一种细胞冻存方法及细胞冻存液与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及一种细胞冻存方法及细胞冻存液。
背景技术：
：超低温冷冻保存是细胞长期保存的一种有效方法，主要通过降低细胞的代谢率来起到保护作用。液氮(-196℃)保存细胞是最常见的一种细胞长期保存方式，调节和控制细胞生长代谢的各类酶的作用受到极大抑制，使细胞内部的生化反应十分缓慢，甚至停止，从而避免细胞遗传性状的改变，细胞和组织不会丧失形态发生的潜能。但是，冻伤是超低温保护最大的负反应，其原因是冰晶所致的机械性损伤和渗透性损伤。目前细胞冻存主要是快速冻存法，即玻璃化法。但是如果没有采取合适的冻存方法和合适的冷冻保护剂，细胞在冻存过程中容易被冻伤。改进冻存液和冻存方法是改进保存细胞的重要途径，目前很多研究都是改进冻存液和冻存方法来保护细胞尽量免受冻存过程冻伤的情况。目前绝大多数冻存液中含有动物源性的血清成分，而动物源性血清存在传染病毒的风险；因动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致，影响每批试验或生产结果；血清成本很高，加重了生产成本。因此，不含血清的细胞冻存液是将来发展的趋势，有些单位或机构研究无血清细胞冻存液。申请号cn201610322202.7的专利公开了一种无血清细胞冻存液，用于解决冻存液使用不方便、成本高、细胞存活率低的问题。申请号cn201610124499.6的专利公开了一种人脂肪干细胞无血清冻存液及其制备方法。现有无血清的冻存液长期冷冻后解冻，细胞复苏率低，复苏后细胞活性与性能下降，而且无法满足不同细胞长期冻存的需要。目前大多数冻存液中含有动物源性的血清成分，而动物源性血清存在传染病毒的风险；因动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致，影响每批试验或生产结果；含血清后后期的产品安全检验成本会很高，加重了生产成本。尽管目前玻璃化冻存是比较理想的冻存方法，但是它在玻璃化过程还是会形成冰晶损伤细胞，而且复苏后细胞活率低、细胞增殖数量不足、细胞易老化。技术实现要素：本发明实施例提供了一种细胞冻存方法及细胞冻存液，由于该细胞冻存液中不含血清，能够提高细胞复苏率，使细胞复苏后活性与性能高、可满足多种不同细胞长期冻存的需要。为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：本发明实施例提供一种细胞冻存方法，细胞冻存方法包括以下两个步骤：步骤一、将混入细胞的细胞冻存液装入容器1，再将容器1装入容器2，其中，容器1和容器2之间形成真空；步骤二、对步骤一所得的容器2依此执行以下a-d四个步骤：a、利用常温风冷使容器2的温度从常温下降至4℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降3-4℃；b、利用冰箱使容器2的温度从4℃下降至-20℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降1-2℃；c、利用冰箱使容器2的温度从-20℃下降至-80℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降2-3℃；d、将容器2放入液氮罐中冻存，其中，液氮罐的温度为-196℃。进一步地，步骤二具体包括：对步骤一所得的容器2依此执行以下a-d四个步骤：a、利用常温风冷使容器2的温度从常温下降至4℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降4℃；b、利用冰箱使容器2的温度从4℃下降至-20℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降1℃；c、利用冰箱使容器2的温度从-20℃下降至-80℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降2℃；d、将容器2放入液氮罐中冻存，其中，液氮罐的温度为-196℃。进一步地，细胞为表皮干细胞、成纤维细胞、角膜细胞、脂肪干细胞、黑色素细胞、口腔黏膜上皮细胞或者口腔牙龈细胞。进一步地，细胞为第2~7代的细胞。本发明实施例还提供一种细胞冻存液，细胞冻存液应用于如权利要求1-4中任意一项的细胞冻存方法，细胞冻存液包括：dmem/f12、dmso、甘油和血清替代物；其中，dmso在细胞冻存液中的含量为2-10%的dmem/f12的体积；甘油在细胞冻存液中的含量为5-30%的dmem/f12的体积；血清替代物在细胞冻存液中的含量为20-60%的dmem/f12的体积；血清替代物包括羟乙基淀粉、葡聚糖、人血白蛋白、重组人转铁蛋白、人ab血清、表皮生长因子、重组人胰岛素、孕酮、氢化可的松、腐胺、硒酸钠和黄酮。进一步地，羟乙基淀粉的浓度为0.1-10%w/v，葡聚糖的浓度为0.1-10%w/v，人血白蛋白的浓度为0.1-15%w/v，重组人转铁蛋白的浓度为1-10%w/v，人ab血清的浓度为1-10%w/v，表皮生长因子的浓度为0.01-10%w/v，重组人胰岛素的浓度为1-10%w/v，孕酮的浓度为0.01-5%w/v，氢化可的松的浓度为0.01-5%w/v，腐胺的浓度为0.01-5%w/v，硒酸钠的浓度为0.1-5%w/v，黄酮的浓度为0.01-5%w/v。进一步地，甘油在细胞冻存液中的含量为10-25%的dmem/f12的体积。优选的，甘油在细胞冻存液中的含量为15-20%的dmem/f12的体积。进一步地，血清替代物在细胞冻存液中的含量为30-55%的dmem/f12的体积。优选的，血清替代物在细胞冻存液中的含量为35-50%的dmem/f12的体积。优选的，dmso在细胞冻存液中的含量为5-7%的dmem/f12的体积。进一步地，dmem/f12是dmem培养液和f12培养液以体积比3:1的比例混合的。本发明实施例提供一种细胞冻存方法，细胞冻存方法包括以下两个步骤：步骤一、将混入细胞的细胞冻存液装入容器1，再将容器1装入容器2，其中，容器1和容器2之间形成真空；步骤二、对步骤一所得的容器2依此执行以下a-d四个步骤：a、利用常温风冷使容器2的温度从常温下降至4℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降3-4℃；b、利用冰箱使容器2的温度从4℃下降至-20℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降1-2℃；c、利用冰箱使容器2的温度从-20℃下降至-80℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降2-3℃；d、将容器2放入液氮罐中冻存，其中，液氮罐的温度为-196℃。基于上述实施例的描述，由于该细胞冻存液中不含血清，不存在动物性传染病毒风险，适用范围广。通过本发明长期冷冻的细胞解冻后，细胞复苏率高达90%以上，复苏后细胞活性高、不易老化，可满足多种不同细胞长期冻存的需要。附图说明图1为本发明实施例提供的细胞冻存方法冻存6个月的细胞和采用现有方法冻存6个月的细胞的复苏前后的细胞形态比较图；图2为本发明实施例提供的细胞冻存方法冻存6个月的细胞和采用现有方法冻存6个月的细胞的复苏率比较图；图3为本发明实施例提供的细胞冻存液冻存6个月的细胞和采用现有液冻存6个月的细胞的复苏前后的细胞形态比较图；图4为本发明实施例提供的细胞冻存液冻存6个月的细胞和采用现有液冻存6个月的细胞的复苏率比较图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。实施例1本发明实施例提供一种细胞冻存方法，所述细胞冻存方法包括以下两个步骤：步骤一、将混入细胞的细胞冻存液装入容器1，再将所述容器1装入容器2，其中，所述容器1和所述容器2之间形成真空；步骤二、对步骤一所得的所述容器2依此执行以下a-d四个步骤：a、利用常温风冷使所述容器2的温度从常温下降至4℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降3-4℃；b、利用冰箱使所述容器2的温度从4℃下降至-20℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降1-2℃；c、利用冰箱使所述容器2的温度从-20℃下降至-80℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降2-3℃；d、将所述容器2放入液氮罐中冻存，其中，所述液氮罐的温度为-196℃。在一种可能的实现方式中，将表皮干细胞、成纤维细胞、脂肪干细胞、黑色素细胞、口腔黏膜上皮细胞的原代细胞混入冻存液中，分别装入1ml离心管后封口；冻存液由dmem/f12、dmso、甘油和血清替代物组成，所述血清替代物由羟乙基淀、葡聚糖、人血白蛋白、重组人转铁蛋白、人ab血清、表皮生长因子、重组人胰岛素、孕酮、氢化可的松、腐胺、硒酸钠、黄酮、地塞米松组成。接着将装有原代细胞的1ml离心管装入15ml离心管中封口密闭，用冷风以3℃的降温速率冷至4℃；将4℃的15ml离心管放至冰箱180分钟，以1℃降温速率降至-20℃；然后将-20℃的15ml离心管迅速放至-80℃冰箱冻存8小时；最后直接移至液氮-196℃冻存。在另一种可能的实现方式中，将表皮干细胞、成纤维细胞、脂肪干细胞、黑色素细胞、口腔黏膜上皮细胞的原代细胞混入冻存液中，分别装入1ml离心管后封口；冻存液由dmem/f12、dmso、甘油和血清替代物组成，所述血清替代物由羟乙基淀、葡聚糖、人血白蛋白、重组人转铁蛋白、人ab血清、表皮生长因子、重组人胰岛素、孕酮、氢化可的松、腐胺、硒酸钠、黄酮、地塞米松组成。接着将装有原代细胞的1ml离心管装入15ml离心管中封口密闭，用冷风以4℃的降温速率冷至4℃；将4℃的15ml离心管放至冰箱90分钟，以2℃降温速率降至-20℃；然后将-20℃的15ml离心管迅速放至-80℃冰箱冻存12小试；最后直接移至液氮-196℃冻存。需要说明的是，将通过本发明实施例提供的冻存方法冻存6个月的细胞，通过直接放置40℃水域中复苏，观察冻存前与复苏后细胞的形态。与采用现有方法冻存6个月的细胞相比，从图1可以看出，应用本发明的冻存方法，冻存前的细胞与冻存6个月后的细胞形态非常相近，几乎没有变化，说明本发明冻存方法能够在冻存过程对细胞起到很好的保护作用。同时，将本发明实施例提供的冻存方法以及现有常规的冻存方法冻存6个月的细胞，直接放置42℃水域中复苏3分钟，观察复苏后细胞的复苏率，具体实验结果见图2。通过图2发现，本发明冻存方法细胞复苏率明显优于现有冻存方法。本发明实施例提供一种细胞冻存方法，细胞冻存方法包括以下两个步骤：步骤一、将混入细胞的细胞冻存液装入容器1，再将容器1装入容器2，其中，容器1和容器2之间形成真空；步骤二、对步骤一所得的容器2依此执行以下a-d四个步骤：a、利用常温风冷使容器2的温度从常温下降至4℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降3-4℃；b、利用冰箱使容器2的温度从4℃下降至-20℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降1-2℃；c、利用冰箱使容器2的温度从-20℃下降至-80℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降2-3℃；d、将容器2放入液氮罐中冻存，其中，液氮罐的温度为-196℃。基于上述实施例的描述，由于该细胞冻存液中不含血清，不存在动物性传染病毒风险，适用范围广。通过本发明长期冷冻的细胞解冻后，细胞复苏率高达90%以上，复苏后细胞活性高、不易老化，可满足多种不同细胞长期冻存的需要。实施例2本发明实施例提供一种细胞冻存液，所述细胞冻存液应用于如实施例1中任意一项所述的细胞冻存方法，所述细胞冻存液包括：dmem/f12、dmso、甘油和血清替代物；其中，所述dmso在所述细胞冻存液中的含量为2-10%的所述dmem/f12的体积；所述甘油在所述细胞冻存液中的含量为5-30%的所述dmem/f12的体积；所述血清替代物在所述细胞冻存液中的含量为20-60%的所述dmem/f12的体积；所述血清替代物包括羟乙基淀粉、葡聚糖、人血白蛋白、重组人转铁蛋白、人ab血清、表皮生长因子、重组人胰岛素、孕酮、氢化可的松、腐胺、硒酸钠和黄酮。进一步地，所述羟乙基淀粉的浓度为0.1-10%w/v，所述葡聚糖的浓度为0.1-10%w/v，所述人血白蛋白的浓度为0.1-15%w/v，所述重组人转铁蛋白的浓度为1-10%w/v，所述人ab血清的浓度为1-10%w/v，所述表皮生长因子的浓度为0.01-10%w/v，所述重组人胰岛素的浓度为1-10%w/v，所述孕酮的浓度为0.01-5%w/v，所述氢化可的松的浓度为0.01-5%w/v，所述腐胺的浓度为0.01-5%w/v，所述硒酸钠的浓度为0.1-5%w/v，所述黄酮的浓度为0.01-5%w/v。在一种可能的实现方式中，本发明实施例提供的细胞冻存液是按如下比例配置的：10%的dmem/f12体积的dmso、30％的dmem/f12体积的甘油、50%dmem/f12体积的血清替代物及体积比例10%的dmem/f12，其中血清替代物组成比例如下：10%（w/v）羟乙基淀粉、0.1%（w/v）葡聚糖、15%（w/v）人血白蛋白、5%（w/v）重组人转铁蛋白、10%（w/v）人ab血清、0.01%（w/v）表皮生长因子、10%（w/v）重组人胰岛素、5%（w/v）孕酮、5%（w/v）氢化可的松、0.01%（w/v）腐胺、5%（w/v）硒酸钠、0.01%（w/v）黄酮组成。将同等数量的表皮干细胞、成纤维细胞、脂肪干细胞、黑色素细胞混入上述制备的冻存液后，液氮冻存6个月后，均在42℃水域中复苏2分钟，观察冻存前后细胞的形态如图3。从图3可以看出，用本发明的冻存液，冻存前的细胞与冻存6个月后的细胞形态非常相近，几乎没有变化，说明本发明冻存液对细胞的冻存起到了很好地保护作用。在另一种可能的实现方式中，本发明实施例提供的细胞冻存液是按如下比例配置的：2%dmem/f12体积的dmso、30％的dmem/f12体积的甘油、20%dmem/f12体积的血清替代物以及体积比例48%的dmem/f12；其中血清替代物组成比例如下：0.1%（w/v）羟乙基淀粉、10%（w/v）葡聚糖、10%（w/v）人血白蛋白、1%（w/v）重组人转铁蛋白、10%（w/v）人ab血清、0.5%（w/v）表皮生长因子、10%（w/v）重组人胰岛素、0.01%（w/v）孕酮、0.01%（w/v）氢化可的松、0.5%（w/v）腐胺、0.01%（w/v）硒酸钠、5%（w/v）黄酮组成。将表皮干细胞、成纤维细胞、脂肪干细胞、黑色素细胞、角膜细胞、口腔牙龈细胞混入上述制备的冻存液以及商用无血清冻存液后，液氮冻存6个月后，用相同常规复苏方法40℃复苏2分钟，细胞复苏率结果具体见图4。需要补充的是，将表皮干细胞、成纤维细胞、脂肪干细胞、黑色素细胞混入上述制备的冻存液以及商用无血清冻存液后，液氮冻存6个月后，用相同复苏方法复苏后，进行传代培养，观察细胞开始老化代次，具体结果见表1。表1本发明商业化无血清冻存液表皮干细胞p15p9成纤维细胞p21p10脂肪干细胞p15p12黑色素细胞p18p9口腔黏膜模型p24p20通过表1，可以看出，本发明提供的冻存液冻存的细胞在复苏后开始老化代次明显要大于商业化无血清冻存液，说明本发明提供的冻存液冻存后的细胞的活性或性能优于商业化无血清冻存液。还需要补充的是，将现有常规冻存与本发明实施例提供的冻存6个月后细胞采用本发明实施例提到的复苏方法复苏，然后用商业化无血清dmem/f-12连续传代培养，每天更液，观察细胞开始老化的天数，具体实验结果见表。表2本发明现有冻存方法表皮干细胞第10天第6天成纤维细胞第12天第7天脂肪干细胞第18天第10天黑色素细胞第14天第9天口腔黏膜模型第24天第21天通过表2，可以看出，本发明提供的冻存方法冻存的细胞在复苏后开始老化的天数明显要晚于现有冻存方法，即说明本发明提供的冻存方法冻存后的细胞的活性或性能优于现有冻存方法的细胞。以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。当前第1页12