一种绿僵菌分生孢子微胶囊及其制备方法和应用与流程

本发明属于利用虫生真菌防治林业及农业害虫技术领域，具体涉及一种绿僵菌分生孢子微胶囊及其制备方法和应用。

背景技术：

大量使用高毒化学杀虫剂仍然是目前农林害虫防治中常用的方法，不仅污染环境，影响食品安全，而且杀伤天敌、害虫容易产生抗药性。随着无公害农林产品和向往优美生态环境的社会需求日益增长，国家越来越强调绿色协调可持续的经济发展理念，更加重视减少化学农药的使用，大力提倡生物农药的发展。

虫生真菌是一类能够寄生并杀死昆虫的真菌，在害虫综合治理、天敌保护和生态平衡中等方面发挥重要作用。虫生真菌通过孢子侵入昆虫体壁，随后着生大量菌丝吸取寄主营养、破坏寄主组织使昆虫死亡。然而，虫生真菌杀虫剂对环境条件较为敏感，野外的抗逆性和稳定性相对较差，而且制剂的货架期寿命很短，严重制约了其大规模商品化应用和发展。因此，有必要发展新型微生物农药剂型以提高生物杀虫剂的稳定性和抗逆性，并延长其货架期。

微胶囊技术是一种利用成膜材料的化学和物理特征通过化学和物理反应将目标物包覆使其形成微小粒子的技术。利用微胶囊技术加工而成的生物制剂为微胶囊制剂，它是一种新型剂型加工技术，能有效提高活性物的稳定性和抗逆性。

申请号为201110457248.7的中国发明专利申请公开一种白僵菌微胶囊技术，该微胶囊由白僵菌分生孢子和高岭土搅拌均匀分散在水中，加入1％w/v海枣酸钠为芯材，乳化分散在以正十六烷、玉米油和卵磷脂溶剂中形成油包水的乳化液，往油包水的乳化液中加入0.5m氯化钙水溶液，使钙离子与海藻酸钠交联形成固定的囊壁而制得粒径小于100um的微胶囊。由于氯化钙是水溶性分子，而加入油性的分散剂(正十六烷、玉米油和卵磷脂)中与分散的海藻酸钠反应具有较大的困难。因此，该方法仍有待于进一步完善和优化。

申请号为201410185758.7的中国发明专利公开一种爪哇棒孢霉菌微胶囊制备方法。该微胶囊以爪哇棒孢霉菌的孢子分散在0.01％的吐温水得到菌悬液为囊芯，以明胶和阿拉伯胶为囊壁，通过复凝聚法将壁材直接附着在孢子表面制得微胶囊。但是在利用该方法制备绿僵菌微胶囊时，我们反复试验却始终不能直接在绿僵菌孢子表面成囊。

金龟子绿僵菌(metarhiziumanisopliae)是一类重要的虫生真菌，寄主范围极广，常用于防治金龟子幼虫、白蚁、红火蚁等土栖性害虫的防治。现有技术中未见针对高毒力绿僵菌菌株而制备抗逆性强、杀虫效果优良的微胶囊制剂。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中绿僵菌杀虫剂在实际应用中存储期短、抗逆性差等缺点，提供一种储存期长、具有较强抗逆性的绿僵菌分生孢子微胶囊及其制备方法和应用。

本发明的第一个目的是提供一种绿僵菌分生孢子微胶囊。

本发明的绿僵菌分生孢子微胶囊，包括芯材和壁材，其特征在于，采用复凝聚法制备，所述的芯材包括绿僵菌分生孢子粉与二甲基硅油；所述的壁材包括a型明胶和阿拉伯胶。

优选，所述的芯材包括质量比为0.5～1.5：20的绿僵菌分生孢子粉和二甲基硅油，所述的壁材包括质量比为1：1～2的a型明胶和阿拉伯胶，所述的芯材与壁材质量比为1：1。

更优选的，所述的芯材包括质量比为1：20的绿僵菌分生孢子粉和二甲基硅油，所述的壁材包括质量比为1：1的a型明胶和阿拉伯胶，所述的芯材与壁材质量比为1：1。

优选，所述的绿僵菌为金龟子绿僵菌m09菌株。

优选，所述的芯材含水量小于5％、绿僵菌分生孢子含量在1×10¹¹个/ml以上。

本发明的第二个目的是提供一种绿僵菌分生孢子微胶囊的制备方法。

本发明的绿僵菌分生孢子微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

s1.囊芯制备：将绿僵菌分生孢子粉与二甲基硅油按照质量比0.5～1.5：20的比例混合，搅拌混匀得到芯材溶液；

s2.乳化液制备：将2％w/v的a型明胶和2％～4％w/v的阿拉伯胶溶液等体积混合，搅拌均匀，制备得到壁材；再加入与壁材等质量的芯材溶液，在超高速转速下剪切乳化，得到水包油乳液；

s3.微胶囊制备：进行复凝聚反应成囊，收集微胶囊，将微胶囊均匀喷洒在滑石粉中，干燥得到绿僵菌分生孢子微胶囊。

优选，所述的乳化液制备步骤为：45℃条件下，将2％w/v的a型明胶和2％～4％w/v的阿拉伯胶溶液等体积混合，搅拌均匀，制备得到壁材；放置在25～80℃的水浴条件下；再加入与壁材等质量的芯材溶液，在转速10000r/min下剪切混合液5-10min进行乳化，得到水包油乳液。

优选，所述的微胶囊制备步骤为：将水包油乳液转移到磁力搅拌器上，调节转速为500-700r/min，并将乳液温度逐渐升高至35-50℃；向乳液中缓慢滴加10％v/v的醋酸，将乳液ph值调节至4.0进行成囊反应，反应时间为10-15min，对乳液进行降温，待温度降至10℃以下时，静置溶液使微胶囊沉降，4℃离心3-5min，收集微胶囊，将微胶囊悬浮在少量冰水中分散，然后将微胶囊均匀喷洒在滑石粉中，干燥得到绿僵菌分生孢子微胶囊。

本发明的第三个目的是提供所述的绿僵菌分生孢子微胶囊在防治害虫中的应用。

优选，所述的害虫为红火蚁、金龟子幼虫或白蚁。

本发明的微胶囊是针对具有生物活性的分生孢子为囊芯，经过实验摸索选择了绿僵菌分生孢子粉与二甲基硅油为囊芯，a型明胶和阿拉伯胶为壁材。本发明通过特殊方法处理，未使用对分生孢子具有毒性的醛类等固化剂，所生产的微胶囊不仅活性高，而且绿色环保、无毒安全。本发明的微胶囊制剂显著提高了绿僵菌的抗紫外能力，延长了分生孢子的储藏时间，对红火蚁的杀虫毒力也较强；克服了绿僵菌孢子野外应用抗逆性差的缺点，显著提高了对农林害虫的防治效果；具有重要的市场应用和推广价值。

附图说明

图1是制备绿僵菌分生孢子微胶囊流程图。

图2是壁材比例对微胶囊形态的影响；a：m明胶/m阿拉伯胶＝3:1；b：m明胶/m阿拉伯胶＝2:1；c：m明胶/m阿拉伯胶＝1:1；d：m明胶/m阿拉伯胶＝1:2。

图3是壁材质量分数对微胶囊形态的影响；a＝4％；b＝2％；c＝1％；d＝0.5％。

图4是芯壁比(w/w)对微胶囊形态的影响；a＝1：4；b＝1：2；c＝1：1；d＝2：1。

图5是ph对微胶囊形态的影响；a＝5.5；b＝5.0；c＝4.5；d＝4.0。

图6是温度对微胶囊形态的影响；a＝35℃；b＝40℃；c＝45℃；d＝50℃。

图7是搅拌速度对微胶囊形态的影响；a＝100r/min；b＝300r/min；c＝500r/min；d＝700r/min。

图8是金龟子绿僵菌m09菌株分生孢子微胶囊抗紫外线照射能力。

图9是金龟子绿僵菌m09菌株分生孢子微胶囊在不同存储时间的孢子萌发率。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步说明本发明，实施例并不限定本发明的应用范围。如无特殊说明，本发明采用的实验试剂、设备和方法均为本技术领域的常规试剂、设备和方法。

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

本发明实施例所用的绿僵菌分生孢子为金龟子绿僵菌m09菌株(metarhiziumanisopliaem09)分生孢子。

实施例1：绿僵菌分生孢子微胶囊的制备

图1为绿僵菌分生孢子微胶囊的制备方法流程图，详细方法如下所述：

s1.囊芯制备：将绿僵菌分生孢子粉与二甲基硅油按照质量比1：20(g/g)的比例混合，在常温下通过涡旋搅拌充分混匀得到芯材溶液。

s2.乳化液制备：将浓度均为2％w/v的a型明胶和阿拉伯胶溶液等体积混合，搅拌均匀，制备得到壁材；放置在25～80℃的室温或水浴条件下，防止重新形成凝胶。再加入与壁材等质量的芯材溶液，在超高速转速10000r/min下剪切混合液10min进行乳化，得到油滴大小均匀、分散均匀稳定的水包油乳液。

s3.微胶囊制备：将水包油乳液转移到磁力搅拌器上，调节转速为500r/min，并将溶液温度逐渐升高至40℃。向溶液中缓慢滴加10％v/v醋酸，将溶液ph值调节至4.0使壁材在油滴表面凝聚而进行成囊反应成囊，反应时间为10min。利用冰块对溶液进行降温，待温度降至5℃以下时，静置溶液使微胶囊沉降，倾去大部分上清液，得到高浓度微胶囊悬浮液。冷冻离心机4℃中低速离心3min浓缩微胶囊，待微胶囊离心至管底后，倒去上层水溶液，收集微胶囊，将微胶囊悬浮在少量冰水中分散，然后用喷雾器将微胶囊均匀喷洒在滑石粉中，滑石粉吸附微胶囊水分，室温干燥得到微胶囊粉剂。

实施例2：单因素优化微胶囊制备工艺

按照实施例1所述方法制备绿僵菌分生孢子微胶囊粉剂，采用单因素优化法针对壁材比例、壁材质量分数、芯壁比、成囊ph、成囊温度、搅拌速度对微胶囊制备工艺进行优化。结果表明，在一定的处理条件下，壁材比例(明胶质量：阿拉伯胶质量)、壁材质量分数、芯壁比和搅拌速度对微胶囊的形成具有较大的影响，而ph因素对微胶囊的形态影响较小(图2-5，图7)。当壁材比例为3：1或2：1时，微胶囊粘连成团，而壁材比例为1：1和1：2时，微胶囊大小均匀，成囊效果较好。在其它条件不变的情况下，温度在35～50℃之间对微胶囊成囊效果没有影响(图6)。

实施例3：优化的绿僵菌分生孢子微胶囊的制备方法(a)

s1.囊芯制备：将绿僵菌分生孢子粉与二甲基硅油按照质量比0.5：20(g/g)的比例混合，在常温下通过涡旋搅拌充分混匀得到含水量小于5％、孢子含量1×10¹¹个/ml以上的金龟子绿僵菌分生孢子油悬浮液即为芯材溶液。

s2.乳化液制备：取适量a型明胶，40℃水浴加热条件下溶解形成质量浓度为2％w/v的a型明胶溶液，另取与a型明胶等量的阿拉伯胶，加蒸馏水并水浴加热至40℃，在500r/min的速率下缓慢搅拌形成质量浓度为2％w/v的阿拉伯胶溶液；所述a型明胶与阿拉伯胶溶液均放置在40℃水浴锅中保温备用。45℃条件下，将浓度均为2％w/v的a型明胶和阿拉伯胶溶液等体积混合均匀，搅拌3min，制备得到壁材；放置在25～50℃的水浴条件下，防止重新形成凝胶。再加入与壁材等质量的芯材溶液，在超高速转速10000r/min下剪切混合液5min进行乳化，得到油滴大小均匀、分散均匀稳定的水包油乳液。

s3.微胶囊制备：将水包油乳液转移到磁力搅拌器上，调节转速为500～600r/min，并将乳液温度逐渐升高至35-40℃。向乳液中缓慢滴加10％v/v醋酸，将乳液ph值调节至4.0使壁材在油滴表面凝聚而进行成囊反应成囊，反应时间为10min。利用冰块对乳液进行降温，待温度降至10℃以下时，静置乳液使微胶囊沉降，倾去大部分上清液，得到高浓度微胶囊悬浮液。冷冻离心机4℃2000r/min离心3min浓缩微胶囊，待微胶囊离心至管底后，倒去上层水溶液，收集微胶囊，将微胶囊悬浮在少量冰水中分散，然后用喷雾器将微胶囊均匀喷洒在滑石粉中，滑石粉吸附微胶囊水分，滑石粉与微胶囊的体积比为1：1，室温干燥得到绿僵菌分生孢子微胶囊，其形状规整，粒径均匀，粒径约为40～50um。

实施例4：优化的绿僵菌分生孢子微胶囊的制备方法(b)

s1.囊芯制备：将绿僵菌分生孢子粉与二甲基硅油按照质量比1：20(g/g)的比例混合，在常温下通过涡旋搅拌充分混匀得到含水量小于5％、孢子含量1×10¹¹个/ml以上的金龟子绿僵菌分生孢子油悬浮液即为芯材溶液。

s2.乳化液制备：取适量a型明胶，40℃水浴加热条件下溶解形成质量浓度为2％w/v的a型明胶溶液，另取与a型明胶等量的阿拉伯胶，加蒸馏水并水浴加热至40℃，在500r/min的速率下缓慢搅拌形成质量浓度为2％w/v的阿拉伯胶溶液；所述a型明胶与阿拉伯胶溶液均放置在40℃水浴锅中保温备用。45℃条件下，将浓度均为2％w/v的a型明胶和阿拉伯胶溶液等体积混合均匀，搅拌3min，制备得到壁材；放置在40-60℃的水浴条件下，防止重新形成凝胶。再加入与壁材等质量的芯材溶液，在超高速转速10000r/min下剪切混合液10min进行乳化，得到油滴大小均匀、分散均匀稳定的水包油乳液。

s3.微胶囊制备：将水包油乳液转移到磁力搅拌器上，调节转速为500～600r/min，并将乳液温度逐渐升高至40-50℃。向乳液中缓慢滴加10％v/v醋酸，将乳液ph值调节至4.0使壁材在油滴表面凝聚而进行成囊反应成囊，反应时间为15min。利用冰块对乳液进行降温，待温度降至6℃以下时，静置乳液使微胶囊沉降，倾去大部分上清液，得到高浓度微胶囊悬浮液。冷冻离心机4℃2000r/min离心3min浓缩微胶囊，待微胶囊离心至管底后，倒去上层水溶液，收集微胶囊，将微胶囊悬浮在少量冰水中分散，然后用喷雾器将微胶囊均匀喷洒在滑石粉中，滑石粉吸附微胶囊水分，滑石粉与微胶囊的体积比为1：1，室温干燥得到绿僵菌分生孢子微胶囊，其形状规整，粒径均匀，粒径约为40～50um。

实施例5：优化的绿僵菌分生孢子微胶囊的制备方法(c)

s1.囊芯制备：将绿僵菌分生孢子粉与二甲基硅油按照质量比1.5：20(g/g)的比例混合，在常温下通过涡旋搅拌充分混匀得到含水量小于5％、孢子含量1×10¹¹个/ml以上的金龟子绿僵菌分生孢子油悬浮液即为芯材溶液。

s2.乳化液制备：取适量a型明胶，40℃水浴加热条件下溶解形成质量浓度为2％w/v的a型明胶溶液，另取阿拉伯胶，加蒸馏水并水浴加热至40℃，在500r/min的速率下缓慢搅拌形成质量浓度为4％w/v的阿拉伯胶溶液；所述a型明胶与阿拉伯胶溶液均放置在40℃水浴锅中保温备用。45℃条件下，取等体积的a型明胶和阿拉伯胶溶液混合均匀，搅拌5min，制备得到壁材；放置在60-80℃的水浴条件下，防止重新形成凝胶。再加入与壁材等质量的芯材溶液，在超高速转速10000r/min下剪切混合液10min进行乳化，得到油滴大小均匀、分散均匀稳定的水包油乳液。

s3.微胶囊制备：将水包油乳液转移到磁力搅拌器上，调节转速为600-700r/min，并将乳液温度逐渐升高至40-50℃。向乳液中缓慢滴加10％v/v醋酸，将乳液ph值调节至4.0使壁材在油滴表面凝聚而进行成囊反应成囊，反应时间为15min。利用冰块对乳液进行降温，待温度降至4℃以下时，静置乳液使微胶囊沉降，倾去大部分上清液，得到高浓度微胶囊悬浮液。冷冻离心机4℃2000r/min离心5min浓缩微胶囊，待微胶囊离心至管底后，倒去上层水溶液，收集微胶囊，将微胶囊悬浮在少量冰水中分散，然后用喷雾器将微胶囊均匀喷洒在滑石粉中，滑石粉吸附微胶囊水分，滑石粉与微胶囊的体积比为1：1，室温干燥得到绿僵菌分生孢子微胶囊，其形状规整，粒径均匀，粒径约为35～50um。

实施例6：绿僵菌分生孢子微胶囊抗逆性能测定

将实施例4制备得到的绿僵菌孢子微胶囊经紫外照射3h后加入双蒸水中，待囊壁充分吸水破裂后，释放出孢子，然后将悬浮液在25±1℃、120r/min的恒温摇床中震荡培养6h后，测定孢子的萌发率。结果表明，经紫外照射处理，微胶囊的孢子萌发率显著高于常规分生孢子的萌发率(f3,12＝175.04,p<0.001)，而经紫外照射的微胶囊处理孢子萌发率和常规孢子对照及微胶囊对照之间无显著差异(图8)，说明绿僵菌分生孢子的微胶囊制剂在自然条件下能够显著增强其抵抗紫外线的能力。

实施例7：绿僵菌分生孢子微胶囊储藏性能测试

将实施例4制备得到的绿僵菌孢子微胶囊放置在阴凉干燥条件下，经放置0、1、2、3个月后，在各时间点取出部分微胶囊放入双蒸水中，待囊壁充分吸水破裂后，释放出孢子，然后将悬浮液在25±1℃、120r/min的恒温摇床中震荡培养6h后，测定各放置时间段孢子的萌发率。结果表明，在刚制备好的微胶囊和常规孢子的萌发率没有显著差异，但是储存一个月后，微胶囊的孢子萌发率显著高于常规孢子的萌发率(p<0.05)(图9)，存储3个月后，常规孢子的平均萌发率只有44.16％，而微胶囊的孢子平均萌发率仍然高达82.38％，说明分生孢子的微胶囊制剂能够延长绿僵菌的货架期。

实施例8：绿僵菌分生孢子微胶囊杀虫活性测定

将实施例4制备得的绿僵菌分生孢子微胶囊粉剂拌入湿润的沙质土囊中，测定微胶囊对红火蚁的毒力。具体方法为秤取20g细沙(18目)放入方形盒中，加入不同剂量的微胶囊粉剂(2g，4g，6g，8g)，加入8ml水，搅拌混匀。将红火蚁工蚁放入试验盒中，将试验盒置于恒温恒湿的培养箱中25±1℃、85％rh，测试红火蚁不同时间的死亡率。结果如表1所示，随着时间的延长，红火蚁的死亡率逐渐增加，说明绿僵菌微胶囊需要先通过吸水破壁，孢子逐渐萌发才能发挥侵染能力。此外，6g和8g剂量微胶囊的条件下在第7天红火蚁的死亡率分别高达85.71％和92.86％，说明绿僵菌分生孢子微胶囊对红火蚁具有较强的侵染能力。

表1绿僵菌分生孢子微胶囊对红火蚁的毒力测定结果