本发明涉及一种高效筛选抗旱苜蓿品种的方法。
背景技术：
筛选具有较强抗旱能力的苜蓿品种对进一步挖掘和利用优异抗旱苜蓿种质资源具有重要意义。以往常用的抗旱苜蓿品种筛选方法多是通过测定田间指标或者结合若干生理指标，并采用一些公认的评定方法如直接比较法、总抗旱性评价法、隶属函数法、层次分析法(AHP)、主成分分析法和灰色关联度模型等对苜蓿品种进行不同抗旱级别的划分，从中筛选出一些抗旱的苜蓿品种。目前，对苜蓿抗旱性的评价方法众多、不统一，而这种不统一的评价方法导致了“一种苜蓿多重身份”的现象，这对进一步筛选较强抗旱能力苜蓿品种及深入挖掘其优良抗旱基因的研究很不利。因此，有必要进一步开发更加准确简单的筛选较强抗旱苜蓿品种的方法，以挖掘和利用抗旱品种自身优良的抗逆基因。
PEG模拟干旱胁迫结合测定若干生理指标的方法能够有效地筛选出大量的抗旱苜蓿品种。李崇巍等（2002）在室内采用PEG模拟干旱胁迫研究了21个苜蓿品种的抗旱性，结果表明随水分胁迫加重，苜蓿叶片的膜透性增加，活性氧的氧化伤害加剧，根系活力下降，在-0.8 MPa的PEG胁迫下，苜蓿的细胞膜即受到明显伤害，且品种间差异显著。吴晓丽等（2008）运用灰色关联分析法，对5项抗旱指标与5个紫花苜蓿品种抗旱性的相关性进行了分析，结果表明各指标对苜蓿抗旱性的影响，以游离脯氨酸含量最大，其次为 SOD 及 POD，再次相对含水量，而叶片水势的影响最小。穆怀彬等（2011）用5种不同水势（0、-0.3、-0.6、-0.9和-1.2 MPa）的PEG-6000溶液对10个苜蓿品种幼苗进行模拟干旱胁迫，比较其幼苗期的抗旱性。测定细胞膜透性，丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）和类胡萝卜素（Car）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）活性等生理指标，结果表明，细胞膜透性及丙二醛含量在-0.3 MPa水势时与对照相比变化不大，而脯氨酸含量与SOD活性均在-0.3 MPa水势时下降。结果表明苜蓿幼苗在-0.3 MPa水势下几乎没有受到干旱胁迫的伤害，而在-0.9 MPa水势时，各测试指标的变化趋势均出现了明显的转折点，说明-0.9 MPa是苜蓿幼苗耐旱的关键水势点，同时苜蓿幼苗耐旱的极限在一个适当的阈值内。
以上技术虽通过PEG模拟干旱胁迫结合测定某些生理指标的方法筛选了抗旱苜蓿品种，同时确定了苜蓿幼苗抗旱的关键水势点及与苜蓿抗旱性相关的生理指标，但以上筛选方法未考虑不同PEG浓度胁迫下不同抗旱能力苜蓿品种敏感性生理指标体系不同，也缺乏极端干旱胁迫条件下，不同抗旱级别能力苜蓿品种间耐受能力的比较，以及反映苜蓿品种强抗旱性的敏感性生理指标筛选，故难以准确筛选出耐旱性较强的苜蓿品种。
技术实现要素：
本发明提供了一种高效筛选抗旱苜蓿品种的方法。能够准确筛选出耐旱性较强的苜蓿品种。
本发明提供一种高效筛选抗旱苜蓿品种的方法，包括以下步骤：
（1）苜蓿幼苗培养；
（2）用含0.38 g/mL和0.43g/mL PEG-6000溶液的Hoagland营养液模拟干旱胁迫，对生长40-45d的苜蓿幼苗根际胁迫处理7d；
（3）分别测定2个PEG-6000浓度胁迫下苜蓿的下列生理指标：
1）0.38 g/mL PEG-6000溶液胁迫时，测定羟自由基浓度和过氧化氢酶活性；
2）0.43g/mL PEG-6000溶液胁迫时，测定可溶性糖含量、叶绿素含量、POD活性、叶片相对含水量、还原性抗坏血酸含量、丙二醛和超氧阴离子自由基；
（4）根据不同浓度的PEG-6000溶液胁迫下各生理指标的敏感阈值，筛选抗旱苜蓿品种：
1）0.38 g/mL PEG-6000溶液胁迫时，若苜蓿体内羟自由基浓度低于4143.99 A·1000·g-1，CAT活性高于251.46 U·g-1·min-1；
2）0.43g/mL PEG-6000溶液胁迫时，若苜蓿体内的可溶性糖含量高于20.94 mg·g-1、Chl b高于1.51 mg·g-1、Chl(a+b) 高于2.45 mg·g-1、POD活性高于584.32 U·g-1·min-1、叶片相对含水量高于29.45%、还原性抗坏血酸含量高于214.68μg·g-1、丙二醛低于0.14μmol·g-1、超氧阴离子自由基含量低于146.98 nmol·g-1·min-1；
同时满足1）、2）指标体系及阈值范围，则为抗旱苜蓿品种。
作为优选，步骤（1）中所述苜蓿幼苗培养是将供试苜蓿种子播种在营养钵内，出苗后间苗，生长期间浇灌Hoagland营养液。
本发明采用2个极高浓度的PEG-6000溶液模拟强干旱胁迫环境结合测定苜蓿对抗旱性贡献较大的生理指标，通过比较不同抗旱苜蓿品种对高浓度PEG胁迫的耐受能力及相应的敏感性生理指标变化阈值，准确、高效地筛选抗旱苜蓿品种。
本发明方法采用2个极高浓度的PEG-6000胁迫结合测定对苜蓿抗旱性反应最敏感的生理指标，确定出不同浓度PEG胁迫下，反映抗旱能力苜蓿品种的敏感性生理指标体系及相应的生理指标敏感阈值，可进一步简单、准确地从苜蓿种质中筛选出抗旱苜蓿品种，也可为进一步挖掘和利用较强抗旱苜蓿品种自身的抗逆基因提供参考方法，具有一定的实用性和可靠性。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1
一种高效筛选抗旱苜蓿品种的方法，步骤如下：
（1）苜蓿幼苗培养。可以采用现有技术中任何苜蓿幼苗培养方法进行培养，比如采用营养液沙培法。将供试苜蓿种子播种在营养钵内，出苗后间苗，生长期间浇灌Hoagland营养液；
（2）用含0.38 g/mL(-1.6 MPa)和0.43g/mL (-2.0 MPa)PEG-6000溶液的Hoagland营养液模拟干旱胁迫，对生长6周左右的苜蓿幼苗根际胁迫处理7d；
（3）分别测定2个PEG-6000浓度胁迫下，苜蓿的下列生理指标；
1）0.38 g/mL PEG-6000溶液胁迫时，测定羟自由基（OH•）浓度和过氧化氢酶（CAT）活性；
2）0.43g/mL PEG-6000溶液胁迫时，测定可溶性糖含量、叶绿素含量、POD活性、叶片相对含水量（RWC）、还原性抗坏血酸（AsA）含量、丙二醛（MDA）和超氧阴离子自由基（O2•-）；
（4）根据不同浓度的PEG-6000溶液胁迫下各生理指标的敏感阈值，筛选抗旱苜蓿品种：
1）0.38 g/mL PEG-6000溶液胁迫时，若苜蓿体内羟自由基（OH•）浓度低于4143.99 A·1000·g-1，CAT活性高于251.46 U·g-1·min-1；
2）0.43g/mL PEG-6000溶液胁迫时，若苜蓿体内的可溶性糖含量高于20.94 mg·g-1、Chl b高于1.51 mg·g-1、Chl(a+b) 高于2.45 mg·g-1、POD活性高于584.32 U·g-1·min-1、叶片相对含水量（RWC）高于29.45%、还原性抗坏血酸（AsA）含量高于214.68μg·g-1、丙二醛（MDA）低于0.14μmol·g-1、超氧阴离子自由基（O2•-）含量低于146.98 nmol·g-1·min-1；
同时满足1）、2）指标体系及阈值范围，则为抗旱苜蓿品种。
实施例2
本实验以长期生长于年降雨量200~350mm，年蒸发量1531mm，年平均气温 6.3℃，年日照时数 2500 h，无霜期平均为 140 d的黄土高原陇中干旱区域的强抗旱苜蓿品种陇中苜蓿为例，采用PEG-6000模拟干旱胁迫，测定其响应干旱胁迫时反应较敏感的生理指标，步骤如下：
（1）陇中苜蓿幼苗培养。采用营养液沙培法。将供试苜蓿种子播种在营养钵内，出苗后间苗，生长期间浇灌Hoagland营养液；
（2）用含0.38 g/mL(-1.6 MPa)和0.43g/mL (-2.0 MPa)PEG-6000溶液的Hoagland营养液模拟干旱胁迫，对生长6周左右的苜蓿幼苗根际胁迫处理7d；
（3）分别测定2个PEG-6000浓度胁迫下，反映陇中苜蓿抗旱性的生理指标，包括：叶绿素a(Chl a)、叶绿素b( Chl b) 、叶绿素(a+b)、叶片相对含水量（RWC）、脯氨酸含量（Pro）、可溶性蛋白含量（SP）、可溶性糖含量（SS）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）含量、羟自由基含量（OH·）、 超氧阴离子自由基（O2·-）、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、还原性抗坏血酸（AsA）含量、还原性抗坏血酸（GSH）含量。
（4） 主成分分析法分析陇中苜蓿响应干旱胁迫时反应最敏感的生理指标。
1） 0.38 g/mL PEG-6000溶液胁迫时，陇中苜蓿前2个主成分的贡献率分别为68.38%和31.62%，累积方差贡献率为100%，表明前2个主成分可将陇中苜蓿100%的抗旱性信息反映出来。第一主成分对应较大的特征向量有Chl b、RWC、OH• 和Chl (a+ b)；第二主成分对应较大的特征向量有 CAT；
2）0.43 g/mL PEG-6000溶液胁迫时，陇中苜蓿前2个主成分的贡献率分别为60.12%和39.88%，累积方差贡献率为100%，表明前2个主成分可将陇中苜蓿100%的抗旱性信息反映出来。第一主成分对应较大的特征向量有SS、Chl b、Chl( a+b)和POD；第二主成分对应较大的特征向量有 RWC、MDA、O2•-和AsA。
（5）确定陇中苜蓿响应干旱胁迫时反应最敏感的生理指标的含量。
1）0.38 g/mL PEG-6000溶液胁迫时，陇中苜蓿体内羟自由基（OH•）浓度为4143.99 A·1000·g-1，CAT活性为251.46 U·g-1·min-1；
2）0.43g/mL PEG-6000溶液胁迫时，苜蓿体内的可溶性糖含量为20.94 mg·g-1、Chl b为1.51 mg·g-1、Chl(a+b)为2.45 mg·g-1、POD活性为584.32 U·g-1·min-1、叶片相对含水量（RWC）为29.45%、还原性抗坏血酸（AsA）含量为214.68μg·g-1、丙二醛（MDA）为0.14μmol·g-1、超氧阴离子自由基（O2•-）含量为146.98 nmol·g-1·min-1。
（6）不同PEG浓度胁迫下筛选抗旱苜蓿品种的生理指标体系及相应的阈值范围。
1）0.38 g/mL PEG-6000溶液胁迫时，苜蓿体内羟自由基（OH•）浓度低于4143.99 A·1000·g-1，CAT活性高于251.46 U·g-1·min-1；
2）0.43g/mL PEG-6000溶液胁迫时，苜蓿体内的可溶性糖含量高于20.94 mg·g-1、Chl b高于1.51 mg·g-1、Chl(a+b) 高于2.45 mg·g-1、POD活性高于584.32 U·g-1·min-1、叶片相对含水量（RWC）高于29.45%、还原性抗坏血酸（AsA）含量高于214.68μg·g-1、丙二醛（MDA）低于0.14μmol·g-1、超氧阴离子自由基（O2•-）含量低于146.98 nmol·g-1·min-1；
陇中苜蓿同时满足1）、2）指标体系及阈值范围，为抗旱苜蓿品种。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。