一种鲎素肽-载银复合抗菌剂及制备方法与流程

本发明属于抗菌剂技术领域，尤其是涉及一种鲎素肽-载银复合抗菌剂的制备方法。

背景技术：

随着人们经济水平的提升，人们对生活品质的要求也越来越高。从医疗到饮用水消毒处理，从卫生陶瓷制品到纤维服装等等方面，其安全性、无菌性都备受人们关注，这使得抗菌材料成为当今研究和开发的热点之一。目前所用的大部分抗菌试剂是经过化学修饰的天然化合物，如头孢菌素类、碳青霉烯类等，也有纯人工合成的磺胺类药物等，这些抗菌剂都很容易引起细菌抗药性，随着人们的大量使用，细菌耐药性时有发生，已经严重威胁到人们的生命安全。寻求新型抗菌材料势在必行。

随着细菌抗药性的频繁发生，寻求新抗菌剂的需求越来越受到重视。常规的抗菌剂有有机抗菌剂、无机抗菌剂和天然抗菌剂。随着人们对生活质量的要求的提高，低毒或无毒的无机抗菌剂和天然抗菌剂越来越受到人们的关注。

无机抗菌剂主要有Ag、Cu、Zn等金属离子抗菌剂。其中Ag抗菌剂是一种古老而有效的抗菌剂，也是目前在实际应用中应用最多的无机抗菌剂。但是过量的银会造成细胞的毒化。据报道，在200ug/ml纳米银的浓度下，48h的大米细胞成活率小于60％，而将Ag负载在二氧化硅上，在200ug/ml纳米银的浓度下，48h的大米细胞成活率却大于90％。所以Ag负载在载体上形成的抗菌剂越来越受到关注和应用，既含有较高的抗菌性又含极少量银的产品将是未来发展的方向。目前最常采用的纳米银负载有：沸石、二氧化硅、石墨烯、碳纤维及水滑石等。近年来人们开始研究无机和天然复合抗菌剂，无机抗菌剂抗菌范围广、安全性高、抗菌性、有效期长的优点和天然抗菌剂安全无毒，抗菌效率高的优点相结合，避免了单纯无机抗菌剂化学活性不稳定的不足，以及单纯天然抗菌剂提取加工困难、抗菌功能有限，广谱长效性较弱的不足。另外由于两种不同抗菌机理的抗菌剂结合，将会增加细菌产生抗药性的难度，所以可以很好的避免细菌产生抗药性。

鲎素肽是一种具有17氨基酸且含2个二硫键的β-折叠结构的抗菌肽。它是1988年Nakamura T.等从中国鲎血细胞碎屑里用酸提取法得到的。它通过和细菌脂糖形成复合物，在低浓度下就能抑制革兰氏阴性及阳性细菌的生长。鲎素在低pH、高温下相当稳定，是一种很有应用潜力的抗菌活性物质。但是与无机抗菌剂相比，其抗菌性能明显不足。

制备新型复合抗菌剂是一项备受关注的研究。但是目前关于无机抗菌剂和天然抗菌剂复合的研究文献较少，将鲎素肽作为载体与银结合构成鲎素肽-载银复合抗菌剂还没有这方面的研究与报道，本发明申请具备专利法所说的创造性。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供一种鲎素肽-载银复合抗菌剂及制备方法。

本发明采用的技术方案是：一种鲎素肽-载银复合抗菌剂，抗菌剂以分子筛为载体，载体上负载银离子和鲎素肽。

优选地，分子筛为微孔分子筛或介孔分子筛；

优选地，微孔分子筛采用Naβ；

优选地，介孔分子筛采用MCM41。

优选地，银离子和鲎素肽通过连接剂连接，连接剂为PEG和PEG衍生物。

一种鲎素肽-载银复合抗菌剂的制备方法，将银负载在分子筛上形成载银抗菌剂，再用连接剂将鲎素肽连接到负载在分子筛上的银离子上形成鲎素肽-载银复合抗菌剂。

具体步骤如下：

步骤一将分子筛溶于水中，加入AgNO₃溶液，搅拌混匀，调pH值形成初混合液；

步骤二向初混合液中加入PVP乙醇溶液，在氮气环境下搅拌6h，过滤洗涤干燥后煅烧得到载银抗菌剂；

步骤三将鲎素肽溶于PBS中，加入连接剂并搅拌均匀，再加入载银抗菌剂，氮气环境下搅拌均匀，干燥后得到鲎素肽-载银复合抗菌剂；

优选地，步骤二煅烧温度为100-300℃。

优选地，步骤一中银负载量为1-10％。

优选地，步骤三中鲎素肽添加量是鲎素肽和载银抗菌剂总质量的10-80％。

优选地，步骤三中连接剂添加量为鲎素肽和载银抗菌剂总质量的10-50％。

优选地，步骤三中连接剂为PEG和PEG衍生物中的一种或多种。

鲎素肽-载银复合抗菌剂在抗菌纱布、创可贴或阴道抑菌用品中的应用；

优选地，阴道抑菌用品为液体剂型、栓、丸、抑菌器形态中的一种。

本发明具有的优点和积极效果是：

1、本发明所制备的复合抗菌剂极大提高了鲎素肽的抗菌性，与目前的载银抗菌剂相比也提高了抗菌性，同时还极大降低了复合抗菌剂中Ag的含量，有效降低细胞的毒化概率，使复合抗菌剂更绿色、无毒；

2、通过Ag离子释放实验，发现本发明鲎素肽-载银复合抗菌剂的Ag释放速度小于目前载银抗菌剂，同样小于硝酸银类抗菌剂，说明该复合抗菌剂具有很好的缓释作用，抗菌效果更佳，抗菌时间更长；

3、由于鲎素肽的抑菌机理和银离子抑菌机理不同，多种抑菌机理作用下，细菌不容易产生抗药性，本发明有效解决了目前细菌抗药性的问题；

4、本发明的复合抗菌剂具有很好的协同作用，具有绿色、无毒、高效、长效、广谱等优点，可以用于抗菌纱布、阴道抑菌栓、创可贴等多个方面，并能够显著提高抗菌纱布、阴道抑菌栓、创可贴等医疗用品的抑菌性，具有潜在的社会效益和经济效益。

附图说明

图1是本发明实施例所得到MCM41系列XRD图；

图2是本发明实施例所合成MCM41系列样品的FT-IR图；

图3是本发明实施例所合成MCM41系列的EDS和SEM图；其中图3(a)为MCM41-1％Ag的电子分布图；图3(b)为载银的SEM图；图3(c)为各个元素比例图示；

图4是本发明实施例所合成样品的Ag释放量示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方案对本发明进一步说明，其具体实施方案应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。

一种鲎素肽-载银复合抗菌剂的制备方法，该方法先是通过PVP化学还原法使纳米银按一定比例负载在分子筛载体上形成载银抗菌剂，然后通过PEG、PEG-NHS ester等PEG衍生物作为连接剂将鲎素肽与载银抗菌剂上的载银紧密结合在一起，得到鲎素肽-载银复合抗菌剂。其中载银抗菌剂银负载量为1-10％，试验发现采用任意比例的鲎素肽和载银抗菌剂均能够获得鲎素肽-载银复合抗菌剂，并具有抗菌效果，经试验发现，当采用鲎素肽添加量是鲎素肽和载银抗菌剂总质量的10-80％时会产生更好的抗菌效果，普遍抑菌率>50％，pH＝6-8，同样的连接剂的添加和选择可以根据鲎素肽添加量的多少进行选择，连接剂过多也不会过于影响连接效果，多余的连接剂能够在后续合成步骤中除去，试验发现连接剂添加量为鲎素肽和载银抗菌剂总质量的10-50％时能够满足连接需要，并尽量减少浪费。鲎素肽-载银复合抗菌剂可以用于抗菌纱布、创可贴阴道抑菌用品、等多个方面，并能够显著提高抗菌纱布、阴道抑菌用品、创可贴等医疗用品的抑菌性，具有潜在的社会效益和经济效益。当鲎素肽-载银复合抗菌剂用于阴道抑菌用品时，可以为液体剂型、栓、丸、抑菌器形态中的一种，根据需要选择不同剂量的鲎素肽-载银复合抗菌剂制成不同形态的阴道抑菌用品。

鲎素肽-载银复合抗菌剂的具体制备方法如下：

步骤一：取2g分子筛载体溶于200ml水中，然后按照1％-10％的银负载量加入0.001g/L的AgNO₃溶液，超声10min，然后搅拌均匀，用1M NaOH溶液把pH值调到10-11范围的碱性；

步骤二：将30ml PVP乙醇溶液慢慢加入到上述溶液中，在通氮气下，室温搅拌6h，真空过滤，洗涤，室温干燥，在100℃-300℃温度下煅烧得到载银抗菌剂；

步骤三：将0.1g鲎素肽冻干粉溶于0.5-1.0mlPBS(磷酸缓冲液，pH＝7.4)中，加入0.02g-0.05连接剂，在4℃下搅拌3h，然后加入0.01g-0.1g上述所得到的载银抗菌剂，在氮气保护下，搅拌过夜，真空干燥2h，即得到鲎素肽-载银复合抗菌剂成品。

本方法中分子筛载体可采用微孔分子筛或介孔分子筛，微孔分子筛采用Naβ，介孔分子筛采用MCM41。连接剂为PEG和PEG衍生物中的一种或多种，PEG衍生物可采用PEG-NHS ester。

实施例1

一种鲎素肽-载银复合抗菌剂的制备方法，包括步骤如下：

1)取2g MCM41载体溶于200ml水中，然后按照1-10％的银负载量加入0.001g/L的AgNO₃溶液，超声10min，然后搅拌均匀，用1M NaOH溶液把pH值调到10范围的碱性；

2)将30ml PVP(3-5倍硝酸银质量的)乙醇溶液慢慢加入到上述溶液中，在通氮气(N₂)下，室温搅拌6h，真空过滤，洗涤，室温干燥，在100℃温度下煅烧得到粉末状载银抗菌剂MCM41-Ag；

3)将0.1g鲎素肽冻干粉溶于0.5mlPBS(磷酸盐缓冲液，pH＝7.4)中，加入0.02g PEG衍生物(PEG-NHS ester)，在4℃下搅拌3h，然后加入0.1g上述所得到的MCM41-Ag载银抗菌剂，在氮气保护下，搅拌过夜，真空干燥2h，即得到鲎素肽-载银复合抗菌剂成品，具体结构及性质见图1、2、3、4。

实施例2

1)取2g MCM41载体溶于200ml水中，然后按照1-10％的银负载量加入0.001g/L的AgNO₃溶液，超声10min，然后搅拌均匀，用1M NaOH溶液把pH值调到11的碱性；

2)将30ml PVP(3-5倍硝酸银质量的)乙醇溶液慢慢加入到上述溶液中，在通氮气(N₂)下，室温搅拌6h，真空过滤，洗涤，室温干燥，在300℃温度下煅烧得到粉末状载银抗菌剂MCM41-Ag；

3)将0.1g鲎素肽冻干粉溶于1.0mlPBS(磷酸盐缓冲液，pH＝7.4)中，加入0.02gPEG和0.02g PEG-NHS ester，在4℃下搅拌3h，然后加入0.02g上述所得到的MCM41-Ag载银抗菌剂，在氮气保护下，搅拌过夜，真空干燥2h，即得到鲎素肽-载银复合抗菌剂成品。具体结构及性质见图1、2、4。

实施例3

1)取2g Naβ载体溶于200ml水中，然后按照1-10％的银负载量加入0.001g/L的AgNO₃溶液，超声10min，然后搅拌均匀，用1M NaOH溶液把pH值调到11的碱性；

2)将30ml PVP(3-5倍硝酸银质量的)乙醇溶液慢慢加入到上述溶液中，在通N₂下，室温搅拌6h，真空过滤，洗涤，室温干燥，在100℃温度下煅烧得到粉末状载银抗菌剂；

3)将0.1g鲎素肽冻干粉溶于0.5mlPBS(磷酸盐缓冲液，pH＝7.4)中，加入0.03g PEG-NHS ester，在4℃下搅拌3h，然后加入0.1g上述所得到的载银抗菌剂，在氮气保护下，搅拌过夜，真空干燥2h，即得到鲎素肽-载银复合抗菌剂成品，具体结构及性质见图2、4。

实施例4

1)取2g Naβ载体溶于200ml水中，然后按照1-10％的银负载量加入0.001g/L的AgNO₃溶液，超声10min，然后搅拌均匀，1M NaOH溶液把pH值调到10范围的碱性；

2)将30ml PVP(3-5倍硝酸银质量的)乙醇溶液慢慢加入到上述溶液中，在通N₂下，室温搅拌6h，真空过滤，洗涤，室温干燥，在200℃温度下煅烧得到粉末状载银抗菌剂；

3)将0.1g鲎素肽冻干粉溶于0.8mlPBS(磷酸盐缓冲液，pH＝7.4)中，加入0.05g PEG，在4℃下搅拌3h，然后加入0.9g上述所得到的载银抗菌剂，在氮气保护下，搅拌过夜，真空干燥2h，即得到鲎素肽-载银复合抗菌剂成品，具体结构及性质见图2、4。

通过图1和图3能够看到，载银抗菌剂上银离子均匀负载的情况；如图2所示，分别对MCM41，不同银负载量载银抗菌剂，鲎素肽-载银复合抗菌剂和未添加连接剂的鲎素肽，载银抗菌剂混合物进行检测，如图所示能够看出，连接剂对鲎素肽和银离子是具有连接作用的；图4通过比对硝酸银，纳米银，载银抗菌剂和鲎素肽-载银复合抗菌剂的银离子释放量能够看出鲎素肽-载银复合抗菌剂释放量较慢，说明该复合抗菌剂具有很好的缓释作用，抗菌效果更佳，抗菌时间更长。相应的，为了验证复合抗菌剂的抑菌性也做了相应试验。

考察本发明载体为MCM41制备的鲎素肽-载银复合抗菌剂MCM41-Ag/T系列产品对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的抑菌性。将所得的MCM41-Ag/T系列样品以及空白对比样品，配制成需要的浓度，然后每一种分装到两个试管中，试管中保持5ml样品液。注射用水作为对照物。取菌悬液100ul滴于5ml样液中，开始计时，作用5min计时一次。5min时各取0.5ml样液，投入5mlPBS缓冲液试管中，充分混合得A。然后稀释做2个梯度。从取1ml样液加入到9mlPBS试管中，充分混合得B，从B中取1ml样液加入到9mlPBS试管中。然后将上述做的梯度吸0.5ml放入平板中，加入15ml 40-50度的营养琼脂培养液，混合均匀后，将其放入37℃48h做活菌计数。真菌用沙氏琼脂培养液，放入27℃ 72h做活菌计数。

然后按照下述公式进行计算抑菌率：

其中，C₀代表参照物中菌数，C代表含抗菌剂的菌数，R为抑菌率。

结果如表1-2。

表1实施例1中MCM41-Ag、MCM41-Ag/T和鲎素肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的抑菌率

表2实施例2中MCM41-Ag、MCM41-Ag/T和鲎素肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的抑菌率

考察本发明载体为Naβ制备的鲎素肽-载银复合抗菌剂Naβ-Ag/T系列产品对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的抑菌性。将所得的Naβ-Ag/T系列样品以及空白对比样品，按照上述MCM41-Ag/T对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的抑菌性测试的方法进行测试，结果如表3-4。

表3实施例3中Naβ-Ag、Naβ-Ag/T和鲎素肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的抑菌率

表4实施例4中Naβ-Ag、Naβ-Ag/T和鲎素肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的抑菌率

由表1和表2数据能够看出，鲎素肽-载银复合抗菌剂的抗菌效果显著高于载银抗菌剂、鲎素肽和二者的混合物，鲎素肽-载银复合抗菌剂的抗菌性有着显著的提高。

以上对本发明的几个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。