筛选方法与流程

本申请是申请号为“2012800239740”、申请日为2012年3月16日、发明名称为“筛选方法”的发明专利申请(pct申请号为pct/nz2012/000041)的分案申请。

本发明涉及用于筛选、鉴定和/或应用在给植物赋予有利性质中使用的微生物的方法。

背景技术：

地理学、环境条件、疾病和被昆虫攻击是影响有活力地生长且栽培不同植物物种的能力的主要因素。此类因素可对全世界的社区具有显著的下游环境和社会影响。在鉴定这样的产品和方法中将存在利益，所述产品和方法可能给植物物种赋予有利性质，以例如允许它在多个地理位置中、在不同天气条件下生长，经受住疾病且对通过昆虫的攻击有抵抗作用。

为此已使用选择育种技术。选择育种原则上依赖与选择偶联的起始群体中的遗传多样性，以达到具有对于人使用有利的特征的植物栽培品种。因为可用的、从未用过的可栽培植物物种的遗传多样性已减少，所以关于改善的潜力已降低。这种情况已刺激植物遗传修饰的增长，其中来自紧密相关物种的基因被基因渗入新栽培品种内，以提供用于将期望性状赋予新栽培品种的新遗传基础。然而，这个过程非常昂贵、缓慢、在其范围中有限且充满调节困难。过去二十年对这项技术的大规模投资最终发生少数商业成功。

尽管高生产作物的常规育种和转基因作物的开发的数十年成功科学研究，但相对很少的研究努力已针对经由其他方法的改善植物生长和存活的开发。

经由堆肥、复合生物材料肥料例如血液和骨为植物提供具有丰富微生物多样性的“良好”土壤以确保植物健康生长的重要性已被家庭园丁和有机食品的生产者理解。然而，本发明人已认识到，支持可观察到的利益的植物-微生物结合的复杂性知之甚少。在此类土壤中对植物生长和健康的利益通常是通过改善的营养物可用性由微生物介导的。这可能是来自土壤生物质自身的矿物质增溶的结果，或来自植物由微生物内生、附生或根际结合中定殖的结果，从而导致固氮、通过在植物内的直接微生物竞争对害虫和疾病的抗性、或植物防御反应的引发。科学团体已产生关于内生、附生和根际植物微生物结合的多样机制的文献，很大程度上与作物植物及其土壤有关。一些结合的性质是已知的，包括植物诱导的通过特定微生物的代谢产物生产和微生物对植物(例如内生真菌属物种(neotyphodiumspp))中的基因表达的相反影响的遗传基础，并且在微生物应用于某些作物植物或种子后在植物生长中的增加已得到证明。然而，尽管微生物具有改善植物生长的潜力，但商业成功局限于相对小范围的特定微生物例如根瘤菌(rhizobium)属物种对豆科植物种子的应用，或起因于“不受控制的”微生物发酵例如堆肥茶、海藻发酵、鱼废物发酵等的产物的使用。

存在与特定植物栽培品种相关的潜在有利的微生物的许多特定菌株，使发现合适的菌株用于任何具体作物的任务成为非常繁重的程序。目前方法主要集中于微生物单独或有限组合的应用。此类微生物可能已基于其身份(identity)选择用于特定潜在性质。如果对于成功而言不要求微生物身份的了解，那么它将是有用的。

本文提及的出版物的文献目录细节在说明书结尾处收集。

技术实现要素：

发明目的

本发明的目的是提供用于选择在给植物赋予有利性质中有用的一种或多种微生物的方法，所述方法克服或改善已知方法的至少一个缺点。

作为另外一种选择，本发明的目的是提供用于帮助一种或多种植物改善的方法和/或系统。

作为另外一种选择，目的是至少为公众提供有用的选择。

发明陈述

在本发明的第一个广泛方面，提供了用于选择能够给植物赋予一种或多种有利性质的一种或多种微生物的方法，该方法包括至少下述步骤：

a)在一种或多种微生物的存在下对一种或多种植物(包括其种子、幼苗、插枝和/或繁殖体)实施生长培养基；

b)在步骤a)过程中应用一种或多种选择压力；

c)在步骤b)后选择一种或多种植物；和

d)从步骤c)中选择的所述一种或多种植物中分离一种或多种微生物。

在一个实施例中，一种或多种微生物选自本文下文详述的微生物。

在一个实施例中，生长培养基选自本文下文详述的生长培养基。

在一个实施例中，对一种或多种植物实施生长培养基的步骤涉及生长或繁殖该植物。

在一个实施例中，在步骤b)中应用一种选择压力。

在一个实施例中，选择压力是生命的，并且包括但不限于暴露于对植物有害的一种或多种生物体。在一个实施例中，生物体包括真菌、细菌、病毒、昆虫、螨虫和线虫。

在另一个实施例中，选择压力是无生命的。无生命的选择压力包括但不限于暴露于下述或下述水平的变化：盐浓度、温度、ph、水、矿物质、有机营养物、无机营养物、有机毒素、无机毒素和金属。

在一个实施例中，选择压力在基本上对一种或多种植物实施生长培养基和一种或多种微生物的整个时间过程中应用。在一个实施例中，选择压力在基本上一种或多种植物的整个生长期过程中应用。作为另外一种选择，选择压力在不连续时间点应用。

在一个实施例中，基于一种或多种表型性状选择一种或多种植物。在一个优选实施例中，基于期望表型性状的存在选择一种或多种植物。在一个实施例中，表型性状是本文下文详述的那些之一。

在一个实施例中，从选择的一种或多种植物的根、茎和/或叶(包括生殖)组织中分离一种或多种微生物。作为另外一种选择，从选择的一种或多种植物的全植物组织中分离一种或多种微生物。

在一个实施例中，在发芽后的任何时间从一种或多种植物中分离一种或多种微生物。

在一个实施例中，当两种或更多种微生物在步骤d)中分离时，该方法还包括将两种或更多种微生物分成个别分离物、选择两种或更多种个别分离物和随后组合选择的两种或更多种分离物的步骤。

在另一个实施例中，该方法还包括重复步骤a)至d)一次或多次，其中在步骤d)中分离的一种或多种微生物在序贯重复的步骤a)中使用。

在另一个实施例中，该方法还包括重复步骤a)至d)一次或多次，其中当在步骤d)中分离两种或更多种微生物时，将两种或更多种微生物分成个别分离物，选择和随后组合两种或更多种个别分离物，并且组合的分离物在序贯重复的步骤a)中使用。相应地，当提及在该方法的步骤a)中使用在步骤d)中分离的一种或多种微生物时，应考虑包括使用本发明的这个实施例的组合分离物。

在一个实施例中，在步骤a)至d)的序贯重复中应用的一种或多种选择压力是不同的。在另一个实施例中，在步骤a)至d)的序贯重复中应用的选择压力是相同的。

在一个实施例中，该方法还包括在步骤a)前进行的下述步骤：在一种或多种微生物的存在下对一种或多种植物(包括其种子、幼苗、插枝和/或繁殖体)实施生长培养基，并且在所需时期后，从所述一种或多种植物中分离一种或多种微生物。在优选实施例中，在过程的步骤a)中使用从一种或多种植物中分离的一种或多种微生物。在一个实施例中，这个步骤可在步骤a)前进行两次或更多次。

在本发明的另一个实施例中，当一种或多种微生物与植物形成允许从一代或一个繁殖体垂直传递到下一代或下一个繁殖体的结合时，步骤d)可在该方法中不存在或替换为繁殖来自步骤c)的所选植物的步骤。相应地，本发明还提供了用于选择具有一种或多种微生物的一种或多种植物的方法，所述微生物能够给一种或多种植物赋予一种或多种有利性质。本发明还提供了通过此类方法选择的植物。

在另一个实施例中，可分开执行本发明的两种或更多种方法，并且组合在每种分开的方法的步骤d)中分离的一种或多种微生物。在一个实施例中，当执行本发明的其它方法时，在步骤a)中使用组合的微生物。

在第二个广泛方面，提供了用于帮助一种或多种植物的改善的方法，其包括在一种或多种微生物和/或组合物的存在下安排所述植物的评估。

根据一个实施例，植物用于在第一区域中生长。微生物可存在于或不存在于(或至少至显著程度)第一区域中。

“区域”和“第一区域”广泛解释为意指土地的一个或多个地区。陆地地区可通过地理/政治/私人地界或通过具有相似性质例如气候、土壤性质、特定害虫的存在的陆地地区等限定。

优选地，评估在其中存在微生物的第二区域中执行，但这决不是必需的。微生物可得自其他来源包括微生物保藏所且与植物材料和/或土壤人工结合。此外，虽然植物可以基本上常规的方式但在具有通常与植物不结合的微生物的区域中、至少在第一区域中培养，但可以可替代地使用人工生长环境，如本领域技术人员应当理解的。因此，可鉴定通常不一定利用的可能的有利微生物/植物关系。

优选地，安排步骤包括安排下述中的一种或多种：

-待评估的一种或多种植物或植物类型的身份的接受或传递；

-来自待评估的一种或多种植物或植物类型的植物材料的接受或传递；

-微生物和/或组合物的鉴定和/或选择；

-微生物和/或组合物的获得；和

-使微生物和/或组合物与植物材料结合。

优选地，该方法包括在所述微生物和/或组合物的存在下评估(或安排所述评估的)所述植物。

评估步骤优选包括执行本文描述的方法的一个或多个步骤，在特定实施例中，执行本发明的第一个方面、第七个方面或第八个方面的方法。

上文鉴定的多个步骤可通过单一实体执行，尽管优选涉及至少两方，即作出请求的第一方和实现该请求的第二方。应当指出多种试剂可对于一方或两方实现，并且可使用不同水平的自动化。例如，响应特定请求，微生物可通过基于已知微生物与那种或相似植物的结合查询数据库的处理器进行选择，需要来自操作者的很少输入或无输入。

此外，评估可通过查询方和/或在第一区域中执行。在第一区域中执行评估更好地确保评估是准确的，并且不考虑可能影响植物或微生物的并非不可预见的环境因素。

在评估后或其过程期间，该方法优选还包括下述中的一个或多个：

-对第一区域接受或发送一种或多种微生物(或至少其身份)和/或组合物，包括与植物材料组合；和

-在所述微生物和/或组合物的存在下在第一区域中生长所述植物或其他植物(优选具有相似性质)。

第二个方面的方法可通过第一方体现：

-鉴定关于植物中的改善的需要；

-将其身份和/或有关植物材料连同任何有关信息一起发送到第二方，和

-接受植物材料和/或一种或多种微生物和/或其身份和/或组合物。

接受步骤优选在植物/微生物和/或植物/组合物结合的评价后执行或由于所述评价而执行。优选地，评价使用如本文描述的方法进行，在特定实施例中，使用第一个方面、第七个方面或第八个方面的方法进行。

第二个方面的方法可另外或可替代通过第二方体现：

-从第一方接受植物的身份和/或有关植物材料连同任何有关信息，和

-将植物材料和/或一种或多种微生物和/或其身份和/或组合物发送给第一方。

发送步骤优选在植物/微生物和/或植物/组合物结合的评价后执行或由于所述评价而执行。优选地，评价使用本文描述的方法进行，在特定实施例中，使用第一个方面、第七个方面或第八个方面的方法进行。

根据第三个方面，提供了用于实现第二个方面的方法的系统。

第三个方面的系统优选包括下述中的一个或多个：

-用于接受或传递待评估的一种或多种植物或植物类型的身份的装置；

-用于接受或传递来自待评估的一种或多种植物或植物类型的植物材料的装置；

-用于鉴定和/或选择微生物和/或组合物的装置；

-用于获得微生物和/或组合物的装置；

-用于使微生物和/或组合物与植物材料结合的装置；

-用于在所述微生物和/或组合物的存在下评估所述植物的装置；

-用于对第一区域接受或发送一种或多种微生物(或至少其身份)和/或组合物的装置，包括与植物材料组合；和

-用于在所述微生物和/或组合物的存在下在第一区域中生长所述植物或其他植物(优选具有相似性质)的装置。

本领域技术人员已知的装置可用于提供在第三个方面的系统中需要的功能性。例如，常规通讯装置包括互联网可用于输送植物/微生物的身份；常规载体装置可用于输送植物材料/微生物/组合物；常规装置和过程可用于使微生物和/或组合物与植物材料结合，并且可使用用于评估所述植物和/或植物/微生物和/或植物/组合物结合的常规装置。

根据优选实施例，本发明的系统通过这样的设备体现，所述设备配置为传递植物中的改善的请求且随后接受植物材料和/或一种或多种微生物和/或其身份，优选在植物/微生物结合的评价后或由于所述评价。优选地，评价使用本文描述的方法进行，在特定实施例中，使用第一个方面、第七个方面或第八个方面的方法进行。

第二个方面的系统可另外或可替代地通过这样的设备体现：所述设备配置为接受植物的身份和/或有关植物材料连同任何有关信息；且发送植物材料和/或一种或多种微生物和/或其身份和/或组合物，优选在植物/微生物或植物/组合物结合的评价后或由于所述评价。优选地，评价使用本文描述的方法进行，在特定实施例中，使用第一个方面、第七个方面或第八个方面的方法进行。

根据本发明的第四个广泛范围，提供了通过如本文先前描述的方法选择或分离的微生物。

在本发明的第五个广泛方面，提供了用于生产支持植物生长和/或健康的组合物的方法，该方法包括本文先前描述的方法的步骤和组合通过该方法选择的一种或多种微生物与一种或多种另外成分的另外步骤。

在本发明的第六个广泛方面，提供了包含第四个广泛方面的一种或多种微生物或如通过第五个广泛方面的方法制备的组合物。

在本发明的第七个广泛方面，提供了用于选择能够给植物赋予一种或多种有利性质的组合物的方法，该方法包括至少下述步骤：

a)在一种或多种培养基中培养一种或多种微生物；

b)在一段时间后从一种或多种培养基中分离一种或多种微生物，以提供一种或多种组合物；

c)对一种或多种植物(包括其种子、幼苗、插枝和/或繁殖体)实施一种或多种组合物；

d)如果观察到给一种或多种植物赋予一种或多种有利性质，则选择一种或多种组合物。

在本发明的第八个广泛方面，提供了用于选择能够产生组合物的一种或多种微生物的方法，所述组合物能够给植物赋予一种或多种有利性质，该方法包括至少下述步骤：

a)在一种或多种培养基中培养一种或多种微生物；

b)在一段时间后从一种或多种培养基中分离一种或多种微生物，以提供一种或多种组合物；

c)对一种或多种植物(包括其种子、幼苗、插枝和/或繁殖体)实施一种或多种组合物；

d)选择与一种或多种组合物结合的一种或多种微生物，观察到所述一种或多种组合物给一种或多种植物赋予一种或多种有利性质。

应当理解第一个、第七个和第八个方面的方法可以任何组合相组合，包括在任何数目的迭代中与从个别或组合使用的方法中选择或分离且在任何一种方法的迭代循环中使用的组合物和/或微生物同时或序贯运行的方法。例如，可执行第七个方面的方法且选择组合物。组合物的选择指示，在步骤b)中从培养基中分离的一种或多种微生物对于给一种或多种植物赋予有利性质是期望的(因为一种或多种微生物能够产生所选组合物)。一种或多种微生物随后可在第一个、第七个或第八个方面的方法的另一轮中使用。作为另外一种选择，方法的组合可相反运行。这可以任何次序和组合重复任何次数。

在本发明的第九个广泛方面，提供了由于本发明的第七个或第八个广泛方面的方法而获得的组合物。

在本发明的第十个广泛方面，提供了通过如本文先前描述的方法选择或分离的两种或更多种微生物的组合。

在另一个方面，本发明提供了通过本发明的方法鉴定的一种或多种组合物和/或微生物用于给一种或多种植物赋予一种或多种有利性质的用途。

在一个实施例中，一种或多种微生物选自表2、3、5、6和7中列出的微生物。

在一个实施例中，一种或多种微生物选自表2、3和7中列出的微生物，并且有利性质是在氮缺陷或氮有限的生长培养基中的改善生长。在一个特定实施例中，微生物是杜擀氏菌属物种(duganellasp)。在另一个特定实施例中，使用节杆菌属物种(arthrobactasp)、杜擀氏菌属物种、不动杆菌属物种(acinetobactersp)、泛菌属物种(panteoasp)和寡养单胞菌属物种(stenotrophomonassp)的组合。

在一个实施例中，一种或多种微生物选自表5和6中列出的微生物，并且有利性质是在其中磷酸盐基本上仅以不可溶形式存在的生长培养基中的改善生长。

本发明还可以被广泛地说成由本申请的说明书中提及或指示的份、元件和特征个别或共同组成，以所述方、元件或特征中的两个或更多个的任何或所有组合，并且当在本文中提及在本发明所属领域中具有已知等价物的具体整数时，此类已知等价物视为合并入本文，如同个别阐述一样。

附图说明

应在所有其新型方面中考虑的本发明的这些和其他方面，由于下述说明参考附图将变得显而易见，所述说明仅作为例子给出，在所述附图中：

图1：显示了根据本发明的实施例的系统；

图2：显示了本发明的实施例的方法的工艺流程；

图3：在左侧上显示了在与5μl孔的液体微生物培养物一起温育前的平板，并且在右侧上平板显示了在28℃下24小时温育后的透明环绕假定磷酸盐增溶微生物区带(更多细节在实例11b中提供)。

具体实施方式

下文是以一般术语给出的本发明的优选形式的描述。本发明将根据下文提供的实例更多阐明。

在一个方面，本发明涉及用于选择一种或多种微生物的方法，所述微生物能够给植物赋予一种或多种有利性质。此类有利性质包括例如：改善的生长、健康和/或存活特征，对害虫和/或疾病的抗性，对在不同地理位置和/或不同环境生物学和/或物理条件中生长的耐受性。例如，本发明可允许鉴定微生物，所述微生物允许植物在多种不同温度(包括极端温度)、ph、盐浓度、矿物质浓度、在毒素的存在下生长，和/或更大程度地响应有机和/或无机肥料的存在。

如本文使用的，“改善的”应广泛视为包括在本发明应用前在一种或多种植物中可能已经存在的植物特征的改善，或在本发明应用前在一种或多种植物中不存在的特征的存在。例如，“改善的”生长应视为包括其中植物先前未知在有关条件下生长的植物的生长。

广泛地，该方法包括至少步骤a)在一种或多种微生物的存在下在生长培养基中生长一种或多种植物；b)在步骤a)过程中应用一种或多种选择压力；c)在步骤b)后选择一种或多种植物；和d)从步骤c)中选择的所述一种或多种植物中分离一种或多种微生物。一种或多种植物、生长培养基和一种或多种微生物可分开提供且在步骤a)前以任何合适的次序组合。本发明还提供了其中步骤a)至d)可重复一次或多次的迭代法，其中在步骤d)中分离的一种或多种微生物在该方法的下一个循环的步骤a)中使用。虽然相同选择压力可在该方法的每次迭代中应用，但不同选择压力可在每次迭代中应用。此外，该方法可包括更多步骤，其在步骤a)前进行并且包括在一种或多种微生物的存在下但无需选择压力，对一种或多种植物实施生长培养基。在所需时期后，一种或多种微生物可从所述一种或多种植物中分离且可用于该方法的步骤a)中。还应当理解可进行这个步骤的序贯循环，其中分离的微生物在过程的后续循环中使用，在开始如上所述的步骤a)至d)前。此外，本发明人设想了迭代法，其中步骤a)至d)重复一次或多次，但用对植物实施生长培养基和一种或多种微生物且分离微生物的步骤点缀，而无需应用选择压力。

应当理解，特别在本发明的迭代法的情况下，该方法不需要鉴定在步骤d)中从植物中分离的群体中的微生物，它们也不需要测定从植物中分离的个别微生物或微生物组合的有利性质。然而，需要时，可进行有利性质的鉴定和测定。例如，在一些情况下可优选在本发明的方法的最后步骤中分离且鉴定微生物，以测定其对于商业使用的安全性且满足管理需要。

在一个实施例中，当两种或更多种微生物在步骤d)中分离时，该方法还可包括将两种或更多种微生物分成个别分离物，选择两种或更多种个别分离物和随后组合选择的两种或更多种分离物的步骤。在一个实施例中，组合的分离物随后可在该方法的序贯循环的步骤a)中使用。例如，可组合二、三、四、五、六、七、八、九或十种个别分离物。本发明人设想了其中步骤a)至d)重复一次或多次的迭代法，使用分离、选择且与该方法的每次重复组合的这些另外步骤，或由其中不选择且组合个别分离物的方法点缀或另外与所述方法组合。

预期这些组合将检测到先前未知的、促进植物生长的、先前分离的微生物之间的协同相互作用。使用迭代步骤a)至d)将驱动两种或更多种微生物的起始群体仅朝向与植物相互作用以赋予表型的所需变化的微生物。

个别分离物的选择可基于任何合适的选择标准发生。例如，它可以是随机的，它可以基于通过执行本发明的方法观察到的一种或多种有利性质，或当关于微生物的身份的信息是已知的时，它可以是微生物先前已认识到具有特定有利性质的基础。

此外，本发明的两种或更多种方法可分开或平行执行，并且将起因于每种方法的微生物组合成单一组合物。例如，可执行两种分开的方法，一种鉴定能够赋予一种或多种第一有利性质的微生物，并且第二种鉴定能够赋予一种或多种第二有利性质的微生物。分开的方法可涉及鉴定具有相同有利性质或具有不同有利性质的微生物。在分开的方法中应用的选择压力同样可以是相同或不同的。类似地，在分开的方法中使用的微生物和植物可以是相同或不同的。如果希望微生物的更多最佳化，则微生物的单一组合物可应用于本发明的方法的一个或多个更多循环。作为另外一种选择，需要时，可使用微生物的单一组合物，以给植物作物赋予有关性质，而无需更多最佳化。以这种方式组合本发明的两种或更多种方法允许微生物的选择和组合，所述微生物通常可通过时间和/或空间在特定环境中分开。

还应理解当一种或多种微生物与植物形成允许从一代或一个繁殖体垂直传递到下一代或下一个繁殖体的结合时，步骤d)可在该方法中不存在或替换为繁殖来自步骤c)的所选植物的步骤，如本文下文更多讨论的。

本发明的更多方法和方面在本文下文描述。

微生物

如本文使用的，术语“微生物”应广泛考虑。它包括但不限于两个原核生物域，细菌和古细菌，以及真核生物真菌和原生生物。例如，微生物可包括变形菌门(proteobacteria)(例如假单胞菌属(pseudomonas)、肠杆菌属(enterobacter)、寡养单胞菌属、伯克霍尔德菌属(burkholderia)、根瘤菌属(rhizobium)、草螺菌属(herbaspirillum)、泛菌属、沙雷氏菌属(serratia)、拉恩氏菌属(rahnella)、固氮螺菌属(azospirillum)、固氮根瘤菌(azorhizobium)、固氮菌属(azotobacter)、杜擀氏菌属、戴尔福特菌属(delftia)、慢生根瘤菌属(bradyrhizobiun)、中华根瘤菌属(sinorhizobium)和嗜盐单胞菌属(halomonas))，厚壁菌门(firmicutes)(例如芽孢杆菌属(bacillus)、类芽孢杆菌属(paenibacillus)、乳杆菌属(lactobacillus)、支原体属(mycoplasma)和不动杆菌属(acetobacterium))，放线菌门(actinobacteria)(例如链霉菌属(streptomyces)、红球菌属(rhodococcus)、微杆菌属(microbacterium)和短小杆菌属(curtobacterium))，和真菌子囊菌门(ascomycota)(例如木霉菌属(trichoderma)、白粉寄生孢属(ampelomyces)、盾壳霉属(coniothyrium)、拟青霉属(paecoelomyces)、青霉属(penicillium)、枝孢菌属(cladosporium)、肉座菌属(hypocrea)、白僵菌属(beauveria)、绿僵菌属(metarhizium)、轮枝孢属(verticullium)、虫草菌属(cordyceps)、毕赫氏酵母属(pichea)和假丝酵母属(candida))，担子菌门(basidiomycota)(例如鬼伞属(coprinus)、伏革菌属(corticium)和伞菌属(agaricus))和卵菌门(oomycota)(例如腐霉菌属(pythium)、毛霉菌属(mucor)和被孢霉属(mortierella))。

在特定优选实施例中，微生物是内生菌或附生菌或居住于植物根际的微生物。

在本发明的方法中使用的微生物可从任何来源中收集。

在一个实施例中，微生物得自任何一般的陆地环境，包括其土壤、植物、真菌、动物(包括无脊椎动物)和其他生物区系，包括湖泊和河流的沉积物、水和生物区系；来自海洋环境、其生物区系和沉积物(例如海水、海洋泥浆、海生植物、海洋无脊椎动物(例如海绵动物)、海洋脊椎动物(例如鱼))；陆生植物和海洋岩石圈(风化层和岩石，例如破碎的地下岩石、沙和粘土)；低温层及其融水；大气层(例如滤过空气粉尘、云和雨滴)；都市、工业和其他人造环境(例如在混凝土、路旁排水沟、屋顶表面、道路表面上累积的有机和矿物质)。

在另一个实施例中，从可能有利于合适微生物选择的来源中收集微生物。例如，来源可以是其中期望其他植物生长的特定环境。在另一个例子中，来源可以是具有一种或多种期望性状的植物，例如在特定环境中或在特定目的条件下天然生长的植物。例如，某种植物可以在沙壤土或高盐度沙中、或在极端温度下、或使用很少的水天然生长，或者它可对环境中存在的某些害虫或疾病有抵抗作用，并且可期望商业作物在此类条件下生长，特别地如果它们是例如在特定地理位置中可用的唯一条件。作为更多例子，微生物可从下述中收集：在此类环境中生长的商业作物，或更具体而言在任何特定环境中生长的作物中最佳展示目的性状的个别作物植物，例如在盐度有限的土壤中生长的作物中最快生长的植物，或在暴露于严重虫害或疾病流行的作物中损害最少的植物。微生物可从目的植物或目的环境中出现的任何材料中收集，包括真菌及其他动物和植物生物区系、土壤、水、沉积物和如先前提及的其他环境元素。

在某些实施例中，微生物源自先前执行的本发明的方法(例如在方法的步骤d)中分离的微生物)，包括从步骤d)中分离的两种或更多种微生物中分离的个别分离物组合或起因于两种或更多种分开执行的本发明的方法的微生物组合。

虽然本发明避免关于微生物就特定植物物种而言的期望性质的预先存在知识的需要，但在一个实施例中，在本发明的方法中使用的微生物或微生物组合可基于其对植物的可能或预期利益的一些知识选自预先存在的个别微生物物种或菌株集合。例如，微生物可预测为：改善固氮；从土壤有机质中释放磷酸盐；从无机形式的磷酸盐(例如磷矿石)中释放磷酸盐；在根微球体中的“固定碳”；在植物的根际中居住，由此帮助植物吸收来自周围土壤的营养物且随后将这些更容易地提供给植物；增加植物根上的结节数目且由此增加共生固氮细菌(例如根瘤菌属物种)数目/植物和由植物固定的氮量；引发植物防御反应例如isr(诱导的全身抗性)或sar(全身获得性抗性)，其帮助植物抵抗病原微生物的侵袭和扩展；通过拮抗或资源例如营养物或空间的竞争利用与对植物生长或健康有害的微生物竞争。

在一个实施例中，微生物或微生物组合选自预先存在的个别微生物物种或菌株集合，其不提供其对植物的可能或预测利益的知识。例如，无需其改善植物生长或健康的能力的任何知识而从植物组织中分离的未经鉴定的微生物集合，或收集以探究其生产化合物的潜力的微生物集合，所述化合物可导致医疗用药的开发。

在一个实施例中，微生物从它们天然位于其中的来源材料(例如土壤、岩石、水、空气、粉尘、植物或其他生物体)中分离。考虑到其在本发明的方法中的预期用途，微生物可以任何合适形式提供。然而，仅作为例子，微生物可作为水性混悬液、凝胶、匀浆物、颗粒剂、粉末、浆料、活生物体或干燥材料提供。微生物可以在基本上纯或混合的培养物中分离。它们可进行浓缩、稀释或以它们在来源材料中发现的天然浓度提供。例如，通过将沉积物悬浮于淡水中且允许沉积物下降到底部，可分离来自盐水沉积物的微生物用于在本发明中使用。含有大量微生物的水可通过合适的沉降期后的倾析取出，并且或者直接应用于植物生长培养基，或者通过过滤或离心浓缩，稀释至合适浓度且应用于植物生长培养基，伴随大量盐的去除。作为更多例子，可类似地处理来自矿化或毒性来源的微生物，以回收微生物用于应用于植物生长材料，以使对植物的损害潜力降到最低。

在另一个实施例中，微生物以粗制形式使用，其中它们不从它们天然位于其中的来源材料中分离。例如，微生物与它们位于其中的来源材料组合提供；例如作为土壤、或植物的根或叶。在这个实施例中，来源材料可包括微生物的一个或多个物种。

优选在本发明的方法中使用微生物的混合群体。

在其中微生物从来源材料(例如，它们天然位于其中的材料)中分离的本发明的实施例中，技术人员容易已知的许多标准技术中的任何一种。然而，例如，这些一般采用单一微生物的固体或液体培养物可通过其以基本上纯的形式获得的过程，通常通过在固体微生物生长培养基的表面上的物理分离或通过体积稀释分离到液体微生物生长培养基内。这些过程可包括从干燥材料、液体悬浮液、其中材料在合适固体凝胶生长培养基上的薄层中铺展的浆料或匀浆物、或在无菌培养基内作出且接种到液体或固体培养基内的系列稀释的材料中分离。

虽然不是必需的，但在一个实施例中，含有微生物的材料可在分离过程前预处理，以便繁殖材料中的所有微生物，或选择微生物群体的部分，通过用微生物营养物(例如硝酸盐、糖或植物、微生物或动物提取物)富集材料，或通过应用确保仅在材料内的部分微生物多样性的选择存活的方法(例如通过将样品在60℃-80℃下巴氏灭菌10-20分钟，以选择对热暴露抗性的微生物(例如杆菌)，或通过使样品暴露于低浓度的有机溶剂或杀菌剂(例如25％乙醇10分钟)，以增强放线菌和产芽孢或溶剂抗性微生物的存活)。微生物随后可从经富集的材料或就选择存活处理的材料中分离，如上文。

在本发明的优选实施例中，从植物材料中分离内生或附生微生物。可使用本领域已知的任何数目的标准技术，并且可从植物中的任何合适组织中分离微生物，所述组织包括例如根、茎和叶、和植物生殖组织。例如，用于从植物中分离的常规方法一般包括目的植物材料(例如根或茎长、叶)的无菌切除，用合适溶液(例如2％次氯酸钠)表面灭菌，这之后将植物材料置于营养培养基上用于微生物生长(参见例如，strobelg和daisyb(2003)bioprospectingformicrobialendophytesandtheirnaturalproducts.microbiologyandmolecularbiologyreviews67(4):491-502；zinnieldk等人(2002)isolationandcharacterisationofendophyticcolonisingbacteriafromagronomiccropsandprairieplants.appliedandenvironmentalmicrobiology68(5):2198-2208)。在本发明的一个优选实施例中，从根组织中分离微生物。用于从植物材料中分离微生物的更多方法在本文下文中详述。

如本文使用的，“分离物”、“分离的”等相同术语应广泛考虑。这些术语预期意指一种或多种微生物已至少部分从它在特定环境(例如土壤、水、植物组织)中与之结合的至少一种材料中分离。“分离物”、“分离的”等相同术语不应视为指示微生物已纯化的程度。

如本文使用的，“个别分离物”应视为意指在与一种或多种其他微生物分离后，包含占优势的微生物单一属、物种或菌株的组合物或培养物。该短语不应视为指示微生物已分离或纯化的程度。然而，“个别分离物”优选基本上仅包含微生物的一个属、物种或菌株。

植物

任何数目的多种不同植物、苔藓和地衣可用于本发明的方法中。在优选实施例中，植物具有经济、社会和/或环境价值。例如，植物可包括下述用途：作为食物作物；作为纤维作物；作为油料作物；在林业工业中；在纸浆工业中；作为用于生物燃料生产的原料；和/或作为观赏植物。下文是本发明的方法可应用于其的植物类型的非限制性例子列表。

食物作物：

-谷类(玉蜀黍、稻、小麦、大麦、高粱、粟、燕麦、黑麦、黑小麦、荞麦)；

-叶用蔬菜(十字花科(brassicaceous)植物例如卷心菜、花椰菜、小白菜、芝麻菜；沙拉用绿色蔬菜例如菠菜、水芹、莴苣)；

-结果和开花蔬菜(例如鳄梨，甜玉米，朝鲜蓟，瓜类蔬菜例如倭瓜、黄瓜、甜瓜、小胡瓜、南瓜；茄类蔬菜/水果例如番茄、茄子、辣椒)；

-有荚蔬菜(落花生、花生、豌豆、大豆、豆、小扁豆、鹰嘴豆、秋葵)；

-鳞茎类和茎菜类蔬菜(芦笋、芹菜、葱属(allium)作物例如大蒜、洋葱、韭菜)；

-根菜类和块茎类蔬菜(胡萝卜、甜菜、竹笋、木薯、山药、生姜、洋姜、欧洲防风、萝卜、马铃薯、番薯、芋头、芜箐、芥末)；

-糖料作物包括糖用甜菜(甜菜(betavulgaris))、糖蔗(甘蔗(saccharumofficinarum))；

-生长用于生产非酒精饮料和兴奋剂的作物(咖啡、黑茶、花草茶和绿茶、可可、烟草)；

-水果作物例如真浆果(例如猕猴桃、葡萄、黑醋栗、圆醋栗、番石榴、费约果、石榴)、柑橘类水果(例如橙、柠檬、酸橙、葡萄柚)、上位果(例如香蕉、越桔、蓝莓)、聚合果(黑莓、覆盆子、波森莓)、聚花果(例如菠萝、无花果)、核果作物(例如杏、桃、樱桃、李)、仁果(例如苹果、梨)及其他例如草莓、向日葵籽；

-烹调和医用草药例如迷迭香、罗勒、月桂、芫荽、薄荷、莳萝、金丝桃属(hypericum)、毛地黄、芦荟(alovera)、玫瑰果)；

-生产香料的作物植物例如黑胡椒、小茴香、肉桂、肉豆蔻、生姜、丁香、藏红花、小豆蔻、豆蔻、红辣椒、马沙拉(masalas)、大茴香；

-生长用于生产坚果的作物例如杏仁和核桃、巴西坚果、腰果、椰子、栗子、澳洲坚果、开心果；花生、美洲山核桃；

-生长用于生产啤酒、葡萄酒和其他酒精饮料的作物例如葡萄、啤酒花；

-油料作物例如大豆、花生、棉花、橄榄、向日葵、芝麻、羽扇豆物种和十字花科作物(例如低芥酸菜子/油料种子油菜)；和

-食用菌例如白蘑菇、香菇和蚝蘑；

在草地农业中使用的植物：

-豆科植物：三叶草属(trifolium)物种、苜蓿属(medicago)物种和莲属(lotus)物种；白色三叶草(白三叶草(t.repens))；红色三叶草(红三叶草(t.pratense))；高加索三叶草(t.ambigum)；地三叶(地三叶(t.subterraneum))；苜蓿/紫花苜蓿(紫花苜蓿(medicagosativum))；一年生苜蓿属；蒺藜苜蓿；黑苜蓿；驴喜豆(驴食草(onobrychisviciifolia))；牛角花(百脉根(lotuscorniculatus))；大牛角花(greaterbirdsfoottrefoil)(长柄百脉根(lotuspedunculatus))；

-种子豆科植物/豆类植物包括豌豆(豌豆(pisumsativum))、菜豆(菜豆(phaseolusvulgaris))、蚕豆(蚕豆(viciafaba))、绿豆(绿豆(vignaradiata))、豇豆(豇豆(vignaunguiculata))、鹰嘴豆(鹰嘴豆(cicerarietum))、羽扇豆(羽扇豆属(lupinus)物种)；

-谷类包括玉蜀黍/玉米(玉蜀黍(zeamays))、高粱(高粱属物种(sroghumspp.))、粟(黍(panicummiliaceum)、细柄黍(p.sumatrense))、稻(籼稻(oryzasativaindica)、粳稻(oryzasativajaponica))、小麦(小麦(triticumsativa))、大麦(大麦(hordeumvulgare))、黑麦(黑麦(secalecereale))、黑小麦(小黑麦(triticumxsecale))、燕麦(野燕麦(avenafatua))；

-饲料和草坪草：温带草例如黑麦草属(lolium)物种；羊茅属(festuca)物种；剪股颖属物种(agrostisspp.)、多年生黑麦草(多年生黑麦草(loliumperenne)；杂交黑麦草(杂交黑麦草(loliumhybridum))；一年生黑麦草(loliummultiflorum(multiflorum))、高羊茅(高羊茅(festucaarundinacea))；草甸羊茅(草甸羊茅(festucapratensis))；紫羊茅(紫羊茅(festucarubra))；羊茅(festucaovina)；festuloliums(羊茅黑麦草(loliumxfestuca)杂交)；鸭茅(鸭茅(dactylisglomerata))；肯塔基早熟禾(草地早熟禾(poapratensis))；泽地早熟禾(poapalustris)；林地早熟禾(poanemoralis)；普通早熟禾(poatrivialis)；加拿大早熟禾(poacompresa)；雀麦属(bromus)物种；虉草属(phalaris)(梯牧草属(phleum)物种)；燕麦草(arrhenatherumelatius)；冰草属(agropyron)物种；糙伏毛燕麦(avenastrigosa)；谷子(setariaitalic)；

-热带草例如：虉草属物种；臂形草属(brachiaria)物种；画眉草属(eragrostis)物种；黍属(panicum)物种；百喜草(百喜草(paspalumnotatum))；短柄草属(brachypodium)物种；和

-用于生物燃料生产的草例如柳枝稷(柳枝稷(panicumvirgatum))和芒属(miscanthus)物种；

纤维作物：

-棉花、大麻、黄麻、椰子、剑麻、亚麻(亚麻属物种(linumspp.)、新西兰麻(新西兰麻属物种(phormiumspp.)；收获用于纸和改造的木纤维产品的种植和天然林物种例如松柏类植物和阔叶林物种；

在种植林业中使用的树和灌木物种和生物燃料作物：

-松树(松属(pinus)物种)；冷杉(黄杉属(pseudotsuga)物种)；云杉(云杉属(picea)物种)；柏树(柏属(cupressus)物种)；金合欢树(金合欢属(acacia)物种)；桤木(桤木属(alnus)物种)；栎属物种(栎属(quercus)物种)；红杉(巨杉属(sequoiadendron)物种)；柳树(柳属(salix)物种)；桦树(桦木属(betula)物种)；雪松(雪松属(cedurus)物种)；梣树(梣属(fraxinus)物种)；落叶松(落叶松属(larix)物种)；桉属(eucalyptus)物种；竹(竹类(bambuseae)物种)和白杨(杨属(populus)物种)。

生长用于通过提取、生物学、物理或生物化学处理转换为能量、生物燃料或工业产品的植物：

-产油植物例如油椰、麻风树属、大豆、棉花、亚麻子；

-产乳胶植物例如帕拉胶树、巴西橡胶树(heveabrasiliensis)和巴拿马橡胶树(美洲橡胶树(castillaelastica))；

-即在生物燃料、工业溶剂或化学产品例如乙醇或丁醇、丙二醇或其他燃料或工业材料的生产过程中的化学、物理(例如热或催化)或生物化学(例如酶预处理)或生物学(例如微生物发酵)转化后，用作用于生产生物燃料的直接或间接原料的植物，包括糖料作物(例如甜菜、糖蔗)、产淀粉作物(例如c3和c4谷类作物和块茎类作物)、纤维质作物例如森林树(例如松树、桉树)以及禾草和禾本科植物例如竹、柳枝稷、芒属；

-经由气体至生物燃料或其他工业原料例如溶剂或塑料的气化和/或微生物或催化转换在能量、生物燃料或工业化学生产中使用的作物，连同或不连同生物碳的生产(例如生物质作物例如松柏类植物，桉树，热带或阔叶林树，禾草和禾本科作物例如竹、柳枝稷、芒属，糖蔗或大麻或针叶树例如白杨、柳树；和

-在生物碳生产中使用的生物质作物；

生产对于制药、农业、营养和药用化妆品工业有用的天然产物的作物：

-生产制药前体或化合物或营养和药用化妆品化合物和材料的作物，例如大茴香(莽草酸)、日本虎杖(japaneseknotweed)(白藜芦醇)、猕猴桃(可溶纤维、蛋白水解酶)；

因其美容或环境性质而栽培的花卉栽培、观赏植物和环境植物：

-花例如玫瑰、郁金香、菊花；

-观赏灌木例如黄杨属(buxus)、赫柏、蔷薇属(rosa)、杜鹃属(rhododendron)、常春藤属(hedera)

-环境植物例如悬铃木属(platanus)、墨西哥橘属(choisya)、南美鼠刺属(escallonia)、大戟属(euphorbia)、苔草属(carex)

-苔藓例如泥炭藓

生长用于生物除污的植物：

-向日葵属(helianthus)、芸苔属、柳属、杨属、桉属

应当理解，植物可以种子、幼苗、插枝、繁殖体或能够生长的任何其他植物材料或组织的形式提供。在一个实施例中，种子可用物质例如次氯酸钠或氯化汞进行表面灭菌，以去除表面污染微生物。在一个实施例中，繁殖体在置于植物生长培养基中之前在纯净培养中生长，例如作为组织培养中的无菌小植物。

生长培养基

如本文使用的，术语“生长培养基”应广泛视为意指适合于支持植物生长的任何培养基。例如，培养基可以是天然或人工的，包括但不限于土壤、盆栽混合土、树皮、蛭石、单独并应用于固体植物支持系统的水耕法溶液、和组织培养凝胶。应当理解培养基可单独或与一种或多种其他培养基组合使用。它还可连同或不连同外源营养物和用于根和叶的物理支持系统的添加一起使用。

在一个实施例中，生长培养基是天然存在的培养基例如土壤、沙、泥浆、粘土、腐殖土、风化层、岩石或水。在另一个实施例中，生长培养基是人工的。此类人工生长培养基可构造为模拟天然存在的培养基的条件，然而，这不是必需的。人工生长培养基可由任何数目和组合的材料中的一种或多种制备，所述材料包括沙、矿物质、玻璃、岩石、水、金属、盐、营养物、水。在一个实施例中，生长培养基是无菌的。在另一个实施例中，生长培养基不是无菌的。

培养基可用另外的化合物或组分修正或丰富，例如可帮助特定组的微生物与植物和彼此的相互作用和/或选择的组分。例如，可存在抗生素(例如青霉素)或杀菌剂(例如季铵盐和氧化剂)和/或可修正物理条件(例如盐度、植物营养物(例如有机和无机矿物质(例如磷、氮盐、铵、钾和微量营养物例如钴和镁)、ph和/或温度)。

在本发明的某些实施例中，可预处理生长培养基，以帮助某些微生物的存活和/或选择。例如，培养基可通过在富集培养基中温育进行预处理，以鼓励可能存在于其中的内生微生物的繁殖。作为更多例子，培养基可通过在选择培养基中温育进行预处理，以鼓励特定组微生物的繁殖。其它例子包括预处理生长培养基，以排除其中微生物集合的特定元素；例如巴氏灭菌(以去除产芽孢细菌和真菌)或用有机溶剂例如多种醇处理，以去除对这些物质敏感的微生物，但允许例如放线菌和产芽孢细菌的存活。

生长条件

依照本发明的方法，对一种或多种植物实施一种或多种微生物和生长培养基。植物优选在一种或多种微生物和生长培养基的存在下生长或允许繁殖。微生物可天然存在于生长培养基中，而无需添加更多微生物，例如在天然土壤中。生长培养基、植物和微生物可以任何合适的次序彼此组合或暴露于彼此。在一个实施例中，将植物、种子、幼苗、插枝、繁殖体等种植或播种到生长培养基内，所述生长培养基先前已用一种或多种微生物接种。作为另外一种选择，一种或多种微生物可应用于植物、种子、幼苗、插枝、繁殖体等，其随后被种植或播种到生长培养基(其可含有或不含更多微生物)内。在另一个实施例中，首先将植物、种子、幼苗、插枝、繁殖体等种植或播种到生长培养基内，允许生长，并且在以后时间将一种或多种微生物应用于植物、种子、幼苗、插枝、繁殖体等和/或生长培养基自身用一种或多种微生物接种。

微生物可使用本领域已知的任何合适技术应用于植物、幼苗、插枝、繁殖体等和/或生长培养基。然而，例如，在一个实施例中，通过喷雾或轻撒将一种或多种微生物应用于植物、幼苗、插枝、繁殖体等。在另一个实施例中，在播种前将微生物直接应用于种子(例如作为包衣)。在更多实施例中，将微生物或来自微生物的孢子配制成颗粒剂且在播种过程中与种子一起应用。在另一个实施例中，通过切割根或茎且通过喷雾、浸渍或另外应用液体微生物悬浮液或凝胶或粉末使植物表面暴露于微生物，可将微生物接种到植物内。在另一个实施例中，微生物可直接注入叶或根组织内，或另外直接接种到叶或根切口内或之上，要不然接种到切断的胚、或胚根或胚芽鞘内。这些接种的植物随后还可暴露于含有更多微生物的生长培养基，然而，这不是必需的。

在一个实施例中，微生物浸润植物的部分例如根、茎、叶子和/或生殖性植物部分(变成内生的)，和/或在根、茎、叶子和/或生殖性植物部分的表面上生长(变成附生的)和/或在植物根际中生长。在一个优选实施例中，微生物与植物形成共生关系。

使用的生长条件可依赖植物物种而改变，如本领域技术人员应当理解的。然而，例如，对于三叶草，在生长室中，一般在补充有肥料、含有以泥煤形式的约三分之一有机物质、三分之一堆肥和三分之一过筛浮石的土壤中和在6-7的ph下生长植物，所述肥料一般含有硝酸盐、磷酸盐、钾和镁盐和微量营养物。植物可在22-24℃的温度下在16:8的光:暗周期中下生长且自动浇水。

选择压力

在其内对植物实施一种或多种微生物和生长培养基的时间段过程中的所需时间，应用选择压力。选择压力可以是任何生命或无生命因素或元素，其可对特定植物的健康、生长和/或存活具有影响，包括植物可在其天然环境或商业情况中暴露于其的环境条件和元素。

生命选择压力的例子包括但不限于对植物有害的生物体，例如真菌、细菌、病毒、昆虫、螨虫、线虫、动物。

无生命的选择压力包括例如环境中的任何化学和物理因素；例如水可用性、土壤矿物组成、盐、温度、光谱中的改变(例如增加的uv光)、ph、有机和无机毒素(例如暴露于毒素或毒素水平的变化)、金属、有机营养物、无机营养物、空气质量、大气气体组成、空气流动、降雨和冰雹。

例如，植物/微生物可暴露于盐浓度的变化或极端盐浓度、温度、ph、高于正常水平的大气气体例如co2、水位(包括干旱条件或淹水条件)、低氮水平、以仅在微生物降解后对植物可用形式的磷的提供、暴露于环境中的毒素或环境中的毒素水平的变化、具有接近某些矿物质例如铝酸盐的毒性水平的土壤、或疾风。

在一个实施例中，将选择压力直接应用于植物、微生物和/或生长培养基。在另一个实施例中，经由周围环境例如空气中的气态毒素或飞行昆虫，将选择压力间接应用于植物、微生物和/或生长培养基。

选择压力可在任何时间应用，优选在对植物实施一种或多种微生物和生长培养基的时间过程中。在一个实施例中，选择压力在基本上植物生长和/或繁殖的整个时间过程中应用。在另一个实施例中，选择压力在生长和/或繁殖过程中的不连续时间点应用。例如，选择压力可在一种或多种植物的不同生长期应用，其模拟在天然或商业设置中可能出现的对植物的潜在胁迫。例如，本发明人已观察到一些害虫仅在植物生命的特定阶段攻击植物。此外，本发明人已观察到潜在有利的微生物的不同群体可在植物生命中的不同点与植物结合。模拟在有关时间点对植物的害虫攻击可允许鉴定和分离微生物，这可保护植物不受在那个特定生命阶段的攻击。还应当理解，选择压力可在植物、种子、幼苗、插枝、繁殖体等种植或播种时存在于生长培养基或一般环境中。

在一个实施例中，使微生物群体暴露(在该方法前或在该方法的任何阶段)于选择压力，以增强最后选择的植物具有可能具有所需性质的微生物集合的可能性。例如，微生物在其加入植物生长培养基(优选无菌的)之前暴露于巴氏灭菌可能增强就所需性状选择的植物与产芽孢微生物结合的可能性，所述产芽孢微生物可更容易地在不利条件下、在商业贮存中、或如果作为包衣应用于种子、则在不利环境下存活。另一个例子在本文下文实例11b中提供，其中对微生物实施允许选择磷酸盐增溶微生物的培养基。此类对微生物群体应用选择压力的步骤在本文中可称为“富集步骤”。

植物在其选择且收获前可生长且实施选择压力任何合适的时间长度。仅作为例子，植物和与之结合的任何微生物可在植物生长期过程中的任何时间选择且收获，在一个实施例中，在植物发芽后的任何时间。在优选实施例中，植物生长或允许繁殖这样的时期，所述时期允许区分具有期望表型特征的植物和不具有期望表型特征的植物。作为一般例子，小麦可比如在一个月后就叶生长速度中的改善进行选择，但同样可就种子头部成熟时的优良谷粒产量进行选择。植物生长的时间长度依赖表达希望通过本发明改善的植物性状所需的时间，或表达与所需性状相关的性状所需的时间。例如，在主要在北半球播种的冬小麦品种的情况下，在类似于北半球由冬小麦种子经历的光和温度条件下，在种子暴露于含有微生物的生长培养基后，选择展示出早期分蘖的植物可能是重要的，因为早期分蘖是与冬季存活、生长和最后的夏季谷粒产量有关的性状。或者，树种可在4-6个月时就改善的生长和健康进行选择，因为这些性状与10年后(使用本发明的不实际时期的产品开发)树的健康和生长率和大小有关。

应当理解本发明的方法可涉及在步骤b)中同时或序贯应用两种或更多种选择压力。

选择

一般地，在暴露于选择压力后，基于一种或多种表型性状选择一种或多种植物。然而，还设想了基于基因型信息选择植物(例如响应微生物的植物基因表达谱)。

例如，可基于生长率、大小(包括但不限于重量、高度、叶子大小、茎大小或植物任何部分的大小)、一般健康、存活和/或对不利物理环境的耐受来选择植物。更多的非限制性例子包括基于下述选择植物：种子发芽的速度；产生的生物质数量；增加的根和/或叶子/枝条生长，其导致增加的产量(茎叶或谷粒或纤维或油)或生物质生产；对导致对于作物增加的种子产量的植物生长的作用，其在谷类作物中可能是特别有关的，所述谷类作物例如小麦、大麦、燕麦、黑麦、玉蜀黍、稻、高粱、油料作物例如大豆、低芥酸菜子、棉花、向日葵和种子豆科植物例如豌豆、豆类；对导致增加的油产量的植物生长的作用，其在油料种子作物中可能是特别有关的，所述油料种子作物例如大豆、低芥酸菜子、棉花、麻风树和向日葵；对导致增加的纤维产量(例如在棉花、亚麻和亚麻子中)的植物生长的作用或导致作物例如马铃薯和糖用甜菜中增加的块茎产量的作用；对导致增加的生物质可消化性的植物生长的作用，其在饲料作物中可能是特别有关的，所述饲料作物例如饲料豆科植物(苜蓿、三叶草、苜蓿属物种)、饲料草(黑麦草属物种；羊茅属物种；雀稗属(paspalum)物种；臂形草属物种；画眉草属物种)，生长用于青贮饲料的饲料作物例如玉蜀黍和饲料谷类(小麦、大麦、燕麦)；对导致增加的水果产量的植物生长的作用，其对于仁果树(例如苹果、梨等)、浆果(例如草莓、覆盆子、蔓越橘)、核果(例如油桃、杏)和柑橘类水果、葡萄、无花果、坚果树可能是特别有关的；对导致增加的疾病包括真菌、病毒或细菌疾病或害虫例如昆虫、螨虫或线虫抗性或耐受性的植物生长的作用，其中损害通过减少的叶症状测量，所述症状例如细菌或真菌损害的发生率，受损叶面积或植物根上的线虫包囊或虫瘿数目中的减少，或在此类植物害虫和疾病的存在下在植物产量中的改善；对导致增加的代谢产物产量的植物生长的作用，例如在生长用于制药、营养或药用化妆品用途的植物中，其对于这样的植物可能是特别有关的，例如生长用于生产对于抗流感药物奥司他韦生产关键的莽草酸的大茴香，或用于提取白藜芦醇的日本虎杖生产，或来自猕猴桃的可溶纤维和饮食酶产品生产，或例如在食草动物中对于抑制温室气体例如甲烷产生有用的增加的“缩合单宁”或其他代谢产物产量；对导致改善的美容外观的植物生长的作用，其在因其形式、颜色或味道而栽培的植物中可能是特别重要的，例如颜色强度和观赏花的形式，水果或蔬菜的味道，或来自用微生物处理的葡萄藤的葡萄酒的味道；和对导致改善浓度的由生长用于生物除污目的的植物吸收或解毒的毒性化合物的植物生长的作用。

在本发明的某些实施例中，可能需要关于植物性状的组合的选择；例如，在涉及重复基本方法步骤且对于该方法的每次迭代应用不同选择压力的本发明实施例中。这可以许多方式实现。在一个实施例中，维持关于一种性状例如在线虫侵染土壤中的优良生长的多轮迭代改善，直至获得可接受水平的线虫抗性。采取类似但完全分开的选择循环，以鉴定可赋予至少不同的期望性状的微生物，所述期望性状例如对于起因于改善的微生物土壤磷酸盐利用的改善生长，或起因于增加的对吸吮昆虫害虫的耐受性的改善生长。此类分开的选择循环可使用迭代或叠加方法执行，或可使用分开方法的组合，其中将起因于这些分开循环或方法的组合物组合成单一组合物。在这一点上，微生物可发展成含有分开发酵的微生物的组合的产物，所述微生物各自显示为改善不同植物属性。在其它实施例中，分开选择的微生物组可在两组或更多组中组合，且用于本发明的其它方法中。在另一个实施例中，分开选择的微生物组可分成个别分离物，且随后个别分离物在两组或更多组中组合，且用于本发明的其它方法中。在一个实施例中，将组合的微生物应用于植物和/或生长培养基以用于在相同迭代循环中应用两种或更多种选择压力。例如，在一个组合中，能够改善在含有低水平植物可用磷的培养基中的植物生长的微生物与能够增强在由植物寄生线虫侵染的土壤中生长的植物的微生物组合。随后将组合的微生物加入植物在其中生长合适时期的具有低水平可用磷的植物生长培养基，应用线虫并且植物进一步生长直至线虫损害可表达时。非破坏性评价线虫根损害程度和植物生物质，并且从最佳表现的植物中分离微生物用于在成功迭代中使用。类似的迭代循环可继续直至可接受水平的植物生长在两种选择压力下获得。这种方法将帮助选择微生物，其协同改善植物性能，即改善植物生长和线虫抗性至比微生物作为两个分开选择组的组合简单应用时达到的那种更好的程度。

收获

在选择后，收获一种或多种植物，并且可检查植物组织，以检测与植物形成结合(例如内生、附生或根际结合)的微生物。

可从所选植物的任何合适组织中分离一种或多种微生物；例如全植物、叶组织、茎组织、根组织和/或种子。在优选实施例中，从一种或多种所选植物的根组织、茎或叶组织和/或种子中分离微生物。

微生物可使用本领域已知的任何合适方法从植物中分离。然而，例如，用于分离内生微生物的方法可包括目的植物材料(例如根、茎长、种子)的无菌切除，用合适溶液(例如2％次氯酸钠)的表面灭菌，这之后将植物材料置于营养培养基上用于微生物长出，尤其是丝状真菌。作为另外一种选择，表面灭菌的植物材料可在无菌液体(通常为水)和液体悬浮液中破碎，包括小片破碎的植物材料在合适的固体琼脂培养基或介质表面上铺展，所述培养基或介质可以是或不是选择性的(例如仅含有植酸作为磷源)。这种方法对于细菌和酵母是尤其有用的，所述细菌和酵母形成分离的菌落且可个别挑出至营养培养基的分开平板，并且还通过众所周知的方法纯化至单一物种。作为另外一种选择，植物根或叶样品可以不是表面灭菌而是仅轻轻洗涤的，从而包括在分离过程中的表面居住的附生微生物，或可通过印迹且提起植物根、茎或叶子小片放到琼脂培养基的表面上，并且随后如上文分离个别菌落，分开地分离附生微生物。这种方法对于例如细菌和酵母是尤其有用的。作为另外一种选择，根可无需洗掉小数量的附着至根的土壤进行处理，从而包括在植物根际定殖的微生物。另外，附着至根的土壤可被取出、稀释且在合适的选择性和非选择性培养基的琼脂上展开，以分离根际微生物的个别菌落。更多的示例性方法可在下述中找到：strobelg和daisyb(2003)bioprospectingformicrobialendophytesandtheirnaturalproducts.microbiologyandmolecularbiologyreviews67(4):491-502；zinnieldk等人(2002)isolationandcharacterisationofendophyticcolonisingbacteriafromagronomiccropsandprairieplants.appliedandenvironmentalmicrobiology68(5):2198-2208),manualofenvironmentalmicrobiology,hurst等人，asmpress,washingtondc。

在本发明的实施例中，当两种或更多种微生物从植物材料中分离且随后分成个别分离物时，可使用用于使一种或多种微生物彼此分离的任何合适的方法。然而，例如，由植物材料制备的微生物提取物可在琼脂平板上铺展，在合适温度下生长合适时间段，并且随后选择所得的微生物菌落且在合适培养基中生长(例如在新鲜平板上划线培养或在液体培养基中生长)。可基于形态或如本领域理解的任何其他合适的选择标准来选择菌落。作为更多例子，可使用选择性培养基。更多培养基在本文下文实例部分中描述。

一种或多种微生物可在任何合适的时间点从植物中收获。在一个实施例中，它们在植物发芽后的任何时间收获。例如，它们可从发芽后不久的时期分离(当在发芽后的前几天的存活是问题时，例如对于细菌和真菌根和颈腐病)，那么在那之后的任何阶段，这取决于植物生长以便证明有区别的利益所需的时机，所述利益致使它得以从暴露于选择压力的植物群体中选择(例如，以区分比如200个植物中的前10个)。

本发明人已观察到不同微生物可在植物生命的不同阶段与植物结合。相应地，在不同时间点收获植物可导致不同微生物群体的选择。此类微生物可在其生命过程中的关键时间改善植物状况、存活和生长中具有特别利益：例如，如本文先前提及的，植物可在其生命过程中的不连续时间点对线虫的攻击敏感，并且本发明可用于鉴定且分离可增加对那个具体生命阶段时的此类攻击的抗性。

在本发明的另一个实施例中，在与植物形成允许从一代或一个繁殖体垂直传递到下一代或下一个繁殖体的结合的微生物的情况下(例如种子内生或附生结合，或与植物/繁殖体营养繁殖的内生和附生结合)，微生物可不从植物中分离。靶标植物自身可通过种子或营养繁殖(连同结合的微生物一起)，以给下一代或下一个繁殖期的“子代”植物赋予利益。

叠加

本发明人设想了通过在本发明方法的重复循环中叠加选择压力获得的优点。这可允许分离可在下述方面帮助植物的微生物群体：例如在多种不同环境条件下存活，抵抗多种不同疾病和多种不同生物体的攻击。

在本发明的这个实施例中，如先前描述的，从在暴露于选择压力后选择的一种或多种植物中分离的一种或多种微生物用于该方法的第二轮或循环中；即提供了从所选植物中分离的微生物，连同一种或多种植物和生长培养基，应用选择压力，在所需时间选择植物且从所选植物中分离微生物。从该方法的第二轮中分离的微生物可随后用于后续轮中，等等。

在一个实施例中，在该方法的每次重复中应用的选择压力是不同的。例如，在第一轮中，压力可以是特定土壤ph，并且在第二轮中，压力可以是线虫攻击。然而，在本发明的其他实施例中，在每轮中应用的选择压力可以是相同的。它还可以是相同的但对于每轮以不同强度应用。例如，在第一轮中，选择压力可以是土壤中存在的特定盐浓度。在第二轮中，选择压力可以是土壤中存在的更高盐浓度。在一个实施例中，选择压力以可以是线性、阶梯式或曲线模式在序贯循环中增加。例如在迭代选择过程的第1轮中，当经由改善的植物/微生物结合发生适应时，小麦加上微生物可暴露于100mmnacl，在第二轮中，可暴露于110mm盐，在第三轮中，可暴露于120mm盐，从而增加对植物的选择压力。作为另外一种选择，对于几轮维持120mm的选择压力可能是有利的，以允许支撑小麦在更高盐环境下生产性生长的能力中的改善的微生物群体平衡中的更慢调整。

在一个实施例中，选择压力可与迭代过程的特定步骤、特别是迭代循环的第一轮分离地分开。例如，在第一轮中，选择压力可完全不应用。但在微生物已在第1轮中暴露于生长培养基和微生物有关时期后从所选植物中分离后，对于第2轮将它们连同植物、种子、幼苗、插枝、繁殖体等一起应用于植物生长培养基。在合适时间后，在第2轮和序贯轮中应用选择压力。这个类型的选择对于选择因素可能是尤其有关的，所述选择因素严重减少其为选择的靶标的植物组织。例如，线虫尤其破坏根组织，并且允许特定微生物在第1轮中在根上、中、或周围繁殖至高水平可能是有利的，以允许来自第1轮中选择的植物根的高浓度的微生物在第2轮中应用于生长培养基。

应当理解本发明的迭代法的每个序贯轮可由其中不应用选择压力的轮点缀，如本文先前提及的。

还应当理解在本发明的某些实施例中，当一种或多种微生物与植物形成允许从一代或一个繁殖体垂直传递到下一代或下一个繁殖体的内生或附生关系时，微生物无需从植物中分离。靶标植物自身可通过种子或营养繁殖(连同结合的微生物一起)，以给下一代或下一个繁殖期的“子代”植物赋予利益。

还应当理解对于该方法的每次迭代可应用两种或更多种选择压力。

分离的微生物和含有其的组合物

除了本文先前描述的方法外，本发明涉及通过此类方法分离的微生物和包含此类微生物的组合物。以其最简单的形式，包含一种或多种微生物的组合物包括活微生物的培养物，和处于活的但灭活状态的微生物，包括冷冻、冻干或干燥培养物。然而，组合物可包含其他成分，如下文讨论的。

本发明还应理解为包含用于生产组合物以支持植物生长和/或健康的方法，该方法包括本文先前描述的方法的步骤和组合一种或多种微生物与一种或多种另外成分的另外步骤。

“支持植物生长和/或健康的组合物”应广泛视为包括可帮助植物生长、一般健康和/或存活的组合物。该短语不应视为暗示该组合物能够单独支持植物生长和/或健康。然而，在一个实施例中，组合物适合于这个目的。本发明的这个方面的示例性组合物包括但不限于植物生长培养基、植物矿物质补充剂和微量营养物、堆肥、肥料、盆栽混合土、杀虫剂、杀真菌剂、保护不受害虫和疾病感染或侵染的介质。

考虑到待制备组合物的性质、待使用的微生物和/或将组合物递送给植物或其环境的方法，技术人员将容易理解可与一种或多种微生物组合的另外成分的类型。然而，例如，成分可包括液体和/或固体载体、微生物防腐剂、延长微生物生命的添加剂(例如凝胶和粘土)、可湿性粉剂、颗粒载体、土壤、沙、已知对微生物存活以及植物生长和一般健康有利的试剂、泥煤、有机物质、有机和无机填充剂、其他微生物、湿润剂、有机和无机营养物、和矿物质。

考虑到待使用成分的性质，此类组合物可使用标准方法进行制备。

由本发明的方法开发的组合物可通过本领域技术人员已知的任何数量的方法应用于植物。这些包括例如：喷雾剂；粉末剂；颗粒剂；种子包衣；在应用时的种子喷雾或撒粉；在发芽前在含有合适浓度的组合物的床中发芽种子且种植幼苗；在播种或种植过程中紧靠种子或植物应用的金属小球或颗粒剂，或通过诸如直接钻孔的过程应用于现有作物；通过在种植前将切割表面或繁殖体浸渍到液体或粉末微生物基底内应用于植物插枝或其他营养繁殖体；以喷雾剂、粉末剂、颗粒剂或堆肥组合物的形式作为“土壤处理”应用于土壤，其可在作物播种或种植前或后与植物肥料一起或不一起应用；应用于水耕法生长培养基；在无外来污染的条件下经由组合物注射接种到植物组织内，或对于与伸展至种子的植物或繁殖组织的内生关系的后续建立，经由此类组织中的切口另外接种，使得植物可经由常规农业实践连同给植物提供利益的内生微生物一起繁殖。

产生可替代组合物的方法

当组合物进行培养时，它们可产生一种或多种代谢产物且进入它们位于其中的培养基内。此类代谢产物可给植物赋予有利性质。

相应地，本发明还提供了产生能够给植物赋予一种或多种有利性质的组合物的方法，例如支持植物生长和/或健康，或鉴定能够产生此类组合物的微生物。在一个实施例中，组合物基本上不含微生物。

在一个实施例中，用于选择能够给植物赋予一种或多种有利性质的组合物的方法包括至少下述步骤：

a)在一种或多种培养基中培养一种或多种微生物；

b)在一段时间后从一种或多种培养基中分离一种或多种微生物，以提供一种或多种组合物；

c)对一种或多种植物(包括其种子、幼苗、插枝和/或繁殖体)实施一种或多种组合物；

d)如果观察到给一种或多种植物赋予一种或多种有利性质，则选择一种或多种组合物。

在一个实施例中，用于选择能够产生组合物(其能够给植物赋予一种或多种有利性质)的一种或多种微生物的方法包括至少下述步骤：

a)在一种或多种培养基中培养一种或多种微生物；

b)在一段时间后从一种或多种培养基中分离一种或多种微生物，以提供一种或多种组合物；

c)对一种或多种植物(包括其种子、幼苗、插枝和/或繁殖体)实施一种或多种组合物；

d)选择与一种或多种组合物结合的一种或多种微生物，观察到所述一种或多种组合物给一种或多种植物赋予一种或多种有利性质。

在这个方法中，来自任何来源(例如，如本文先前描述的)的微生物在两种或更多种(优选大量，例如至少约10种至高达约1000种)混合培养物中进行培养，使用可支持广泛多样微生物生长的培养基。可使用本领域已知的任何合适培养基。然而，例如，发酵培养基、tsb(胰蛋白酶大豆肉汤)、luria-bertani(lb)肉汤或reasoner’s(r2a)肉汤。在另一个实施例中，可使用能够支持具有大量分开但期望性质的微生物生长的选择性或富集培养基。例如，可使用本文其他地方提及的富集培养基。

微生物可在培养基中培养任何所需时期。在培养后，微生物从培养基中分离且贮存用于以后使用。还产生分离的组合物。随后对在合适生长培养基中的一种或多种植物实施组合物(使用任何已知方法或如本文先前描述的方法)。在一段时间后，评价植物的生长且选择植物(例如，如本文先前描述的)。优选基于大小选择植物。然而，可使用如本文提及的其他选择标准。

在一个实施例中，从贮存中回收产生与所选植物结合的组合物子集的微生物。微生物的两种或更多种分开培养物随后可混合在一起，且分成在两种或更多种不同培养基中生长的两种或更多种传代培养物。

这个过程可迭代重复视为有效的多次，其中进行性步骤精炼至更少培养基和更窄的微生物多样性，直至用微生物混合物达到对生长植物的期望效应，所述微生物混合物可鉴定、生长和作为标准起始接种物无限期地贮存用于生产组合物。

本发明的这个方面的实施例的例子在本文下文实例7中提供。

本发明的这个方面的组合物可单独或与一种或多种另外成分组合使用或配制。

应当理解本文先前描述的一般方法可应用于本发明的这个方面，包括但不限于生长培养基、植物、微生物、选择压力、时机、迭代处理及其组合。

另外的方法

图1显示了根据本发明的实施例的系统10。系统10包括请求器11、请求处理器12、生长设备13、数据库或文库14和贮藏所15。

图2提供了示出根据本发明的实施例的方法20的流程图。图2中所示的步骤将参考图1中所示的系统10进行描述。

本发明的这个方面在鉴定一种或多种微生物方面进行描述，所述微生物可给一种或多种植物赋予一种或多种所需性质，并且在一些情况下特别参考本发明的第一个方面。然而，应当理解它可同样应用于鉴定可给一种或多种植物赋予一种或多种所需性质的一种或多种微生物，或产生可给一种或多种植物赋予一种或多种所需性质的组合物的一种或多种微生物，如本文先前描述的和在本发明的第七个和第八个方面中概括的。相应地，除非上下文另有要求，提及本发明的第一个方面应视为还包括提及本发明的第七个和第八个方面，并且提及一种或多种微生物应视为包括提及一种或多种组合物。

该方法在步骤21时用请求器11鉴定植物(或植物种类或组)开始。特定植物或植物类型为何可得到鉴定的原因对于本领域技术人员将是显而易见的。然而，例如，可能已发现一般注意到具有高生长率的植物以更低速率生长或完全不生长，它们可以是仅仅希望改善现有生长率或可能希望将植物引入不同气候/环境/地理区域。本发明并不限于给特定植物赋予改善且可用于抑制生长或另外不利地影响植物。

在步骤22时，请求器11将植物和/或其身份发送到请求处理器12。请求器11可提供更多有关信息，例如为何它们寻求改善或它们寻求改善何种性质。虽然仅显示了一个请求处理器12，但应当理解超过一个可在系统10中提供。

当请求器11鉴定植物种类或组时，可评估超过一个植物品种。可替代或另外地，基于鉴定的组或种类可在系统10内的其他地方作出一个或多个植物品种的选择，包括根据本发明的方法使用不同微生物的不同品种的下述评估。

请求可方便地经由网络浏览器在因特网上接受，尽管本发明并不限于此。网络浏览器的使用可另外或可替代地用于使请求器11能够察看关于响应其请求作出的进展的报告。例如，可提供生长的测量。

在步骤23时，请求处理器12接受且处理请求，基本上通过起始该方法的执行以用于根据本发明的第一个方面选择一种或多种微生物。应当指出请求处理器12可主动或可不主动执行第一个方面的方法，或可仅执行其部分。根据特定实施例，请求处理器12可充当请求器11和能够执行第一个方面的方法的各方之间的中间阶段或代理人。此外，不同安排可响应不同请求作出。例如，对于一个请求，围绕请求处理器12的环境可能适合于评估特定植物但不适合于另一种，需要第三方设备的帮助。这可以是由于在特定土壤类型、海拔或气候中测试的希望。其他因素也将是显而易见的，尽管应当理解可使用“人工”环境。此外，不同程度的用户相互作用可在请求处理器12处发生。根据一个实施例，计算机处理器基于通过请求器11的数据输入来选择用于研究的参数或条件。如应当理解的，提供结构化的信息(structuredinformation)请求可帮助实现这点，并且当需要时，可参考数据库包括数据库14。

在步骤24时，选择评估过程的参数。例如，关于可提供植物中的所需改善的微生物可参考数据库14。虽然迄今为止本领域提供了关于与特定植物品种具有有利结合的微生物的很少数据，但这通过本发明的方法的进行性操作得到改善且贮存于数据库14中。还可选择其他参数例如植物类型和环境条件。

在步骤25时，将请求(或其部分)和评估参数发送到生长设备13，其可从贮藏所15获得合适的微生物。这些可先前得到鉴定或未得到鉴定。虽然仅显示了一个生长设备13和一个贮藏所15，但应当理解本发明并不限于此。此外，请求处理器12、生长设备13、数据库14和贮藏所15中的任何两个或更多个可共定位和/或处于相同控制下。

在步骤26时，优选根据第一个方面的选择方法执行选择过程。

在步骤27时，将应答发送到请求。应答可发送到请求器11和/或第三方，且优选包括至少在步骤26时生成的结果子集：植物的鉴定、植物、微生物的鉴定、微生物、或提供的与微生物结合的植物中的至少一个，即在步骤26时已显示提供利益的那些。

在步骤28时，数据库14可用步骤26的选择过程的结果更新。这个步骤可在步骤27前执行，包括定期或在进行选择过程的其他多个阶段。优选地，至少记录在植物和微生物之间的新有利结合的细节。应当理解还将优选记录不相容或有利较少的结合，从而随着时间过去构建植物和微生物的知识框架。

应当理解图2的一个或多个步骤可省略或重复。例如，生长设备13可在步骤26时生成结果，并且对其响应，可重复步骤21至26中的一个或多个。

因此，本发明提供了改善植物(或其生长或其他特征)的装置和方法。这通过在第一地理区域(例如国家)或另外的限定环境(例如通过影响生长条件的参数或特征例如此类土壤盐度或酸度)中启动请求器11来达到，以取得在第一区域中不存在或有限存在的微生物生物多样性，以用于在第一或另一区域中的植物改善的目的。另一区域可以是或在外国，但可通过影响植物的那个环境的特征另外限定，而不是通过政治边界限定。因此，本发明可启动请求器以获得在第一区域中特定微生物对特定植物的有利作用，尽管此类微生物在第一区域中可能不存在或具有有限存在。

本发明的示例实现在下文提供。

1.比如新西兰中的公司(本国公司)进入与第二、比如海外公司(海外公司)的合同关系。

2.海外公司同意将来自适于在其自身或其他外国国家中的环境的植物栽培品种的种子、插枝或其他植物繁殖体(外国栽培品种)发送到本国公司，以便接近新西兰的陆地和海洋微生物生物多样性的元素，所述元素能够与外国栽培品种形成有利的植物-微生物结合。

3.利益的性质可包括增加的植物生产力，例如通过下述中的任何一种或多种但不限于其：增加的根或叶质量，或通过经由固氮生物(diazatrophs)例如克雷伯氏菌属(klebsiella)或根瘤菌属的固氮在营养物利用中的功效中的增加，或通过植物营养物从土壤中的释放，例如通过微生物植酸酶生产的磷酸盐释放土壤，或通过改善的对来自害虫和跨越广泛范围的线虫的疾病、昆虫、微生物和病毒疾病的攻击的抗性，或通过植物抵抗不利环境条件例如干旱、盐度、极端温度、毒性土壤矿物质的能力中的改善，或通过植物表型例如开花日期中的改善，或物理形式例如根或叶分支的颜色频率的变化。

4.在新西兰，通过使种子发芽且在生长材料中生长植物的方法，本国公司通过使种子暴露于微生物来鉴定何种本土微生物可与外国植物形成结合，连同或不连同其对植物的可能作用的了解，所述生长材料确保植物在其生长过程中经由种子包被、直接接种到种子内或使幼苗发芽和/或生长培养基的污染与本土微生物的接触。本发明并不限于这种安排或方法。例如，可显而易见在土壤中除了新西兰外存在的微生物可提供利益，并且测试可在除了新西兰外或代替新西兰的此类区域中进行。此外，可制备人工环境。参考紧前面的例子，这可通过从此类区域中获得土壤和/或微生物且在比如新西兰进行测试来实现。如显而易见的，此类实施例可包括提供在其他参数中的气候条件的人工控制。因此，本发明并不限于基于其本土微生物在区域中进行测试–微生物可这样人工引入，以便在微生物的天然环境之外的其他地方进行测试。

5.生长期和它们在其下发生的物理条件可根据植物物种和特定植物改善性状而广泛改变，包括基于由海外公司期望或指定的参数。

6.在有关植物生长期后，通过微生物评价测定可能的植物-微生物结合性质，以测定微生物是否已与外国作物形成内生、附生或根际结合。先前步骤中的一个或多个可根据需要重复直至发现所需关系。

7.当此类结合得到证实时，微生物形成能够与(比如外国)作物或植物结合的(比如新西兰本土)微生物集合。

8.在本发明的一个实施例中，集合的微生物分离物可以例如包被到种子上，接种到种子或幼苗内，或接种到可能无菌或并非无菌的生长培养基内。

9.在合适时期后，植物就改善的根和叶生长进行评价和/或暴露于为鉴定植物-微生物结合而设计的环境应激物，所述植物-微生物结合最能够以海外公司所需的方式给植物提供利益。

10.此类应激物或选择标准的例子在上文3中提供，并且当第二、海外环境的相同害虫、疾病或其他参数不存在于本国或测试区域(即例子中的新西兰)时，可选择相似的微生物疾病、线虫和昆虫害虫或最类似于海外环境中的那些且对于海外公司可视为可接受的其他参数。如上文4中提及的，本发明还包括在本国或测试区域中引入外来材料或产生另外的人工条件。

11.通过这个过程鉴定给外国栽培品种的生长提供商业上显著利益的良种微生物，并且可运往海外公司用于在外国环境中的更多测试和选择。

12.在其它实施例中，海外公司将同意将在外国栽培品种的种子、插枝或繁殖体上或其中发现的微生物加入本国公司的集合中，以扩大用于对那个栽培品种或从其他(海外)公司接受用于相似测试的其他外国栽培品种使用的集合。

在可替代实施例中，将能够与外国栽培品种形成植物-微生物结合的微生物分离物即集合发送到第二公司用于测试和选择，使得上文项目8-11通过第二公司执行和/或在第二公司的场地中执行。这可通过第一公司执行或处于第一公司的控制下。

作为进一步的替代物，除了鉴定且使用集合的预定微生物外，例如通过使种子发芽且在生长材料中生长植物，本国公司可仅仅使种子暴露于本土微生物，连同或不连同其对植物的可能作用的了解，所述生长材料确保植物在其生长过程中经由种子包被、直接接种到种子内或使幼苗发芽和/或生长培养基的污染或其他方式与本土微生物的接触。如显而易见的，本国公司可另外或可替代地在其他区域安排相似测试，在所述区域中可存在相同或不同微生物。生长期和它们在其下发生的物理条件可根据植物物种和由海外公司期望的特定植物性状而广泛改变。在植物生长期后，可以与上文描述那种相似的方式测定可能的植物-微生物结合的性质。

实例

本发明现在还通过下述非限制性实例进行描述。

应当理解实例1、2和3可比后续实例更详细地例示本发明的申请。然而，应当理解与实例1、2和3中所述那种相似的方法可用于更多实例中。

实例1：

为了鉴定能够在植物寄生线虫的存在下改善豆科植物例如三叶草的生长的微生物：

步骤1.将未经处理的三叶草种子种植到小罐中的广泛多样的土壤中。在合适的生长期比如2个月后，将植物洗掉土壤，并且从根和茎/叶中分离微生物，作为纯培养物中的个别分离物，或作为混合群体例如作为来自含水根破碎和/或茎/叶破碎的微生物悬浮液。

步骤2.随后将微生物加入未经处理的三叶草种子在其内种植的植物生长培养基中。作为另外一种选择，将微生物混合到合适的种子包被材料例如凝胶内，并且在种植到相似的植物培养基内之前包被到种子上。作为另外一种选择，使种子发芽且随后暴露于微生物短时期(通常为1-24小时，以使微生物可与发芽植物形成内生或附生结合的机率达到最大)，并且随后种植到相似的生长培养基内。在这些情况各自下，生长培养基可最初是无菌的，尽管这不是必需的，并且将更多微生物应用于生长培养基和/或植物。在合适的三叶草生长期(例如一个月)后，将1-1000个活的根结或包囊线虫卵/克土壤加入培养基中。在更多生长期例如6-12周后，从容器中取出植物且轻轻洗涤干净，非破坏性评价相对生长(例如通过根、茎/叶的图像分析)，并且评价由线虫损害构成。

步骤3.选择受线虫暴露最少影响的植物，并且如步骤2中分离且制备其根和叶微生物。随后可迭代重复从步骤2到步骤3的过程，连同或不连同增加数目的线虫一起应用于每个罐，以增加选择压力。

步骤4.在这个迭代过程已进行至在其时三叶草植物在植物寄生线虫的存在下生长的能力中的改善视为足够的点后，选择最佳表现的植物，并且分离与之结合的微生物且用于开发改善在线虫侵扰土壤中的三叶草生长的商业产品。

步骤5.一般地，此类产品的开发将使微生物能够从最后迭代步骤中选择的植物根、茎和根际分离到纯培养物。优选地，将测定在根和叶组织中的微生物的身份和相对浓度，如其与三叶草植物的结合(即内生和/或附生和/或根际)的性质一样。可如上文进行应用于三叶草且暴露于线虫的单一和组合微生物的回溯测试，以测定每种微生物对观察到的植物利益的相对贡献且帮助最佳化最终产品。

由该方法开发的产品可包括单一微生物或两种或更多种微生物的混合物。产品应用于三叶草的方法可包括但不限于种子包被或撒粉，经由喷雾悬浮液在种植时应用于种子，作为颗粒、粉末或堆肥微生物产品的共应用。作为另外一种选择，微生物可借助于喷雾、颗粒、粉末或混合微生物产品在种植后的任何时间应用。作为另外一种选择，产品可在开花前、过程中或后的合适时间喷射到三叶草种子作物上，由此感染种子或另外与之结合，使种子能够作为种子系出售，所述种子系充满具有抗线虫性质的所得的三叶草作物。作为另外一种选择，产品中的微生物可天然感染种子或另外与种子结合，并且因此能够被繁殖且作为具有抗线虫性质的种子系出售。

实例2：

为了证实谷粒生产谷物例如小麦或稻在盐土中生长的改善能力：

步骤1：优选地，在盐水环境例如盐沼或沙丘(尽管这不是必需的)中天然生长的植物连同附着至根的一些“沙/土壤/泥浆”一起收集，并且从根和茎/叶中分离微生物，作为纯培养物中的个别分离物，或作为混合群体例如作为来自含水根破碎和/或茎/叶破碎的微生物悬浮液，或两者，其可过滤以去除植物碎片。

步骤2：将微生物加入含有比如～100ppmnacl(小麦)或～50ppmnacl(稻)的植物生长培养基中，随后在所述植物生长培养基内种植未经处理的小麦或稻种子。作为另外一种选择，将微生物混合到合适的种子包被材料例如凝胶内，并且在种植到相似的植物生长培养基内之前包被到种子上。作为另外一种选择，使种子发芽且随后暴露于微生物短时期比如1-24小时(以使微生物可与发芽植物形成内生或附生结合的机率达到最大)，并且随后种植到相似的生长培养基内。在这些情况各自下，生长培养基可最初是无菌的，尽管这不是必需的，并且将更多微生物应用于生长培养基和/或植物。在合适的植物生长期例如一个月后(但在发芽和种子收获之间的任何期望时间点)，收获植物和/或谷粒，轻轻洗掉来自根的附着土壤，并且通过干重或图像分析或相似物测定茎叶和/或根的相对植物生长，和/或适当时对于留下生长至成熟的植物，测定谷粒产量。

步骤3：选择在暴露于盐水条件后生长大多数或产生最佳种子产量的植物，并且分离其根和叶微生物且使得准备作为个别或组合悬浮液加入种子和/或生长培养基中，如步骤2中。随后可迭代重复从步骤2到步骤3结束时的整个过程，连同或不连同增加nacl的浓度，以增加选择压力。在多次迭代至在其时视为小麦或稻植物抵抗盐水条件至所需程度的能力中的足够改善的点后，分离最后选择轮的最佳表现植物中的微生物，并且微生物菌株个别或在混合物中使用，以开发改善盐土中的小麦或稻生长的商业产品(使用类似于上文实例1中所述那种的产品开发过程和应用方法)。

实例3：

对于特定应用，在暴露于靶标植物前，可期望对微生物群体自身进行起始选择或靶向富集过程，使得在成功迭代后最终选择的植物最可能与具有期望性质的微生物结合。例如，为了增加选择能够经受住极端环境的微生物的机率，所述微生物例如在种植前、过程中和这之后应用于裸根的松树幼苗，经处理的松树幼苗可不由林业工作者小心处理且可干燥和/或暴露于极端热和日光，或其中微生物可包被到种子上，随后将所述种子种植到干旱土壤中以等待降雨。在像这样的此类情况下，可期望在微生物群体中预先选择最可能经受住此类条件的那些。在上文实例中，微生物的制剂可在60℃-80℃下巴氏灭菌5-10分钟，从而选择仅产芽孢微生物例如杆菌的存活，所述产芽孢微生物能够经受住极端环境以及与植物结合。

作为更多例子，可期望预先选择更可能给靶标植物提供改善水平的磷酸盐的微生物，以便代替在靶标植物的环境中减少水平的磷肥。在这种情况下，可期望使分离的微生物群体暴露于含有植酸作为唯一磷源的富集培养基(植酸是关于在土壤中作为植酸盐截留的植物磷酸盐的模型化合物，为对于植物不可用的磷酸盐形式，但其可通过一些微生物降解以释放植物可用的磷)，和/或微生物可暴露于含有羟磷灰石作为唯一磷源的富集培养基(羟磷灰石是关于可从磷矿石中释放磷酸盐的微生物的模型化合物)。预先暴露于此类选择条件的微生物群体可能富集磷酸盐释放微生物，其随后可如实例1和2的步骤2中应用于植物生长培养基。

在上文的每种情况下，相似的微生物选择程序可应用于在每次迭代中从所选植物中分离的微生物，尽管这可能不一定是所需或必需的。应当理解许多微生物选择程序可类似地是有用和适用的。例如，使用氮缺陷培养基选择待应用于植物生长培养基的微生物，以便预先选择可能固氮并因此具有改善植物生长的潜力的微生物。

实例4：

使用环境恢复微生物以加强松树幼苗的生长。

a)在多种土壤包括松林中由种子生长松属品种/物种1-6个月，并且如实例1步骤1中从叶和根中分离微生物，并且如实例3中通过巴氏灭菌处理以选择环境恢复微生物。

b)将微生物应用于生长培养基和/或松树种子或插枝

c)使种子/插枝在生长培养基中生长3-6个月

d)在3-6个月时，收获植物并且评价叶生长和根生长

e)选择期望植物，并且将微生物分离且用于接种生长培养基，并且种植松树种子/插枝

f)将步骤b至e迭代重复需要的多次

g)从加强根和/或茎和/或叶生长的最后迭代中的松树中分离微生物

实例5：

微生物应用于在地面上生长的黑麦草部分以便加强生长的用途：

a)在暴露前生长任何时间长度后，将从任何来源中选择、预处理或不预处理、预先选择或不预先选择(如实例3中)的微生物应用于在生长培养基上暴露的黑麦草植物的表面，但优选在22℃下1-2个月内，以便缩短迭代期

b)使植物再生长1-2个月

c)评价叶生长并且从叶中分离来自产生最大叶产量的植物的微生物。

d)如步骤a中将如此分离的微生物再应用于黑麦草植物的表面。

e)将步骤a至d迭代重复需要的多次

f)从加强根和/或茎生长的最后迭代中选择的黑麦草植物的叶中分离微生物

实例6：

许多微生物彼此是拮抗性的，并且发现显示出协同期望效应或给植物提供靶向单一或多重利益的相容微生物组合的任务是繁重的。使用微生物在个别培养物中的迭代选择，本发明的方法可用于快速鉴定给植物提供利益的微生物的相容和/或协同组合/混合物。例如，可能提供所需利益的微生物选自集合，并且作为混合物应用于植物生长培养基。进行关于单一或多重植物属性的植物生长和选择的迭代。例如，可选择微生物的混合物，其可提供疾病抗性和改善的固氮中的任一或两者，导致改善的植物生长，例如与芽孢杆菌属、假单胞菌属和木霉属(疾病抗性)偶联的根瘤菌属、草螺菌属、固氮根瘤菌属(固氮)的混合物；或与低水平的可用磷偶联的在盐水条件下改善的植物生长，例如嗜盐单胞菌属、盐杆菌属(halobacter)加上泛菌属、肠杆菌属、假单胞菌属。如本文其他地方描述的，进行关于属性组合的序贯轮的迭代选择，以选择能够成倍增加植物属性的微生物和微生物混合物。因为这种方法可利用覆盖广泛微生物多样性的大量个别微生物培养物，所以它更可能比现有方法鉴定出乎意料的微生物协同作用，导致大于预期的植物利益。

实例7：

本发明鉴定微生物以产生不含微生物的培养基或组合物(在这个实例中，“生物刺激素发酵材料”)以用于应用于植物例如番茄以改善其生长的用途：

a)来自任何来源的微生物在两种或更多种(优选大量)混合培养物中发酵，其中使用可支持广泛多样的微生物生长的一般发酵肉汤，或支持具有大量分开但期望性质的微生物生长的一系列选择性或富集培养基；例如，促进放线菌(抗微生物代谢产物)、固氮微生物、磷酸盐利用微生物等生长的培养基。设想可如此生长10-1000+种个别培养物。

b)取出在这些培养物各自中的微生物(例如通过合适过滤，或通过离心)，并且在添加冷冻保护剂后通过在-20℃下致冷或冷冻而贮存用于以后使用。将分离的肉汤应用(例如通过喷雾)于在合适生长培养基中生长的具有期望大小(例如10cm高)的个别番茄植物。

c)在应用后的时期例如一个月，评价植物的生长且选择最大的植物。

d)从贮存中回收与所选植物结合的产生这个肉汤子集的微生物，混合在一起且分成在两种或更多种(优选广泛多样的)不同培养基中生长的两种或更多种(优选大量)传代培养物，其使用在选择过程中提供的信息选择，例如可显而易见的是结果朝向在低氮或高镁培养基中生长的微生物倾斜–在此类情况下，将期望加重在第二次迭代中选择的培养基范围更重地朝向此类培养基的组成中的变动。

e)步骤a)至d)中的过程迭代重复视为有效的多次，其中进行性步骤精炼至越来越少的培养基和越来越窄的微生物多样性，直至用微生物混合物达到对番茄生长的期望效应，所述微生物混合物可鉴定、生长和作为标准起始接种物无限期地贮存用于生产番茄生物刺激素产品。

应当理解这种方法可应用于任何数目的多种植物。虽然该方法就在发酵肉汤中发酵微生物方面进行描述，但应当理解微生物可在可替代培养基中含有。此外，可通过任何合适的方法对植物实施肉汤或培养基，所述方法包括例如直接应用或应用于土壤。本文先前关于将微生物应用于植物和/或其环境描述的方法提供更多例子。此外，虽然这个方法的产物在上文被称为“生物刺激素”，但应当理解所得的产物无需刺激植物的生长，相反可以是具有一些利益的任何培养基或组合物；例如，可支持植物生长、健康和/或存活，包括提供不受疾病和害虫影响的保护。它可单独支持生长和/或健康不是产品的必要条件。最后，提及“植物”应视为包括其种子、幼苗、插枝和/或繁殖体。

实例8：

为了证实谷类作物例如小麦经受住极端天气条件例如干旱的改善能力：

a)优选地，收集在干旱环境例如干草原、沙漠或沙丘中天然生长的植物或作物，并且如实例2中分离微生物，尽管这不是必需的。

b)将微生物应用于优选无菌的植物生长培养基和/或种子。

c)对生长合适时期例如1个月的种子实施有限的水可用性的方案。

d)在水限制下的合适时期后，收获存活的植物，非破坏性评价且就改善的根和/或叶生长进行选择。

e)从所选植物的植物组织中分离微生物，并且如步骤b)中用于接种植物生长培养基/植物。

f)将步骤b)至e)迭代重复需要的多次。

g)从最后迭代中的最佳植物中分离微生物且个别或在混合物中使用，以开发改善在干旱条件下的小麦生长的恢复的产品。

h)在暴露于所选微生物后植物代谢中的有利变化，所述所选微生物改善植物抵抗环境应激物例如提高的盐度、干旱或害虫和疾病攻击的能力。

实例9：

在一些情况下，可期望直接从在目的环境中生长的作物中选择能够赋予期望植物性状的微生物，并且使用这些微生物作为资源以给那种或其他作物赋予该性状。例如，为了改善靶标作物例如玉蜀黍在1个月时在特定播种面积或一般播种区域中的早期生长率：

a)在种植后一个月，从跨越特定播种面积或更一般的目的环境的多块田地中选择最大的个别作物植物，并且如实例2中分离微生物。

b)将来自所选植物的微生物应用于植物生长培养基(优选无菌的)、植物和/或种子和在类似于田地中经历的那些的环境条件下生长高达一个月的植物。

c)一个月后，就性状非破坏性评价玉蜀黍植物，并且基于总生物质、根或叶生物质进行选择。

d)如步骤b)中，从所选植物的植物组织中分离微生物，并且用于接种植物生长培养基/植物。

e)将步骤b)至e)迭代重复需要的多次。

f)从最后迭代中的最佳植物中分离微生物且个别或在混合物中使用，以开发改善未成熟的玉蜀黍植物的生长率的产品。

实例10：

在本发明的一些应用中，可期望(a)制备分离‘系’的迭代微生物选择用于区别的植物性状例如害虫抗性、氮同化作用、干旱抗性，或(b)制备分离‘系’的迭代选择用于相同的植物性状例如靶标植物的生物质生产中的改善，其中迭代选择的微生物群体的‘系’源自通过时间或空间分离的靶标植物微生物群体。在迭代选择的合适时期后，可混合分开最佳化的系，以便开始新一轮的迭代选择用于联合属性，例如害虫抗性加上改善的氮同化作用，害虫抗性加上干旱抗性或可替代地用于作物植物经过整个生长季节的改善生长。例如，对于改善的氮同化作用和线虫抗性分开选择的三叶草结合的微生物系可混合在一起作为起始点，以用于组合属性的迭代联合选择的新系。此外，植物-微生物结合的微生物元素可从发芽到成熟显著不同，例如玉米(玉蜀黍)。在这种情况下，最佳化代表比如2周、6周和12周迭代生长和选择期的迭代玉米选择的分离系，并且随后混合以提供组合经过12周作物生长期的最佳微生物元素的微生物群体。这个新组合随后可用作起始点，用于就最佳化玉米生长至成熟/玉米穗轴生产而选择的新微生物‘系’，或可能用于组合和作为商业产品开发而无需更多最佳化。作为另外一种选择，三个系作为三种区别产品分开开发，所述三种区别产品可序贯地应用于玉米作物，以‘加强’其在作物发育的不同阶段的生长。

实例11：

从能够改善小麦(小麦(triticumaestivum))和玉蜀黍(玉蜀黍(zeamays))生长的不同土壤样品组中获得微生物。

通过下文描述且详述的选择过程获得与两种主要作物玉蜀黍和小麦的组织和根际结合的不同微生物。

简言之，在来自新西兰北岛的已知原产地的广泛多样的土壤样品中由种子生长植物。在成熟时收获来自根组织和根际的微生物并且这些随后用于接种新鲜种子。

在两轮有指导(directed)的选择后，从最大的植物中分离微生物且个别应用。在与微生物一起生长的植物中存在超过在不含微生物的相同条件下生长的对照的叶重的显著增加。

来自四个例子即在低氮条件下生长的玉蜀黍和小麦，以及具有不溶性磷酸盐作为唯一磷源生长的小麦和玉蜀黍的方法和结果在下文给出。

关于所有四个例子的起始点是来自新西兰北岛的已知原产地的151个土壤样品的不同集合。在其中土壤样品含有根的情况下，将这些雾化且加回到土壤样品中。随后将未经处理的小麦和玉蜀黍种子种植到每个样品内。在装满土壤的28ml容器中对于每个植物物种执行十个重复。当需要时，通过添加无菌蛭石或珍珠岩扩展样品。

随后在表1中所示的条件中生长植物，使用自来水作为唯一的水份来源。在合适的生长期后，基于大小选择植物，并且通过在土壤线上1-2cm砍掉叶来收获根和基部茎。用手去除过量土壤，并且将剩余基部茎和根在自来水中轻轻洗涤两次，随后为在无菌蒸馏水中的一次清洗，留下附着至根表面的小土壤颗粒。组合来自每个取样位点的重复植物的湿润根，置于可密封的塑料袋中且破碎。加入无菌水(10ml)，并且随后将样品通过无菌25um尼龙网过滤，以去除植物材料和无脊椎动物害虫。

将所得的微生物悬浮液稀释至合适体积，并且就特定微生物富集或直接用于接种表面灭菌的玉蜀黍和小麦种子。在用微生物接种后，用缺乏n或可溶性p的肥料水溶液给发育中的植物和微生物组合浇水。一般的生长条件在下文详述，并且对于每个例子给出具体方法。

表1:关于所有例子的标准条件

在两次迭代选择后，从最佳个体和最佳表现样品组中分离微生物。随后将分离至纯培养物的微生物应用于个别重复测试中的种子，以鉴定具有增强小麦或玉蜀黍在不存在氮或可溶性磷的情况下的生长的能力的那些。

实例11a：

在氮缺陷土壤中改善的玉蜀黍生长

从151个样品中选择产生大量玉蜀黍生长的玉蜀黍植物用于在实验中使用，以获得在不存在氮的情况下改善玉蜀黍生长的微生物。如上详述制备微生物提取物。将表面灭菌的玉蜀黍种子(玉蜀黍，栽培品种entrée)置于用无菌无n液体肥料(cacl20.1g/l；mgso4.7h2o0.12g/l；kh2po40.1g/l；na2hpo4.2h2o0.15g/l；fecl30.005g/l和由fahraeus描述的痕量矿物质溶液(1957))预湿润至合适水平的无菌蛭石的表面上。对于每种处理制备七个重复，其中每个重复一粒种子。在种子用另外的无菌蛭石轻轻覆盖前，将2ml提取物吸取到每粒种子上。所有处理均用无菌无n肥料浇水，n+处理用添加0.355g/lnh4no3的相同溶液浇水，并且包括无菌蒸馏水处理以测定培养基对植物生长的贡献。在24天生长后的玉蜀黍叶长分析揭示在处理间的区别植物生长，在十个最大的植物组中具有超过不含添加的微生物的对照的显著改善。在第二轮选择中，植物生长培养基包含含有少于54kgn/ha的贫氮土壤(得自paradisevalley,rotorua，新西兰的火山灰表土)。由产生最长平均叶长的35种处理的三株最大的植物(测量的三片最长叶/植物)加上总体处理的15株最大的个别植物制备微生物提取物。用50个微生物提取物各自接种十个重复，并且对于对照种植20个重复。在24天生长后，将玉蜀黍茎在土壤上1cm切割，并且将叶称重。叶重用于选择8株最大的个别植物和具有最高平均植物重量的7个取样位点。由选择的植物和植物组制备微生物提取物。将标准体积(20ul)的这些提取物在总体培养基(每升：酪蛋白水解物0.5g；马铃薯淀粉1.0g；葡萄糖5.0g；甘油5.0g；ccy盐(stewart等人1981)1.0ml；酵母提取物1.0g；k2hpo4(10％w/v)1.0ml；mgso40.1g；kno31.5g；琼脂15.0g)表面上均匀地铺展。在解剖显微镜下检查菌落形态并且将所有微生物指定至形态型。每个形态型的丰度通过形态型的直接显微镜计数进行评价，并且表示为cfu/ml。细菌和真菌分离物随后通过16srdna和18sits测序进行鉴定，并且发现包含不同范围的来自已知含有固氮生物和植物生长促进微生物的属以及在低氮土壤中先前不与植物生长促进相关的一些属的微生物(参见表2)。基于其丰度和可能的效用从这个组中选择由最大的植物培养的六十八个分离物。将这些分离物在1/2tsa琼脂平板(每升：酪蛋白胨15.0g；大豆蛋白胨5.0g；nacl5.0g；琼脂15.0g)上铺展，并且在25℃下生长48小时。随后使用2ml无菌蒸馏水洗涤平板，并且通过在1/2tsa上生长的集落形成单位的直接计数测定每个悬浮液中的微生物数目。将悬浮液稀释至1x10⁷cfu/ml，并且将2ml用于接种表面灭菌的玉蜀黍种子(对于每种处理n＝40)。在26天生长后，切割叶物质且称重。来自前十种处理的植物的平均叶重显示超过不含微生物增加的对照处理的73％增加。表2中所示的值显示与对照相比较导致显著增加的所有微生物处理(p<0.05,fisher’slsd)。

这些结果提供由本发明描述的用于有指导的选择微生物的方法能够鉴定能够改善低氮条件下的玉蜀黍生长的新型微生物组的证据。

表2：当应用于在氮缺陷土壤中生长的玉蜀黍时，产生叶重中的显著增加的所选微生物

^a通过16s/18srdna测序鉴定。

表2的分析允许基于其对植物生长的相对作用并且还包含微生物多样性的合作(consortia)构建。已从最佳表现的样品组中分离的个别微生物以成对组合和高达五种微生物的组合应用于玉蜀黍。在另一个实施例中，将与最高平均叶重相关的十种微生物以等比混合在一起，并且应用于新鲜种子。还将微生物个别应用，以测定微生物组合的任何协同效应。单独和组合的个别微生物对植物的平均重量的显著作用显示于表3中。

表3：与无微生物对照相比较，产生植物平均叶重中的显著增加的应用于在氮有限土壤中生长的玉蜀黍的微生物和微生物合作。

对在氮有限条件下生长的玉蜀黍的合作应用结果明确显示，来自最佳表现的样品组的某些微生物组合产生比单独的个别微生物更大的植物。尽管一些微生物看起来在单独时增加植物大小，但在组中则不。具体地，假单胞菌属菌株(bdnz#54065)在单独应用时显著增加植物大小，但包括这种菌株的合作则不。这可能是由于抗菌化合物的产生。另一方面，杜擀氏属菌株(bdnz#54209)在个别应用时显著增加植物大小，并且在含有这种微生物的组合中也产生比不添加微生物的对照显著更大的植物(表3)。另外，包含在上表3中的最佳处理的五种个别微生物也包含在表3中所示的那些全部中具有最高协同相互作用频率的个别微生物。有趣的是，由从与bdnz54209相同的位点分离的微生物形成的合作也产生比对照显著更大的植物，提供关于在这个实例的迭代中的选择条件下或在样品收集前微生物群体已一起进化的假设的支持。

这些结果证实有指导的选择的过程不仅使得能够鉴定与植物相互作用以赋予所需改善的个别微生物，还使得能够容易鉴定出乎意料地协同执行以产生甚至更大的植物应答的微生物组合。

实例11b：

使用就在体外增溶磷酸盐的能力预先筛选的微生物改善的具有不溶性磷酸盐来源的玉蜀黍生长。

如上文实例11中所述制备在所有151个土壤样品中生长的玉蜀黍植物的微生物提取物。包括富集步骤用于选择与玉蜀黍结合的磷酸盐增溶微生物(psm)。将来自玉蜀黍组织和根际的300μl微生物提取物加入10mlpikovskaya’s液体培养基(pikovskaya,1948)中，并且在室温下伴随搅动温育5天。通过将5μl液体培养物穿刺到pikovskaya’s琼脂内分析psm的存在(参见图3)。将平板在28℃下温育，并且在24小时后测量在每个孔周围的透明区带，指示磷酸盐的增溶。区带基于大小和在0-5量表(0＝无区带，5＝大透明区带)上的澄清度进行视觉评分。基于这些评分选择60个样品进一步继续。

将来自60个选择样品的培养物在4℃和20,000xg下在sorvallrc6离心机(thermoscientific)中离心15分钟。将团块洗涤一次且随后重悬浮于60ml无菌蒸馏水的最终体积中。将玉蜀黍种子(栽培品种entrée)在最终悬浮液中浸泡30分钟。随后将种子(对于每种处理十个重复)种植到装满低营养物火山灰土壤(olsen磷9mg/l，可用的n54kg/ha)的28ml容器中1-2cm的深度处，所述土壤已用含有以磷酸三钙(ca3(po4)2或tcp)形式的不溶性磷酸盐作为唯一磷源的合成肥料饱和。将2ml微生物提取物吸取到每粒种子之上并且随后用土壤覆盖种子。

表4：当应用于具有不溶性磷酸盐作为唯一磷源生长的玉蜀黍时，产生平均叶重中的增加的所选微生物

pscon＝可溶性磷酸盐阳性对照。

使植物生长31天，并且用1/4强度的pi肥料浇水。在这个时间后，将叶切割至土壤水平上1cm，称重且叶重用作植物大小的指示物。随后由剩余的茎和根制备微生物提取物，且用于接种在上文描述的相同低营养物土壤中的表面灭菌的玉蜀黍种子。将每个样品提取物的等分试样合并且高压灭菌，以测定来自微生物提取物的营养物对植物生长的贡献。植物用无磷酸盐肥料浇水。在35天后，将叶切割且称重用于在选择用于分离的样品中使用。由五株最大的个别植物和来自具有最高平均重量的五个取样位点的合并植物制备微生物提取物。将标准体积(20ul)的这些提取物在总体培养基的表面上均匀地展开。在低放大率下检查菌落形态，并且最初将所有微生物指定至形态型。每个形态型的丰度相对于培养的微生物总数目进行评价。分离物随后通过16s/18srdna测序进行鉴定，并且发现包含不同范围的来自已知含有psm的属以及先前未知含有psm的属的微生物。

将由最大的植物培养的分离物在1/2tsa上铺展，并且生长过夜。随后使用2ml无菌蒸馏水洗涤平板，并且通过在1/2tsa上生长的集落形成单位测定每个悬浮液中的微生物数目。将悬浮液稀释至10⁷cfu/ml，并且将2ml用于接种表面灭菌的玉蜀黍种子，所述玉蜀黍种子已通过在潮湿条件中在28℃下温育三天进行预发芽。将种子种植到用于微生物选择的相同低营养物土壤中(对于每种处理n＝40)。在22天后，切割叶物质且称重。七种处理比实施可溶性磷酸盐浇水方案的对照表现更佳，而所有处理均比在不含微生物增加的相同浇水方案下的对照表现更佳。

这些结果提供由本发明描述的用于有指导的选择微生物的方法能够产生显著改善在其中不溶性磷酸盐是提供的唯一磷源的条件中的玉蜀黍生长的新型微生物组的证据。

实例11c：

在其中不溶性磷酸盐是提供的唯一磷源的低磷土壤中改善的小麦生长。

由在151个土壤样品中生长104天的小麦(小麦，栽培品种raffles)的48种最有希望的处理制备微生物提取物。将叶去除至土壤水平上1-2cm并且弃去。随后如实例11a中所述由根、基部茎和根际制备微生物提取物。将表面灭菌的种子种植到装满由无菌肥料溶液饱和的低营养物土壤的十个重复容器中，所述无菌肥料溶液仅含有不溶性磷酸三钙作为磷源。将种子置于土壤的表面上，并且在种子用另外的土壤轻轻覆盖前，将2ml微生物提取物吸取到种子上。在39天后，将叶切割且称重。由具有最高平均重量的15种处理和10株最大的个别植物制备微生物提取物。对于25种处理各自种植20个重复。使植物生长29天的时期，随后切割且称重。再次由四株最大的个别植物的组织和根际和具有最高平均重量的六种处理制备微生物提取物，并且如实例11a中所述在琼脂培养基上铺展。分离物随后通过16srdna测序进行鉴定，并且发现包含不同范围的来自已知含有磷酸盐增溶物种的属以及在具有添加的不溶性磷酸盐的土壤中先前不与植物生长促进相关的一些属的微生物。基于其丰度和可能的效用从这个组中选择由最大的植物培养的八十四个分离物。

所选分离物的纯培养物在琼脂平板上繁殖，收获且稀释至1x10⁷cfu/ml，这之后2ml用于接种表面灭菌的小麦种子(n＝30/处理)。

在21天后，将叶切割且称重。来自前十种处理的植物的平均叶重显示超过用不含添加的微生物的相同不溶性磷酸盐肥料浇水的对照的37％增加。在54种微生物处理中观察到统计显著的增加(表5)。

这些结果提供由本发明描述的用于有指导的选择微生物的方法能够产生显著改善在其中不溶性磷酸盐是加入低磷土壤中的唯一磷源的条件中的小麦生长的新型微生物组的证据。

表5：当应用于具有不溶性磷酸盐作为唯一磷源生长的小麦时，产生叶重中的增加的所选微生物

pi＝不溶性磷酸盐对照。

实例11d：

在氮缺陷的土壤中改善的小麦生长。

由在151个土壤样品中生长104天的小麦的51种最有希望的处理制备微生物提取物。将叶去除至土壤水平上1-2cm并且弃去。随后如实例11a中所述由根、基部茎和根际制备微生物提取物。将表面灭菌的种子种植到装满低营养物土壤且由实例11a中所述的无菌无n肥料溶液饱和的十个重复容器中。n+处理用添加0.355g/lnh4no3的相同溶液浇水。样品处理用无n溶液浇水，并且包括无菌蒸馏水处理用于比较。在40天后的叶重分析揭示在处理间的区别植物生长，其中13种处理产生比不添加微生物的无n对照显著更大的植物。由来自产生最高平均叶重的十种处理的四株最大的植物(合并的)和5株最大的个别植物制备微生物提取物。对于第二轮选择以20个重复/处理将这15个提取物应用于种子，连同n+、无n和无菌水处理。使植物生长29天的时期，随后切割且称重。由三株最大的个别植物和具有最高平均重量的四种处理制备微生物提取物，并且如实例11a中所述在总体琼脂上铺展。79个分离物随后通过16srdna测序进行鉴定，并且发现包含不同范围的来自已知含有固氮物种的属以及在低氮土壤中先前不与植物生长促进相关的属的微生物。

选择42个分离物用于对小麦种子的个别应用。所选分离物的纯培养物在1/2tsa平板上繁殖，收获且稀释至1x10⁷cfu/ml，这之后2ml用于接种表面灭菌的小麦种子(n＝30/处理)。在20天后，将叶切割至土壤水平上1cm且称重。来自前十种处理的植物的平均叶重显示超过用不添加微生物的相同无氮肥料浇水的对照的40％增加。在显示于表6中的36种微生物处理中观察到统计上显著的增加。

表6：显示超过无微生物对照的叶重中的显著增加的应用于小麦的微生物身份

讨论

这个部分中概述的实验的目的是从得自不同位点的151个土壤样品集合获得新型植物生长促进细菌。此处详述的四个例子提供本发明无需使用昂贵和耗时的分子表征即能够快速获得一套植物生长促进微生物的新型菌株的证据。与单独由对单一培养物的实验室测定法获得的其能力了解的微生物执行田地实验相反，这通过将土壤微生物的强壮和多样群体进化至特定目的和植物来达到。以这种方式，在对在土壤环境中未能存活或竞争的有希望的个别微生物进行详细和昂贵的测试前，植物生长促进微生物的获得可转换为集中于捕获且鉴定土壤的整个可培养多样性。此处分离的显示改善小麦和玉蜀黍生长的能力的微生物数目意味着：在微生物可获得的方面和土壤群体可处理的方面，本发明有范例转换希望的能力。在地球上可获得的微生物的遗传多样性是巨大的。可能这些微生物已进化出处理农业今天面临的许多问题的机制。本发明提供了快速鉴定、获得、表征且随后鉴定此类有用微生物的方法。

本发明的方法允许选择与不同植物形成结合且因此给植物赋予一种或多种有利性质的微生物群体，或选择给植物确认一种或多种有利性质的组合物。该方法可用比用于获得植物中的改善的常规技术(例如选择育种和基因工程)快得多的开发速度和少得多的开发成本进行。

本发明人注意到对植物具有潜在用途的许多微生物彼此可能是拮抗性的，并且使用常规方法发现给植物提供靶向多重利益的相容微生物组合的任务可以是繁重的。设想本发明的方法使用在个别培养物中的微生物集合，在快速发现给植物提供多重利益的微生物的相容组合/混合物中是有用的。

可由本发明获得的对植物的潜在利益和/或植物中的改善包括但不限于：

a)植物的叶、茎、根和生殖部分不受无脊椎动物害虫的攻击的保护或对无脊椎动物害虫的攻击的耐受性，所述无脊椎动物害虫例如昆虫、线虫、螨虫、蛞蝓和蜗牛，导致改善的植物生长；

b)植物的叶、茎、根和生殖部分不受微生物的攻击的保护或对微生物的攻击的耐受性，所述微生物引起植物疾病，例如细菌、真菌、寄生虫、古细菌和病毒，导致改善的植物生长。

c)在植物中诱导增加数目的结节。这导致可通过这些植物从大气中“被固定的”氮量中的增加，导致改善的植物生长。

d)起因于来自大气的微生物固氮而不形成结节的改善的植物生长。

e)更有效地来自土壤的磷酸盐的更有效释放，导致改善的植物生长。

f)有利于有益微生物生长的植物的内部微生物生态学的变化，导致改善的植物生长。

g)植物捕获营养物和水以及经受住无生命胁迫的能力的改善，所述无生命胁迫例如干旱或极端温度、光、盐度或ph或由对植物有毒的材料的无机或有机化合物污染，导致改善的植物生长。

本发明在本文中已参考某些优选实施例进行描述，以便使读者能够实践本发明而无需过度实验。然而，具有本领域普通技术的人员将容易认识到许多组分和参数可改变或修饰至某个程度或代替已知等价物，而不背离本发明的范围。应当理解此类修饰和等价物合并入本文，如同它个别阐述一样。此外，提供题目、标题等以增强读者对这个文件的理解，并且不应视为限制本发明的范围。

上文和下文引用的所有申请、专利和出版物(如果存在的话)的整个公开内容在此通过引用合并。然而，对本说明书中的任何申请、专利和出版物的提及不是且不应视为它们构成有效的现有技术或构成全世界任何国家中的普通一般知识的部分的承认或任何形式的暗示。

除非上下文另有要求，在本说明书和下文任何权利要求自始至终，单词“包含”等以与排除含义相反的包括在内的含义解释，即以“包括但不限于”的含义。

参考书目

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