一种培育近异源四倍体玉米材料的方法与流程

本发明属于玉米远缘杂交育种方法领域，具体涉及一种培育近异源四倍体玉米材料的方法。

背景技术：

玉米是粮饲兼用作物，也是重要的工业原料。随着人们生活水平的提高，对玉米的需求也急剧增加。提高单产是提高玉米产量的主要途径，但是由于存在玉米种质遗传基础狭窄问题，限制了突破性玉米品种的培育。因此，为满足生产和生活的需要，迫切需要拓宽和创制新的玉米种质资源。

大刍草和摩擦禾等玉米近缘野生种在长期的进化过程中形成了各种不同的优良基因；如大刍草对玉米大、小斑病有很强的抗性，对某些病毒病免疫，还具有抗逆性强和适应性广等优点；摩擦禾具有良好的抗病虫性，如对玉米根螟、玉米螠管蚜具有抗性，抗锈病、抗玉米大斑病，摩擦禾还具有抗寒、抗旱、耐盐碱等优良特性；此外，摩擦禾还具有籽粒营养丰富，蛋白质含量高，消化率比较高等优点。玉米近缘野生种的这些优良特性可用于拓宽玉米的种质基础。但是由于亲缘关系较远，存在生殖隔离等原因，它们和玉米杂交后存在不能结实，或者杂交后代不育或者育性极低，使近缘野生种的有益基因难以导入到玉米材料中。

mtf-1(tripsazeacreammaizet.，2n＝76)是四川农业大学以引自美国的四倍体玉米(zeamaysl.，4n＝40)和四倍体鸭茅状摩擦禾(或称指状摩擦禾，tripsacumdactyloidesl.，2n＝72)之间的属间杂种f1为母本，以四倍体多年生类玉米(zeaperennis，2n＝40)为父本杂交而获得的玉米异源六倍体；mtf-1的染色体数为76，是一个包含全套玉米染色体组(20条)、鸭茅状摩擦禾染色体组(36条)和四倍体多年生类玉米染色体组(20条)的属间杂种，是一个自然界不存在的新物种。四川农业大学将mtf-1分类命名为玉黍禾属玉淇淋草种，将其拉丁文分类名称命名为tripsazeacreammaizet.。

mtf-1具有雌性可育的特性，以玉米(zeamaysl.)、大刍草(zeaperennisl.)或摩擦禾(tripsacumdactyloidesl.)为父本给mtf-1授粉都可产生结实后代。利用此特性，以mtf-1为桥梁材料，可将大刍草或摩擦禾中的有益基因转移到玉米中。但是由于mtf-1存在多年生、分蘖多等野生特性，其应用受到较大限制。目前，mtf-1主要用于培育多年生、分蘖多且无性繁殖的饲草玉米品种(cn103609428a，cn103548674a)，难以直接在玉米育种中应用。

经检索，没有发现以mtf-1作为桥梁将大刍草和摩擦禾有益基因转育到玉米材料中的报道。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种培育近异源四倍体玉米材料的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种培育近异源四倍体玉米新材料的方法，包括如下步骤：

(1)、在吐丝散粉期，以mtf-1(tripsazeacreammaizet.，2n＝76)为母本，以玉米(zeamaysl.,2n＝20)为父本进行杂交，成熟时收获种子，获得f1代；

(2)、种植f1代，在抽雄期用碘-碘化钾染色法对f1代材料进行花粉育性检测；选择花粉有育性的植株进行自交，成熟时收获种子，获得f2代；

(3)、种植f2代，从三叶期开始至抽雄期前均可取根尖，采用基因组原位杂交的方法对根尖染色体数目和染色体组成进行鉴定，并对f2代植株的分蘖数进行调查；在抽雄期用碘-碘化钾染色法对花粉育性进行检测；选择根尖染色体总数为41～43条，其中含有玉米(zeamaysl.)染色体数25～26条、四倍体多年生类玉米(zeaperennisl.)染色体数14～15条、指状摩擦禾(tripsacumdactyloidesl.)染色体数1～2条、分蘖数为1～3个，且花粉育性大于40％的植株进行自交，成熟时收获种子，获得f3代；

(4)、种植f3代，按照步骤(3)所述的基因组原位杂交方法对根尖染色体数和染色体组成进行鉴定，并在抽雄期用碘-碘化钾染色法对花粉育性进行检测；选择染色体总数为39～40条，其中含有玉米染色体数24～28条、四倍体多年生类玉米染色体数12～15条、指状摩擦禾染色体数0～2条，无分蘖、且花粉育性大于50％的植株进行自交，成熟时收获种子，获得f4代；

(5)、种植f4代，按照步骤(3)所述基因组原位杂交方法对根尖染色体数和染色体组成进行鉴定，并在抽雄期用碘-碘化钾染色法对花粉育性进行检测；检测结果中染色体总数为38～40条，其中含玉米染色体数为22～28条、四倍体多年生类玉米染色体数为12～15条、指状摩擦禾染色体数为0～2条，无分蘖、且花粉育性大于70％的植株；这种染色体总数在40条左右，且同时含有玉米、四倍体多年生类玉米或指状摩擦禾两个或两个以上物种染色体组的植株，即为本发明近异源四倍体玉米材料；对所选植株自交留种。

上述方法步骤(1)中所述的mtf-1(tripsazeacreammaizet.，2n＝76)(苏月贵，四川农业大学硕士论文，2009)是四川农业大学以引自美国的四倍体玉米(zeamaysl.4n＝40)和四倍体鸭茅状摩擦禾(或称指状摩擦禾，tripsacumdactyloidesl.，2n＝72)之间的属间杂种f1为母本，以四倍体多年生类玉米(zeaperennis，2n＝40)为父本杂交育成的玉米异源六倍体；mtf-1的染色体数为76，是一个包含全套玉米染色体组(20条)、鸭茅状摩擦禾染色体组(36条)和四倍体多年生类玉米染色体组(20条)的属间杂种，是一个自然界不存在的新物种。

所述的玉米异源六倍体mtf-1(tripsazeacreammaizet.)为多年生，无性繁殖，植株茁壮，直立丛生，根系发达；抽雄时期平均株高为310cm，抽雄期后株高最高可达335cm，主茎粗9.8-12.9mm，抽雄期单株分蘖达50-60个，分蘖与主茎茎粗差异不明显，且整个生命周期中不断生成新的根分蘖；叶片深绿细长，叶长61-81cm，叶宽5.1-5.9cm，单个茎秆叶片数为20-23片；主茎顶端雄花属圆锥花序，花序长27-30cm，花粉高度不育，茎秆节点上着生5-7个分枝，分枝顶端为穗状花序的雌花，9-18个小穗在穗轴上呈双行或四行对生排列。植株雄穗、叶鞘和苞叶均为深紫色。mtf-1杂交可获得少量种子，种子颖壳坚硬，呈褐色或灰褐色。植株抗寒抗涝能力强，在0-5及长期水淹条件下仍能持续长出新分蘖。

mtf-1主要通过分兜繁殖、茎秆扦插或其他无性繁殖方式等无性繁殖方法进行繁殖。公众可从四川农业大学获得mtf-1(tripsazeacreammaizet.2n＝76)生物材料。

上述方法步骤(1)中所述的玉米是指自交系、杂交种、农家种或综合种等。

上述方法步骤(2)、(3)、(4)或(5)中所述的碘-碘化钾染色法参照苏月贵硕士论文(四川农业大学硕士论文，2009)。

上述方法步骤(3)、(4)或(5)中所述的基因组原位杂交方法参照tangq等2005年公开的方法(tangq等.cropsci,2005,45:717-721)。

上述方法步骤(5)中所述的近异源四倍体玉米材料，其染色体数为40条左右(约为玉米染色体基数10的4倍)，且染色体来源于不同的物种(同时含有玉米，四倍体多年生类玉米和/或指状摩擦禾的染色体)，故称为近异源四倍体玉米。

上述方法中选育出的近异源四倍体玉米材料，可以用来组配杂交材料，可作为中间桥梁材料，将近缘野生种的优良基因导入到普通二倍体玉米中，拓宽玉米的种质基础。

本发明具有的优点和有益效果：本发明首次育成染色体总数为40条左右、并包含玉米和四倍体多年生类玉米染色体，或还含有摩擦禾染色体的、有育性的近异源四倍体玉米材料，即本发明首次育成了非整倍性染色体情况下花粉可育的近异源四倍体玉米。该近异源四倍体玉米的性状逐渐趋向于二倍体玉米，并且花粉育性高，可作为桥梁将四倍体多年生类玉米或摩擦禾等近缘野生种中存在的有益基因转移到栽培玉米中，为拓宽玉米种质基础提供了很好的工具，同时也为玉米基因功能等遗传研究提供了很好的材料。

附图说明

图1.为实施例1步骤(2)中f1代的双色基因组原位杂交显微照片。

图2.为实施例1步骤(2)中f1代的花粉育性检测显微照片。

图3.为实施例1步骤(3)中f2代双色基因组原位杂交显微照片。

图4.为实施例1步骤(3)中f2代花粉育性检测显微照片。

图5.为实施例1步骤(4)中f3代双色基因组原位杂交显微照片。

图6.为实施例1步骤(4)中f3代花粉育性检测显微照片。

图7.为实施例1步骤(5)中f4代双色基因组原位杂交显微照片。

图8.为实施例1步骤(5)中f4代花粉育性检测显微照片。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明做进一步的解释和说明，但是不对本发明保护范围构成任何限制。

实施例1：本发明近异源四倍体玉米材料的培育

(1)、2011年4月，在温江农场种植玉米自交系mo17和玉米异源六倍体mtf-1(tripsazeacreammaizet.，2n＝76；公众可从四川农业大学获取mtf-1的生物材料)；2011年6月，以玉米异源六倍体mtf-1为母本，以mo17为父本进行杂交，成熟时收获种子，获得f1代，保存于-20℃冰箱中；

(2)、2012年4月，从-20℃冰箱中取出f1代种子，在四川农业大学温江农场种植f1代；2012年5月中旬至6月中旬取f1根尖，用基因组原位杂交方法((参见tangq等.cropsci,2005,45:717-721))进行染色体数目和染色体组成鉴定，结果发现f1代材料的染色体总数为35-86条,其中含有玉米染色体数(以下简称为：mz)为12-30条，四倍体多年生类玉米染色体数(以下简称为zp)为8-20条，指状摩擦禾染色体数(以下简称为tr)为15-36条，且不同物种染色体之间发生部分易位。2012年6月用碘-碘化钾染色法(参照苏月贵，四川农业大学硕士论文，2009)对f1代材料进行花粉育性检测，发现编号为f1-31的材料花粉有育性，其育性为37.5％(见图2)；f1-31材料的染色体数目为54条，其中含有mz为28条，zp为11条，tr为15条(见图1)；通过对f1-31的农艺性状观察，发现f1-31植株为一年生，植株分蘖数为3个，且种子部分被颖壳包被，脱粒困难；由于f1-31有育性，所以对其进行自交，成熟时收获，得f2代；

(3)、2013年4月，在四川农业大学温江农场种植f2代，2013年5月至6月取根尖用基因组原位杂交方法进行染色体数目和染色体组成的鉴定选择染色体数目为41-43条，其中mz为25-26条,zp为14-15条,tr为1-2条(见图3，染色体总数为43条，其中2tr+15zp+26mz)，分蘖数为1-3个，花粉育性为大于40％(见图4)的植株自交，共自交9株，对f2代农艺性状观察，发现f2中大部分植株表现为栽培玉米型，无分蘖、主茎粗壮，f2中各农艺性状还处于疯狂分离阶段,大部分种子依然被颖壳包被，但有部分种子已经开始裸露，种子脱粒困难；于2013年8月下旬至9月上旬收获种子，获得f3代。

(4)、2014年4月，在四川农业大学温江种植f3代材料，2014年5月至6月取f3代材料根尖，按照步骤(2)中所述基因组原位杂交方法对f3代材料进行染色体数目和组成的鉴定；在抽雄期用碘-碘化钾染色法对花粉育性进行检测；选择染色体数目为39-40条，其中含有mz为24-28条，zp为12-15条，tr为0-2条，(见图5，染色体总数为39条，其中包括mz24条和zp15条)，无分蘖，花粉育性为大于50％(见图6)的植株自交，共自交70株；通过对f3材料的农艺性状观察，发现f3植株多数为栽培玉米型，主茎纤细、无分枝，大部分果穗的籽粒裸露，容易脱粒，少部分籽粒被颖壳包被，脱粒困难；于2014年8月下旬至9月上旬收获种子，获得f4代。

(5)、2015年4月，在四川农业大学温江种植f4代材料，2015年5月至6月取f4代材料根尖，按照步骤(2)中所述的基因组原位杂交方法对f4代材料进行染色体数目和染色体组成的鉴定；选择f4材料中染色体总数为38-40条，其中含有mz22-28条，zp12-15条，tr0-2条(见图7，染色体总数40条，其中包括mz24条和zp15条)；无分蘖，花粉育性为大于70％(见图8)的植株，即为本发明近异源四倍体玉米材料；将所选136株自交；对f4材料的农艺性状观察，发现f4材料多数植株表现为栽培玉米型，极少数植株分蘖、无分枝、主茎纤细，几乎所有籽粒已经完全裸露，籽粒形态也越来越趋向普通玉米，并且脱粒较为容易，2015年8月下旬至9月上旬收获种子，保留收获的种子。

实施例2本发明近异源四倍体玉米材料的应用

(1)2016年10月，在四川农业大学云南西双版纳基地种植实施例1所得的近异源四倍体玉米17株，同时种植同源四倍体玉米v182。

(2)2016年12月，以步骤中(1)所述的近异源四倍体玉米为母本，以v182为父本杂交授粉；2017年2月获得杂交种；所得杂交种籽粒形态大而饱满。

(3)2017年3月，在四川农业大学温江种植步骤(2)中获得的杂交种种子20粒，成活18株，成活率为90％；所得杂交材料茎秆粗壮，叶片绿而肥大，生长势优于其亲本材料(近异源四倍体玉米或同源四倍体玉米v182)，具有明显的杂种优势。

(4)2017年6月，在抽雄期用碘-碘化钾染色法方法对杂交种花粉育性进行检测，结果表明其花粉有育性，因此，可以进行遗传基因的传递。

上述结果说明本发明非整倍性的近异源四倍体玉米雌性可育，以其作为母本与玉米杂交，可产生可育的杂交后代，因而，本发明近异源四倍体玉米材料可作为将近缘野生种中的优良基因转移至玉米中的桥梁材料。

实施例3本发明近异源四倍体玉米材料的应用

(1)2016年10月，在四川农业大学云南西双版纳基地种植实施例1所得的近异源四倍体玉米材料14株，同时种植玉米自交系mo17。

(2)2016年12月，以mo17为母本，以步骤中(1)所述的近异源四倍体玉米为父本杂交授粉；2017年2月获得杂交种；所得杂交种籽粒形态大而饱满。

(3)2017年3月，在四川农业大学温江种植步骤(2)中获得的杂交种种子48粒，成活23株，成活率为48％；所得杂交材料茎秆粗壮，叶片绿而肥大，生长势优于其亲本材料(近异源四倍体玉米或玉米自交系mo17)，具有明显的杂种优势。2017年6月，在抽雄期用碘-碘化钾染色法方法对杂交后代花粉育性进行检测，检测结果其花粉有育性。

以上结果说明本发明非整倍性的近异源四倍体玉米材料有育性，产生正常的花粉，用其作为父本给玉米材料授粉，并可产生杂交后代，因此，可作为将近缘野生种中的优良基因转移至玉米中的桥梁材料。