本发明属于植物生物技术领域，涉及一种促进罗汉果ugt71v1基因表达的方法。
背景技术：
罗汉果甜苷v属于葫芦烷型四环三萜类物质，申请人前期根据罗汉果转录组数据，已推导出甜苷v可能的生物合成途径。罗汉果甜苷v生物合成的前体物质是异戊烯二磷酸(ipp)和3,3-二甲基烯内基焦磷酸(dmapp)，二者是通过甲羟戊酸(mva)和甲基赤藓糖醇磷酸化(mep)两条途径形成，mva途径发生在胞质中，mep途径发生在质体中。来源于上述两途径的ipp或dmapp经牻牛儿基焦磷酸合酶(gps)催化形成牻牛儿基焦磷酸(gpp)，ipp与gpp在法呢基焦磷酸合酶(fps)的催化作用下进而形成法呢基焦磷酸(fpp)，然后经角鲨烯合酶(ss)、角鲨烯环氧化酶(se)的催化形成2,3-氧化角鲨烯，葫芦二烯醇合酶(cs)进一步催化形成葫芦二烯醇，最后在cyp450酶和葡萄糖基转移酶(ugt)的作用下，形成罗汉果甜苷v。
异戊二烯类物质的产生受到限速酶活性的严格调控，一直被认为在其生物合成途径中起着重要的调控作用。作为异戊二烯途径中的限速酶，ugt基因的表达对罗汉果甜苷v的生物合成起着决定性作用。过表达ugt基因，可以促进罗汉果甜苷v的积累；相反，如果抑制ugt基因的表达，罗汉果甜苷v的产量将显著降低。然，ugt基因是个超基因家族，申请人前期研究发现，ugt71v1可能参与罗汉果甜苷v的合成途径。现有技术中未见有促进罗汉果ugt71v1基因表达的报道。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种促进罗汉果ugt71v1基因表达的方法。
为此，本发明提供的技术方案为：
一种促进罗汉果ugt71v1基因表达的方法，包括如下步骤：在罗汉果组培过程中和罗汉果栽培过程中，施加浓度50-400μmol/l的茉莉酸甲酯，以促进罗汉果ugt71v1基因的表达。
优选的是，所述的促进罗汉果ugt71v1基因表达的方法中，所述罗汉果组培过程中，将所述茉莉酸甲酯添加到所述罗汉果组培过程中的固体培养基中。
优选的是，所述的促进罗汉果ugt71v1基因表达的方法中，所述罗汉果栽培过程中，于罗汉果授粉后20～30天后，向罗汉果表面喷洒所述浓度50-400μmol/l的茉莉酸甲酯至其表面滴水为止，每天于早上、中午和晚上各喷洒一次，连续喷施5天。
优选的是，所述的促进罗汉果ugt71v1基因表达的方法中，所述罗汉果组培过程中所述固体培养基包含：ms，1.5mg/l6-ba，0.3mg/liba，3.5g/l琼脂，30g/l蔗糖和1.0g/l活性炭。
优选的是，所述的促进罗汉果ugt71v1基因表达的方法中，所述罗汉果组培过程中的培养条件为：于相对湿度60-66％，光照强度1400lux，光照时间8h/d和温度21～25℃条件下培养30d。
优选的是，所述的促进罗汉果ugt71v1基因表达的方法，还包括：茉莉酸母液配制：用2％(v/v)的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，得到灭菌后的茉莉酸甲酯母液；
将该茉莉酸甲酯母液添加到罗汉果组培过程中的固体培养基中，至茉莉酸甲酯的终浓度为50-400μmol/l；
用乙醇助溶，将茉莉酸甲酯母液配成50-400μmol/l的溶液，施加于所述罗汉果栽培过程中。
优选的是，所述的促进罗汉果ugt71v1基因表达的方法中，还包括如下步骤：
qrt-pcr检测ugt71v1基因的表达：
1)采集罗汉果果实，切成2-4mm小块并分别用锡箔纸包好，立即置于液氮中速冻，保存于-80℃备用；
2)采用trizol法提取罗汉果果实总rna；
3)将rna反转录为cdna；
4)采用abi7500实时荧光定量pcr仪检测ugt71v1基因的表达量，其中，扩增ugt71v1的引物序列为：上游引物ccggaattccaccaccaccaccaccacatgaagaagtttgagctagtttca，下游引物cggaattcttactctcctccttctggcccg，内参基因用ubq5基因，扩增引物序列为：上游引物ataaaagacccagcaccacattc，下游引物cccttgccgactacaacatcc。
优选的是，所述的促进罗汉果ugt71v1基因表达的方法中，还包括：所述罗汉果栽培过程中，向罗汉果表面喷洒的茉莉酸甲酯的温度为8～12℃，同时，还采用注射的方式将茉莉酸甲酯注射入罗汉果植株的主茎中，注射量为6～15ml，注射的速率为3～5ml/h。
本发明至少包括以下有益效果：
(1)本发明通过在罗汉果组培苗和栽培罗汉果施加茉莉酸甲酯，短期内快速诱导罗汉果甜苷v生物合成途径中关键酶基因ugt71v1的高表达，为促进罗汉果甜苷v含量的积累打下坚实基础；
(2)本发明操作简便，成本低，对环境友好，适于规模化生产，具有较强的实用性和推广价值。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种促进罗汉果ugt71v1基因表达的方法，包括如下步骤：在罗汉果组培过程中和罗汉果栽培过程中，施加浓度50-400μmol/l的茉莉酸甲酯，以促进罗汉果ugt71v1基因的表达。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述罗汉果组培过程中，将所述茉莉酸甲酯添加到所述罗汉果组培过程中的固体培养基中。
在上述方案中，作为优选，所述罗汉果组培过程中所述固体培养基包含：ms，1.5mg/l6-ba，0.3mg/liba，3.5g/l琼脂，30g/l蔗糖和1.0g/l活性炭。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述罗汉果栽培过程中，于罗汉果授粉后20～30天后，向罗汉果表面喷洒所述浓度50-400μmol/l的茉莉酸甲酯至其表面滴水为止，每天于早上、中午和晚上各喷洒一次，连续喷施5天。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述罗汉果组培过程中的培养条件为：于相对湿度60-66％，光照强度1400lux，光照时间8h/d和温度21～25℃条件下培养30d。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，还包括：茉莉酸母液配制：用2％(v/v)的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，得到灭菌后的茉莉酸甲酯母液；
将该茉莉酸甲酯母液添加到罗汉果组培过程中的固体培养基中，至茉莉酸甲酯的终浓度为50-400μmol/l；
用乙醇助溶，将茉莉酸甲酯母液配成50-400μmol/l的溶液，施加于所述罗汉果栽培过程中。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，还包括如下步骤：
qrt-pcr检测ugt71v1基因的表达：
1)采集罗汉果果实，切成2-4mm小块并分别用锡箔纸包好，立即置于液氮中速冻，保存于-80℃备用；
2)采用trizol法提取罗汉果果实总rna；
3)将rna反转录为cdna；
4)采用abi7500实时荧光定量pcr仪检测ugt71v1基因的表达量，其中，扩增ugt71v1的引物序列为：上游引物ccggaattccaccaccaccaccaccacatgaagaagtttgagctagtttca(seqidno:1)，下游引物cggaattcttactctcctccttctggcccg(seqidno:2)，内参基因用ubq5基因，扩增引物序列为：上游引物ataaaagacccagcaccacattc(seqidno:3)，下游引物cccttgccgactacaacatcc(seqidno:4)。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，还包括：所述罗汉果栽培过程中，向罗汉果表面喷洒的茉莉酸甲酯的温度为8～12℃，同时，还采用注射的方式将茉莉酸甲酯注射入罗汉果植株的主茎中，注射量为6～15ml，注射的速率为3～5ml/h。在罗汉果栽培过程中，向罗汉果表面喷洒此温度的茉莉酸甲酯溶液，对罗汉果的果实给予一定的冷刺激，能够进一步诱导ugt71v1基因的表达。将茉莉酸甲酯直接注射于罗汉果体内，能够便于罗汉果植株对其的直接吸收，进一步加大吸收效率，且由于是直接注射到体内，冷刺激更加明显，能够进一步促进ugt71v1基因的表达。
实施例1
一种促进罗汉果ugt71v1基因表达的方法，包括以下步骤：
(1)罗汉果组培苗施加茉莉酸甲酯；用2％的乙醇水溶液(v/v)溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固体培养基中，至茉莉酸甲酯最终浓度为50μmol/l，灭菌并冷却至24℃；固体培养基配比为ms+6-ba1.5mg/l+iba0.3mg/l+3.5g/l琼脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。将罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中，置于相对湿度60％、光照强度1400lux，光照时间8h/d，温度23℃条件下培养30d。
(2)栽培罗汉果施加茉莉酸甲酯；用少量乙醇助溶，将茉莉酸甲酯原液配成50μmol/l的溶液，喷洒于授粉后20d的罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施5d。
同时设置对比例1，
1)将罗汉果组培苗接种于不含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养；
2)不对罗汉果植株喷洒茉莉酸甲酯；其他条件与实施例1一致。
(3)qrt-pcr检测ugt71v1基因的表达。
采集果实，挑取果肉，切成2mm小块并分别用锡箔纸包好，立即置于液氮中速冻，保存于-80℃备用。
采用改良trizol法提取罗汉果果实总rna。
采用abi7500实时荧光定量pcr仪。
将rna反转录为cdna的反应体系为rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反应条件为37℃(15min)→85℃(5s)→4℃。
采用primerpremier5.0软件设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中，ugt71v1引物序列为(fp：ccggaattccaccaccaccaccaccacatgaagaagtttgagctagtttca，rp：cggaattcttactctcctccttctggcccg)，内参基因用ubq5，序列为(fp：ataaaagacccagcaccacattc，rp：cccttgccgactacaacatcc)。
qrt-pcr反应体系(20μl)为sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl。反应条件为95℃(30s)，接着进行40个cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。
qrt-pcr检测结果显示，对比例1中，罗汉果ugt71v1基因的表达量为1，而实施例1中，罗汉果ugt71v1基因的表达量高达5.6，较对比例1提高了460％，可见，实施例1可以显著促进罗汉果ugt71v1基因的高表达；hplc检测结果显示，对比例1中，罗汉果甜苷v含量为0.72％，而实施例1中，罗汉果甜苷v含量高达1.81％，较对比例1提高了151.39％，可见，实施例1还可以显著促进罗汉果甜苷v产量的提高。
实施例2
一种促进罗汉果ugt71v1基因表达的方法，包括以下步骤：
(1)罗汉果组培苗施加茉莉酸甲酯；用2％的乙醇水溶液(v/v)溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固体培养基中，至茉莉酸甲酯最终浓度为400μmol/l，灭菌并冷却至26℃；固体培养基配比为ms+6-ba1.5mg/l+iba0.3mg/l+3.5g/l琼脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。将罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中，置于相对湿度66％、光照强度1400lux，光照时间8h/d，温度21℃条件下培养30d。
(2)栽培罗汉果施加茉莉酸甲酯；用少量乙醇助溶，将茉莉酸甲酯原液配成400μmol/l的溶液，喷洒于授粉后30d的罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施5d。
同时设置对比例2，
1)将罗汉果组培苗接种于不含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养；
2)不对罗汉果植株喷洒茉莉酸甲酯；其他条件与实施例1一致。
(3)qrt-pcr检测ugt71v1基因的表达。
采集果实，挑取果肉，切成4mm小块并分别用锡箔纸包好，立即置于液氮中速冻，保存于-80℃备用。
采用改良trizol法提取罗汉果果实总rna。
采用abi7500实时荧光定量pcr仪。
将rna反转录为cdna的反应体系为rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反应条件为37℃(15min)→85℃(5s)→4℃。
采用primerpremier5.0软件设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中，ugt71v1引物序列为(fp：ccggaattccaccaccaccaccaccacatgaagaagtttgagctagtttca，rp：cggaattcttactctcctccttctggcccg)，内参基因用ubq5，序列为(fp：ataaaagacccagcaccacattc，rp：cccttgccgactacaacatcc)。
qrt-pcr反应体系(20μl)为sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl。反应条件为95℃(30s)，接着进行40个cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。
qrt-pcr检测结果显示，对比例2中，罗汉果ugt71v1基因的表达量为1，而实施例2中，罗汉果ugt71v1基因的表达量高达15.3，较对比例2提高了1430％，可见，实施例2可以显著促进罗汉果ugt71v1基因的高表达；hplc检测结果显示，对比例2中，罗汉果甜苷v含量为0.72％，而实施例2中，罗汉果甜苷v含量高达2.72％，较对比例2提高了277.78％，可见，实施例2还可以显著促进罗汉果甜苷v产量的提高。
实施例3
一种促进罗汉果ugt71v1基因表达的方法，包括以下步骤：
(1)罗汉果组培苗施加茉莉酸甲酯；用2％的乙醇水溶液(v/v)溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固体培养基中，至茉莉酸甲酯最终浓度为225μmol/l，灭菌并冷却至24-26℃；固体培养基配比为ms+6-ba1.5mg/l+iba0.3mg/l+3.5g/l琼脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。将罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中，置于相对湿度63％、光照强度1400lux，光照时间8h/d，温度25℃条件下培养30d。
(2)栽培罗汉果施加茉莉酸甲酯；用少量乙醇助溶，将茉莉酸甲酯原液配成225μmol/l的溶液，喷洒于授粉后25d的罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施5d。
同时设置对比例3，
1)将罗汉果组培苗接种于不含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养；
2)不对罗汉果植株喷洒茉莉酸甲酯；其他条件与实施例1一致。
(3)qrt-pcr检测ugt71v1基因的表达。
采集果实，挑取果肉，切成3mm小块并分别用锡箔纸包好，立即置于液氮中速冻，保存于-80℃备用。
采用改良trizol法提取罗汉果果实总rna。
采用abi7500实时荧光定量pcr仪。
将rna反转录为cdna的反应体系为rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反应条件为37℃(15min)→85℃(5s)→4℃。
采用primerpremier5.0软件设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中，ugt71v1引物序列为(fp：ccggaattccaccaccaccaccaccacatgaagaagtttgagctagtttca，rp：cggaattcttactctcctccttctggcccg)，内参基因用ubq5，序列为(fp：ataaaagacccagcaccacattc，rp：cccttgccgactacaacatcc)。
qrt-pcr反应体系(20μl)为sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl。反应条件为95℃(30s)，接着进行40个cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。
qrt-pcr检测结果显示，对比例3中，罗汉果ugt71v1基因的表达量为1，而实施例3中，罗汉果ugt71v1基因的表达量高达20.7，较对比例3提高了1970％，可见，实施例3可以显著促进罗汉果ugt71v1基因的高表达；hplc检测结果显示，对比例3中，罗汉果甜苷v含量为0.76％，而实施例3中，罗汉果甜苷v含量高达2.96％，较对比例3提高了289.47％，可见，实施例3还可以显著促进罗汉果甜苷v产量的提高。
实施例4
一种促进罗汉果ugt71v1基因表达的方法，包括以下步骤：
(1)罗汉果组培苗施加茉莉酸甲酯；用2％的乙醇水溶液(v/v)溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固体培养基中，至茉莉酸甲酯最终浓度为100μmol/l，灭菌并冷却至24-26℃；固体培养基配比为ms+6-ba1.5mg/l+iba0.3mg/l+3.5g/l琼脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。将罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中，置于相对湿度64％、光照强度1400lux，光照时间8h/d，温度24℃条件下培养30d。
(2)栽培罗汉果施加茉莉酸甲酯；用少量乙醇助溶，将茉莉酸甲酯原液配成300μmol/l的溶液，置于冰箱中降温，使茉莉酸甲酯的温度降至8～12℃，再喷洒于授粉后23d的罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施5d。同时，还采用注射的方式将茉莉酸甲酯注射入罗汉果植株的主茎中，注射量为6～15ml，注射的速率为3～5ml/h。
同时设置对比例4
1)将罗汉果组培苗接种于不含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养；
2)不对罗汉果植株喷洒和注射茉莉酸甲酯；其他条件与实施例4一致。
(3)qrt-pcr检测ugt71v1基因的表达。
采集果实，挑取果肉，切成2-4mm小块并分别用锡箔纸包好，立即置于液氮中速冻，保存于-80℃备用。
采用改良trizol法提取罗汉果果实总rna。
采用abi7500实时荧光定量pcr仪。
将rna反转录为cdna的反应体系为rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反应条件为37℃(15min)→85℃(5s)→4℃。
采用primerpremier5.0软件设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中，ugt71v1引物序列为(fp：ccggaattccaccaccaccaccaccacatgaagaagtttgagctagtttca，rp：cggaattcttactctcctccttctggcccg)，内参基因用ubq5，序列为(fp：ataaaagacccagcaccacattc，rp：cccttgccgactacaacatcc)。
qrt-pcr反应体系(20μl)为sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl。反应条件为95℃(30s)，接着进行40个cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。
qrt-pcr检测结果显示，对比例4中，罗汉果ugt71v1基因的表达量为1，而实施例4中，罗汉果ugt71v1基因的表达量高达20.1，较对比例4提高了1910％，可见，实施例4可以显著促进罗汉果ugt71v1基因的高表达；hplc检测结果显示，对比例4中，罗汉果甜苷v含量为0.76％，而实施例4中，罗汉果甜苷v含量高达2.87％，较对比例4提高了277.63％，可见，实施例4还可以显著促进罗汉果甜苷v产量的提高。
这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的促进罗汉果ugt71v1基因表达的方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
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<110>韦荣昌
<120>促进罗汉果ugt71v1基因表达的方法
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