茶多酚与壳聚糖配伍用于制备猪精液保存用稀释液的应用的制作方法

本发明涉及用于制备猪精液常温保存的茶多酚与壳聚糖配伍稀释液配方及其最佳配伍浓度，可有效提高精液保存效果，并能有效降低精液中细菌的含量，提高精液中抗氧化酶的活性。

背景技术：

猪精液的常温保存有效的延长了精子的体外保存时间，切实提高良种公猪的种用价值，降低生殖系统疾病的发生，促进猪人工授精技术的发展和应用。由于常温保存稀释粉配方是决定猪精液常温保存效果的关键，而目前国内猪精液常温保存稀释粉配方仍无法完全打破国外的垄断，因而猪精液的常温保存需要更加高效稳定的稀释粉。但是，稀释粉配方中所用保护剂的种类及用量是决定精液稀释后保存效果的核心，且与其他成分的比例及配伍将直接关系到保存后精子的生理状态和活性。

活性氧(ROS)是细胞需氧代谢过程中产生的不稳定代谢产物(任俊玲等2013)。哺乳动物精液本身存在一定的ROS防御系统(Awda et al.2009)，主要为酶类抗氧化系统，包括SOD、CAT和GSH-PX。虽然不同物种间的抗氧化酶活性不尽相同(Strzezek et al.2002)，但对于同一动物而言，SOD活性能反映整个系统抗氧化酶的水平，SOD活性越高，抗氧化能力越强。虽然CAT和GSH-PX在SOD清除自由基的过程中发挥协助作用，但CAT和GSH-PX活性也从侧面反映该系统的抗氧化水平(Orzolek et al.2013)。因此，实验室检测细胞代谢系统中抗氧化水平通常采用SOD、CAT和GSH-PX试剂盒检测其活性。H₂O₂是氧自由基的一种，过量的H₂O₂会对细胞造成损伤。对于精子细胞而言，会破坏精子的受精能力，因而机体内H₂O₂的含量也可以作为精子质膜过氧化损伤的检测指标。通过测定这些指标的变化，反映精子在稀释液环境中的生存情况。

精液的常温保存是一项在17℃条件下，通过添加稀释液来延长精子体外存活时间的技术。精子顶体蛋白酶在17℃能够达到最佳活性(Pinart 2013)。由于精子在17℃环境下能够进行正常的代谢活动，产生有害物质，因而稀释液中往往需要添加相应的抗氧化剂或其他药物，如青链霉素等，保持其微环境的相对稳定性。

技术实现要素：

本发明以茶多酚(TPP)和壳聚糖(CS)作为抗氧化剂的主要成分，通过联合添加不同浓度的茶多酚和壳聚糖，以稀释后精子的活率、质膜完整率、精液中的MDA含量、CAT活性、SOD活性、GSH-Px活性及细菌含量为评定指标，筛选茶多酚和壳聚糖的最佳配伍浓度，以保证猪精液在常温保存过程中维持良好的生物活性。

本发明提供了茶多酚与壳聚糖配伍作为猪精液常温保存用稀释液的应用。

本发明还提供了一种猪精液常温保存用稀释液，该常温保存稀释液包含茶多酚与壳聚糖。

进一步，本发明的猪精液常温保存用稀释液组分为：每1L所述猪精液常温保存用稀释液的配方为：茶多酚0.02g，壳聚糖0.05g，葡萄糖38g，柠檬酸钠6.5g，EDTA 1.2g，碳酸氢钠1g，柠檬酸0.25g，氯化钾0.6g，β-环糊精0.9g，其余为超纯水。

本发明的猪精液常温保存的抗氧化剂，由于采用了茶多酚与壳聚糖配伍作为抗氧化剂，两者之间存在依赖性的协同关系，适当浓度的茶多酚与壳聚糖配伍能够在猪精液常温保存过程中很好地保护猪精子的生理活性。

附图说明

图1为不同浓度的茶多酚-壳聚糖配伍对常温(17℃)保存猪精液SOD活性的影响；

图2为不同浓度的茶多酚-壳聚糖配伍对常温(17℃)保存猪精液CAT活性的影响；

图3为不同浓度的茶多酚-壳聚糖配伍对常温(17℃)保存猪精液GSH-PX活性的影响；

图4为不同浓度的茶多酚-壳聚糖配伍对常温(17℃)保存猪精液细菌含量的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行进一步的详细说明。

按照本发明的技术方案，本实施例给出一种用于猪精液常温保存的茶多酚与壳聚糖配伍稀释液配方。其中：

稀释液的配方为：茶多酚0.02g/L，壳聚糖0.05g/L，葡萄糖38g/L，柠檬酸钠6.5g/L，EDTA 1.2g/L，碳酸氢钠1g/L，柠檬酸0.25g/L，氯化钾0.6g/L，β-环糊精0.9g/L(表1)。

表1茶多酚与壳聚糖配伍稀释液配方

试验具体过程如下：

根据表1的稀释液配方，称取38g葡萄糖，6.5g柠檬酸钠，1.2g EDTA，1g碳酸氢钠，0.25g柠檬酸，0.6g氯化钾，0.9gβ-环糊精，分别称取0g、0.01g、0.02g、0.04g茶多酚和0g、0.05g、0.1g壳聚糖。茶多酚与壳聚糖按照表2配伍方案添加，于250mL灭菌烧杯中溶解后定容于1000mL容量瓶，1h后在无菌操作台中用无菌过滤器配合0.22μm滤菌膜过滤溶液，即得到茶多酚与壳聚糖的质量浓度，配制好的稀释液待用。

表2茶多酚和壳聚糖配伍稀释液配方

本试验所用猪精液来自20月龄杜洛克种公猪。将利用手握法采集到的精液过滤后放入保温箱，迅速带回实验室。选取色泽和气味正常，精子活率在85％以上的精液待用。

取2mL精液于无菌10mL离心管中，再缓慢添加稀释液至管口，4层毛巾包裹离心管，待精液温度与室温接近时放入17℃恒温箱中保存6d，每隔12h缓慢翻动精液1次，每隔24h检查精子活率(以精子活率为60％的天数为有效保存时间)、质膜完整率；分别在精液保存0、2、4、6d时检测精液中的细菌含量。每个处理重复3次。

精子活率、质膜完整率、SOD活性、CAT活性、GSH-Px活性及细菌含量的测定结果以表和的图形式表示。

表3不同剂量的茶多酚和壳聚糖配伍后的猪精子活率(％)

表4不同剂量的茶多酚和壳聚糖配伍后的猪精子质膜完整率(％)

由表3可以看出，除T₃C₂和T₃C₀外，其他配伍处理组精子有效保存时间均能达到6d，且保存6d时精子活率与对照组差异显著(P＜0.05)；T₂C₁组在整个保存过程中精子活率最高，且显著高于单独添加茶多酚或壳聚糖处理组；保存6d时精子活率为67.40％，显著高于其他各组(P＜0.05)。随着组合浓度的增加，高浓度组T₃C₂保存6d时精子活率最低，因此该浓度组合不利于精液保存。

由表4可以看出，精子质膜完整率随保存时间降低，常温保存1d时各处理组质膜完整率差异不显著(P＞0.05)；从保存第2d开始，联合添加茶多酚与壳聚糖的处理组精子质膜完整率显著高于单独添加茶多酚的处理组；常温保存2～5d，除T₃C₂外其余处理组质膜完整率显著高于对照组(P＜0.05)，但处理组间大多差异不显著(P＞0.05)；保存6d后，T₂C₁组质膜完整率最高，显著高于单独使用茶多酚处理组(P＜0.05)，但与单独使用壳聚糖处理组差异不显著(P＞0.05)，T₃C₂处理组质膜完整率最低，显著低于其他处理组(P＜0.05)。

由图1可以看出，各处理组SOD活性随保存时间降低，保存2d后T₁C₂、T₂C₁、T₂C₂组均高于单独添加茶多酚和壳聚糖的T₀C₂和T₃C₀组，但差异不显著(P＞0.05)；保存4d后T₂C₁组依然保持最高SOD活性，但差异不显著(P＞0.05)；保存6d后SOD活性最高的两组为T₂C₁和T₂C₂，且显著高于其他处理组(P＜0.05)，其中T₂C₁高于T₂C₂，但两组间差异不显著(P＞0.05)。

由图2可知，T₂C₁处理组有助于提高猪精液常温保存中CAT活性。通过3次测量数据表明，T₂C₁处理组的CAT活性显著高于单独添加茶多酚和壳聚糖的T₀C₂和T₃C₀组(P＜0.05)，略高于T₁C₂、T₂C₂两组，但差异不显著(P＞0.05)。单独添加茶多酚组，CAT活性高于单独添加壳聚糖组，但差异不显著(P＞0.05)。总体而言，联合添加茶多酚与壳聚糖的效果要优于单独添加效果。T₂C₁对提高CAT活性效果最好，最佳浓度组合为0.02g/L TPP+0.05g/L CS。

由图3可知，GSH-PX活性随保存时间变化较大，在保存过程中，T₃C₀组效果好于T₀C₂和对照组，但差异不显著(P＞0.05)。T₂C₁处理组能提高GSH-PX活性，且效果最好，但与其他组差异不显著(P＞0.05)。

由图4可知，精液中细菌含量随精液保存时间而变化，0～2d增长较为缓慢，2～4d增长速度最快，4～6d增长速度又相对放缓，其中精液保存0～4d期间，复合剂抗菌效果优于单独添加两种物质，但差异不显著(P＞0.05)。精液保存6d后，对照组精液细菌含量远高于其他处理组(P＜0.05)，配伍组T₁C₁细菌含量高于单独添加茶多酚和壳聚糖处理组(P＜0.05)，而T₂C₁显著低于单独添加两种物质处理组(P＜0.05)，且随着组合浓度的增加，精液中细菌含量逐渐减少，高浓度组合处理组T₃C₂细菌含量最少。

与现有的猪精液常温保存用稀释液相比较，本研究所使用的稀释液同时含有茶多酚与壳聚糖，这是本研究的创新点。该研究结果表明，联合添加适量的茶多酚与壳聚糖(例如上述实施例中为0.02g/L茶多酚与0.05g/L壳聚糖)可以显著提高猪精子的常规参数(精子活率、质膜完整率)，有效保存时间长达6d。除此之外，本发明研究发现，合适浓度的茶多酚与壳聚糖配伍不仅仅能够提高精子的抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-PX)活性，从而保护精子免受氧化损伤，而且还可以降低细菌在猪精液常温保存过程中的增殖速度，为猪精子在常温保存过程中拥有良好的微环境提供了保障。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可根据上述说明加以改进和变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围，并且这些改进和变换使得T₂C₁组即0.02g/L茶多酚与0.05g/L壳聚糖配方下的保存效果相对于现有的技术水平不可预料。