培养液，培养温度为36.5±0.5℃；细胞生长至单层后，以0.25％细胞消化液消化单层细胞，至细胞间质打开，以细胞生长液吹打、分散细胞，合并收集细胞悬液；细胞悬液经转速800rpm/min、时间20min离心，保留细胞沉淀；
2、以表1中的三个配方的细胞冻存保护液分别重悬细胞沉淀，同时对重悬后的细胞悬液进行细胞计数。表1中的三个配方的细胞冻存保护液分别为：
配方2：质量百分浓度10％牛血清(v/v)、43.75％蔗糖(w/v)、0.25mol/l磷酸盐的缓冲溶液、pH值7.0-7.4；
同时增设低浓度组(配方1)，即10％牛血清(v/v)、35％蔗糖(w/v)、0.15mol/l磷酸盐的缓冲溶液、pH值7.0-7.4；
高浓度组(配方3)即10％牛血清(v/v)、50％蔗糖(w/v)、0.35mol/l磷酸盐的缓冲溶液、pH值7.0-7.4，并测定上述3组细胞冻存保护液的渗透压；当3组细胞浓度达到106/ml时，分别定量分装于细胞冻存管中；
3、按照适宜的降温曲线对冻存管内细胞进行降温处理，直至保存于液氮中。具体程序如下：4℃(放置6小时)，-10℃(放置3小时)，-60℃(放置12小时)，液氮气相部分(放置2小时)，液氮液相部分(长期保存)。
4、将液氮中保存的细胞复苏，比较各组细胞成活率的差异。结果见表1。细胞复苏的方法，具体步骤如下：将液氮保存的细胞种子置于37℃水浴中速溶；将细胞种子以细胞复苏液进行连续倍比稀释成10-20ml体积的细胞悬液；细胞复苏液为含有浓度为20％牛血清、pH7.2的细胞培养液；将细胞悬液经转速800rpm/min、时间20min离心，保留细胞沉淀；以细胞复苏液重悬细胞沉淀并按1:1接种率将细胞接种至细胞培养瓶，并补充细胞复苏液至培养量，置于36.5±0.5℃培养；
表1
结果表明，配方2为最佳组合，其渗透压为2400mOsmol/kg，经配方2冻存的细胞其复苏后细胞存活率达到85％；配方1为低浓度组，其渗透压为1500mOsmol/kg，属于偏低的水平，从而影响细胞内液水分的外流，复苏细胞存活率为52.6％；配方3为高浓度组，其渗透压为3300mOsmol/kg，此配方细胞复苏的成活率(59.3％)也属于偏低的水平，原因可能是渗透压过高，造成细胞内液水分轻微过度流失，最终影响细胞复苏的成活率。
实施例2本发明的细胞冻存保护液在冻存过程中对不同细胞浓度的细胞保护作用的比较
以SV-1株细胞为例，制备33代单层细胞，以0.25％细胞消化液消化单层细胞，以细胞生长液吹打、分散细胞，合并收集细胞悬液，经转速800rpm/min、时间20min离心，保留细胞沉淀，用实施例1提供的最优选的细胞冻存保护液(配方2)重悬并分别定量为104/ml、105/ml、106/ml、107/ml(采用血球计数板检测细胞浓度)，按实施例1提供的降温程序，将细胞保存于液氮中。30天后复苏细胞，复苏细胞方法参见实施例1结果见表2。
表2
结果表明，试验组不同细胞浓度组的细胞成活率在104/ml-107/ml细胞浓度范围内，无显著性差异。
实施例3不同渗透压的细胞冻存保护液对细胞冻存影响的比较
以SV-1株细胞为例，制备33代单层细胞，以0.25％细胞消化液消化单层细胞，以细胞生长液吹打、分散细胞，合并收集细胞悬液，经转速800rpm/min、时间20min离心，保留细胞沉淀，用不同渗透压的细胞冻存保护液(通过控制蔗糖、磷酸盐的浓度来获得，具体见表3)重悬并定量，采用血球计数板检测细胞浓度为106/ml，按实施例2提供的降温程序，将细胞保存于液氮中。30天后复苏细胞，细胞复苏方法采用实施例1提供的方法，结果见表3。
表3
结果表明，细胞的成活率随着细胞冻存保护液的渗透压的升高而大幅提高，至2000-3000(mOsmol/kg)均可以得到一个产业上较理想的细胞成活率。
实施例4本发明细胞冻存保护液与传统的含二甲基亚砜的细胞冻存液对比研究
以SV-1株细胞为例，制备33代单层细胞，以0.25％细胞消化液消化单层细胞，以细胞生长液吹打、分散细胞，合并收集细胞悬液，经转速800rpm/min、时间20min离心，保留细胞沉淀，用实施例1确定的最优选的细胞冻存保护液(即配方2)重悬并将细胞浓度定量为106/ml(采用血球计数板检测细胞浓度)，按实施例1提供的降温程序，将细胞保存于液氮中。对照组则以浓度为20％牛血清(v/v)、70％MEM基础液(v/v)、10％二甲基亚砜(v/v)、pH7.2的溶液为细胞冻存保护液，按照实施例1提供的降温曲线，将细胞保存于液氮中。30天后复苏细胞，细胞复苏方法采用实施例1提供的方法，比较两组细胞成活率的差异。结果见表4。
表4
结果表明，两组细胞复苏后的成活率无显著性差异，本发明的细胞冻存保护液完全可以替代含二甲基亚砜组细胞冻存保护液，应用于哺乳动物传代细胞的冷冻保存。
实施例5本发明细胞冻存保护液对不同种类细胞保护作用的评价
分别制备sv-1，MRC-5，MDCK，BHK-21，PK-15，FL，VERO，RK_13前述8种细胞的单层细胞，采用实施例1确定的最优选的细胞冻存保护液及降温程序，将上述细胞分别保存于液氮中；30天后复苏细胞，采用实施例1提供的方法复苏细胞，比较不同种类细胞的成活率。结果见表5。
表5
结果表明，本发明的细胞冻存保护液分别在二倍体细胞株(sv-1株、MRC-5株)中及传代细胞系(MDCK、BHK-21、PK-15、FL、VERO、RK_13)中对细胞的保护作用相同，差异不显著。
实施例6本发明细胞冻存保护液对细胞保护作用的稳定性研究
以SV-1株细胞为例，制备sv-1株单层细胞，细胞代次为27代，采用实施例1确定的最优选的细胞冻存保护液及降温程序，将细胞保存于液氮中。采用实施例1提供的方法，分别于0，3，6，9，12，24个月复苏细胞并盲传；同时设对照组，对照组采用的细胞冻存保护液为含有浓度20％牛血清(v/v)、10％二甲基亚砜(v/v)、69％MEM基础液(v/v)、pH7.2的细胞冻存液，按照实施例1提供的降温曲线，将细胞保存于液氮中，采用实施例1提供的方法，复苏对照组细胞。比较不同时间复苏的细胞的成活率、增殖周期、盲传代次，并与对照组相比较。结果见表6
表6
结果表明，本发明的细胞冻存保护液按照本发明实施例1的冻存方法冻存细胞，在考察期内各取样时间点制备的细胞在成活率方面无显著性差异。在细胞增殖周期及盲传代次方面无显著性差异，且同对照组无差异。上述结果说明本发明细胞冻存保护液可以长期保存细胞，保存期限至少2年。
实施例7本发明细胞冻存保护液对细胞的病毒敏感性影响的研究
以SV-1株细胞及VERO细胞为例，分别制备sv-1细胞及VERO细胞的单层细胞，细胞代次分别为sv-1细胞27代、VERO细胞135代，采用实施例1确定的最优选的细胞冻存保护液(即实施例1中的配方2)及降温程序，将上述细胞分别保存于液氮中；同时设对照组，对照组采用的细胞冻存保护液为含有浓度20％牛血清(v/v)、10％二甲基亚砜(v/v)、69％MEM基础液(v/v)、pH7.2的细胞冻存液，按照实施例1提供的降温曲线，将sv-1及VERO细胞分别保存于液氮中。采用实施例1提供的方法，复苏试验组和对照组细胞，sv-1细胞的试验组与对照组均盲传至53代并分别于27、33、38、43、48、53代按相同的MOI接种水痘病毒，VERO细胞的试验组与对照组均盲传至172代并分别于135、142、150、157、164、172代按相同的MOI接种麻疹病毒，比较试验组与对照组相同代次细胞的病毒培养物的感染性滴度。结果见表7、表8。
表7
表8
结果表明，试验组和对照组间的不同代次细胞病毒培养物滴度结果无显著性差异，说明本发明细胞冻存保护液在细胞冻存及液氮保存过程中不影响细胞对病毒的敏感性。