本发明属于小麦育种技术领域，涉及一种小麦二位点表达的 HMW-GS数目变异全套近等基因系的创制方法。
背景技术：
小麦种子贮藏蛋白包括：高分子量谷蛋白(High molecular weight glutenin subunits，HMW-GS)、低分子量谷蛋白和醇溶蛋白三种。小麦HMW-GS仅占成熟种子蛋白的10％左右，在面粉加水形成面团的揉混过程中，其通过分子间或分子内二硫键结合形成谷蛋白聚合体，这种网络状的“骨架”结构在小麦面筋形成过程中具有重要作用 (Shewry and Halford 2002；Shewry et al.2003；Yang et al.2014；Wieser and Kieffer.2001)。因此，小麦HMW-GS的数量和质量是影响小麦加工品质的重要因素。
普通小麦的HMW-GS基因位于第1同源群染色体长臂上，编码这类蛋白的基因位点统称为Glu-1,其对应于A、B和D基因组的基因位点分别为Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1，每1位点内有2个紧密连锁的基因，分别编码分子量较大的x和较小的y亚基且为共显性遗传 (Shewry et al.1992，2003；Rasheed et al.2014)。普通小麦的3个 HMW-GS基因位点在理论上可表达6个亚基，但因部分基因沉默而仅表达3-5个亚基(Shewry et al.1992，2003)。这3-5个亚基可由Glu-A1, Glu-B1和Glu-D1 3个位点上每个表达1-2个HMW-GS，也称3位点表达型；也可由其中2个位点表达(通常为Glu-B1和Glu-D1表达1-2 个,而Glu-A1表达0个)，也称2位点表达型。
近等基因系(near-isogenic line，NIL)是指除目标性状基因不同，而其他遗传背景完全相同的一组遗传材料(品系)，是研究单个基因(对) 遗传效应的理想研究材料。构建小麦近等基因系的方法主要有：多代回交转育法、基于目标性状位点杂合个体自交法(Tuinstra et al.1997) 以及从突变体中分离等(李希锋和董娜2012)。小麦加工品质受多个品质基因编码的多种蛋白共同影响，小麦HMW-GS近等基因系是研究HMW-GS组成和数目变化导致加工品质发生变异的理想研究材料。目前，绝大多数小麦HMW-GS近等基因系都是通过杂交并多代回交转育方式创制。如，采用这种方法分别构建了遗传背景Sicco的1Dx null,1Dy null和1By null(Rogers et al.1991)、龙辐麦19Glu-A1的1和 2*(刘伟等,2005)、龙辐麦3号Glu-A1的null和1、龙97-586Glu-B1的7 和7+8(张莉丽等,2007,2009)、龙麦20Glu-B1的7+8和7+8*分别与 17+18(高丹丹等.2008；张延滨等.2008)、小偃54Glu-B1的14+18和 14+15(庞斌双等，2007)以及HD2329为背景的涉及Glu-A1的1和null, Glu-B1的7+8,7+8*,17+18和20以及Glu-D1的5+10和2.2等(Goel et al. 2015,2017)以及西农1718背景的Ax1与null,西农2208背景的Dx2亚基缺失与不缺失(Gao et al.2018)等多个HMW-GS近等基因系。应用 HMW-GS全缺失突变体，利用回交并结合分子标记技术，构建了Glu-1 位点近等渗入系(张星星等,2016)。也有从突变体中选育小麦 HMW-GS近等基因系的报道。如，在小麦冀92-3235的无性系变异材料中发现了Glu-D1 2+12亚基缺失体，从而选育了Glu-D1 2+12和null 亚基的近等基因系(温之雨等,2003)。
综上所述，现有创制小麦HMW-GS近等基因系的方法主要采用杂交后并多次回交转育，其在创制HMW-GS组成不同，数目变化不大(一般为1个或1对亚基的差异)的4个以下近等基因系具有优势，但这种方法由于需要多代回交，也存在纯合稳定时间相对偏长，不能快速获得目标近等基因系。
为了快速获得HMW-GS组成有差异，同时数目上梯度变化(最多可在3个Glu-1位点的5或4个HMW-GS有差异，即0-4/5个变化) 的全套近等基因系(最少4个，可多达8个)，本发明应用3个Glu-1 位点表达0个HMW-GS的普通小麦作母本，而在B和D 2个基因组的Glu-1位点上表达3-4个而在A基因组的Glu-1位点不表达 HMW-GS的普通小麦为父本，通过1次杂交，并在后代通过生化标记连续选择2位点HMW-GS基因杂合型单株连续多代自交和选择, 获得了在HMW-GS基因组成和表达数目上都有很大差异的全套(4 个)小麦HMW-GS近等基因系。
技术实现要素：
针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种小麦二位点表达的 HMW-GS数目变异全套近等基因系的创制方法，仅通过一次杂交，结合应用生化标记鉴定后代HMW-GS组成选择后代自交，鉴定获得一套表达不同数目(0-3/4)HMW-GS小麦近等基因系。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种小麦二位点表达的HMW-GS数目变异全套近等基因系的创制方法，包括以下操作：
1)以A、B和D 3个基因组Glu-1位点所有HMW-GS均不表达的小麦为母本，以B和D基因组两个Glu-1位点表达、表达3-4个而 A基因组Glu-1表达0个HMW-GS的小麦为父本，进行杂交，得到 F1种子；
2)将F1种子分单粒种植于大田，开花前套袋自交，然后分别收获单株F2种子，选取其中两株种子数100粒以上的F2种子用于 SDS-PAGE鉴定HMW-GS组成，在所选株的每个单株中选择 HMW-GS组成与原父本蛋白表现型相同的所有含胚大半粒种子继续种植，其余舍掉；
3)将选中的F2种子分单粒种植成F3株系，开花前套袋自交，单株收获F3种子；
4)每个F3单株中随机选取10粒种子，分单粒利用半粒法 SDS-PAGE鉴定HMW-GS组成；选择单株内B和D 2个基因组的 Glu-1位点HMW-GS都在分离的单株为目标单株，目标单株内所有种子分单粒鉴定HMW-GS组成，选择与原父本具有相同HMW-GS 蛋白组成的所有单粒种子继续种植；
5)重复步骤4)的自交步骤从F4到F5,从F5的目标单株中鉴定所有种子的组成，并按HMW-GS表现型进行归类种植，在F6代鉴定出HMW-GS基因型纯合稳定的全套近等基因系。
F3单株中的目标单株的选择及种植为：
每个F3单株中随机选取10粒种子，分单粒利用半粒法 SDS-PAGE鉴定HMW-GS组成；若F3单株在B和D两个基因组Glu-1 位点上均出现HMW-GS有、无分离则作为目标单株保留，直至任意鉴定到2个目标单株；若在B和D两个基因组任意1个Glu-1位点上HMW-GS组成在10粒种子间表现一致，为非目标单株将其淘汰；对于中选的目标单株，从中鉴定出与原父本HMW-GS蛋白表现型相同的全部种子，分单粒种植成F4株系，开花前套袋自交，分单株收获F4种子。
F4、F5单株中的目标单株的选择及种植为：
每个F4单株中随机选取10粒种子，分单粒利用半粒法 SDS-PAGE鉴定HMW-GS组成；若F4单株在B和D两个基因组Glu-1 位点上均出现有、无分离则作为目标单株保留，直至任意鉴定到2个目标单株；若在B和D两个基因组任意1个Glu-1位点上10粒种子 HMW-GS组成表现一致，为非目标单株将其淘汰；对于中选的目标单株，从中鉴定出与原父本HMW-GS相同的全部种子，分单粒种植成F5株系，开花前套袋自交，分单株收获F5种子；
每个F5单株中随机选取10粒种子，分单粒利用半粒法 SDS-PAGE鉴定HMW-GS组成；若F5单株在B和D两个基因组的 Glu-1位点上均出现有、无分离则为目标单株保留，直至任意鉴定到 2个目标单株；若在B和D两个基因组任意1个Glu-1位点上10粒种子HMW-GS组成表现一致，为非目标单株将其淘汰；对于中选的目标单株，鉴定所有种子的HMW-GS组成，根据HMW-GS组成进行归类；将具有相同HMW-GS组成的种子，分单粒种植成F6株系，开花前套袋自交，分单株收获F6种子。
F6单株中的近等基因系为：
F6单株中将每类HMW-GS组成单株均分单粒检测10粒，只有当单株内10粒种子HMW-GS组成相同时，则认为其在Glu-1位点基因组成已纯合并再检测20粒确认，直至从所有类型中均鉴定到目标单株，这些单株互相为HMW-GS组成不同的近等基因系。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明通过连续选择Glu-1的2位点杂合基因型的个体(通过下一代HMW-GS表型分离情况推断其上一代的基因型是否为2位点杂合)进行连续自交，从自交3代后代中选择HMW-GS组成稳定而不发生分离的全套近等基因系，避免了连续回交导致HMW-GS纯合稳定时间过长的问题；更为明显的是，通过该方法可以获得HMW-GS近等基因系数目从0-3/4个梯度变化的全套(4个)近等基因系，实现了 HMW-GS组成不同、数目梯度变异的全套近等基因系。
附图说明
图1为本发明的创制流程示意图；
图2是以G0为母本，2位点HMW-GS表达型小麦品种作父本杂交F2代(及后代全杂合基因型)的HMW-GS分离情况。其中，G0表示3个Glu-1位点(Glu-A1,Glu-B1和Glu-D1)的所有HMW-GS均不表达(0个)的普通小麦，基因型NN,NN,NN,蛋白表型N,N,N。父本：在B和D 2个基因组Glu-1均表达HMW-GS蛋白,而在A基因组 Glu-1不表达HMW-GS蛋白，基因型NN,BB,DD,蛋白表型N,B,D；基因B,D相对N均为显性，即基因型NN,BN,DN分别与NN,BB,DD 的蛋白表型一致，均为N,B和D。下划线示2位点杂合基因型，阴影示基因型组成为纯合的4种近等基因系类型。
图3是以2位点表达型小麦品种蜀麦126(N,7+9,2+12)为父本创制的表达0-4个HMW-GS的近等基因系的SDS-PAGE电泳图。母本 G0:表达0个HMW-GS(N,N,N)；父本蜀麦126:表达4个HMW-GS (N,7+9,2+12)；A-D:表达0-4个HMW-GS的4种近等基因系。其表达的HMW-GS,A:(N,N,N)；B:(N,7+9,N)；C(N,N,2+12)；D:(N, 7+9,2+12)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在创制表达HMW-GS组成有差异，数目变化幅度大的一整套近等基因系过程中存在的问题和不足，本发明提供了一种仅通过一次杂交，结合应用生化标记鉴定后代HMW-GS组成，依据父本所具有的 HMW-GS由2个Glu-1位点编码的情况，在后代选择2个Glu-1位点均为杂合基因型的单株连续自交，在自交4代的基因型杂合目标单株中，鉴定获得一套表达不同数目(0-3/4)HMW-GS小麦近等基因系的方法。
以3个基因组Glu-1表达HMW-GS为0个的普通小麦为母本,表达4个(如，蜀麦126，其Glu-A1,Glu-B1和Glu-D1HMW-GS组成为Axnull,Bx7+By9,Dx2+Dy12,即N,7+9,2+12)的普通小麦为父本通过一次杂交，后代通过连续自交鉴定筛选，最终获得HMW-GS组成不同，数目梯度变化的一整套(4个)近等基因系。
首先，通过常规杂交产生F1种子。F1自交产生F2种子并利用半粒法SDS-PAGE分单粒鉴定HMW-GS组成，即1粒种子1分为2，仅含胚乳的小半粒种子用于鉴定HMW-GS组成，含胚的大半粒种子用于种植繁种。在F2选择HMW-GS组成与父本相同的单粒种子继续种植，自交产生F3种子。F3分单株收获后，每个单株分单粒鉴定10 粒种子的HMW-GS组成，选择单株内B和D 2个基因组的Glu-1位点HMW-GS都在分离(即上一代上述两个Glu-1位点都为杂合，这一代都出现有、无带的分离)的单株为目标单株，据此推测其上一代的 HMW-GS基因在B和D 2个基因组的Glu-1位点都为杂合基因型类型。目标单株内所有种子分单粒鉴定HMW-GS组成，选择与原父本具有相同HMW-GS组成的所有单粒种子继续种植。重复以上自交步骤到F5,从F5的目标单株中鉴定所有种子的组成，并按HMW-GS表现型(即HMW-GS类型，非基因型，一整套含有4种HMW-GS表现型)进行归类种植，在F6代鉴定出HMW-GS基因型纯合稳定的全套近等基因系。
进一步的，一种小麦二位点表达的HMW-GS数目变异全套近等基因系的创制方法，包括以下操作：
1)以A、B和D 3个基因组Glu-1位点所有HMW-GS均不表达的小麦为母本，以Glu-B1和Glu-D1两个Glu-1位点表达、表达3-4 个HMW-GS而Glu-A1不表达HMW-GS的小麦为父本，进行杂交，得到F1种子；
2)将F1种子分单粒种植于大田，开花前套袋自交，然后分别收获单株F2种子，选取其中两株种子数100粒以上的F2种子用于 SDS-PAGE鉴定HMW-GS组成，在所选株的每个单株中选择 HMW-GS组成与原父本HMW-GS蛋白表现型相同的的所有含胚大半粒种子继续种植，其余舍掉；
3)将选中的F2种子分单粒种植成F3株系，开花前套袋自交，单株收获F3种子；
4)每个F3单株中随机选取10粒种子，分单粒利用半粒法 SDS-PAGE鉴定HMW-GS组成；若F3单株在B和D两个基因组Glu-1 位点上均出现HMW-GS有、无分离则作为目标单株保留，直至任意鉴定到2个目标单株；若在B和D两个基因组任意1个Glu-1位点上HMW-GS组成在10粒种子间表现一致，为非目标单株将其淘汰；对于中选的目标单株，从中鉴定出与原父本HMW-GS蛋白表现型相同的全部种子，分单粒种植成F4株系，开花前套袋自交，分单株收获F4种子；
5)每个F4单株中随机选取10粒种子，分单粒利用半粒法 SDS-PAGE鉴定HMW-GS组成；若F4单株在B和D两个基因组Glu-1 位点上均出现有、无分离则作为目标单株保留，直至任意鉴定到2个目标单株；若在B和D两个基因组任意1个Glu-1位点上10粒种子 HMW-GS组成表现一致，为非目标单株将其淘汰；对于中选的目标单株，从中鉴定出与原父本HMW-GS相同的全部种子，分单粒种植成F5株系，开花前套袋自交，分单株收获F5种子；
6)每个F5单株中随机选取10粒种子，分单粒利用半粒法 SDS-PAGE鉴定HMW-GS组成；若F5单株在B和D两个基因组的 Glu-1位点上均均出现有、无分离则为目标单株保留，直至任意鉴定到2个目标单株；若在B和D两个基因组任意1个Glu-1位点上10 粒种子HMW-GS组成表现一致，为非目标单株将其淘汰；对于中选的目标单株，鉴定所有种子的HMW-GS组成，根据HMW-GS组成进行归类；将具有相同HMW-GS组成的种子，分单粒种植成F6株系，开花前套袋自交，分单株收获F6种子；
7)F6单株中将每类HMW-GS组成单株均分单粒检测10粒，只有当单株内10粒种子HMW-GS组成相同时，则认为其在Glu-1位点基因组成已纯合并再检测20粒确认，直至从所有类型中均鉴定到目标单株，这些单株互相为HMW-GS组成不同的近等基因系。
所述半粒法鉴定HMW-GS组成采用SDS-PAGE电泳法，具体实施方案如下：
(1)用刀片在种子远离胚端刮少量胚乳并研磨成细粉，按照每4 mg样品加入100μl蛋白提取液的比例加入提取液[含62.5mM Tris-HCl(pH6.8),10％(v/v)甘油，2％(w/v)SDS，0.002％(w/v)溴酚蓝，3.0％(v/v)β-巯基乙醇]，于室温下振荡1.5h，沸水中变性3-5min， 8000rpm 4℃离心5min。
分离胶缓冲液(1L):溶解151.2g Tris，10g SDS，38g硼酸，加水定容至1L，pH值为8.9。
浓缩胶缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)，10％(W/V)SDS。
电泳缓冲液：将分离胶缓冲液稀释10倍
聚丙烯酰胺凝胶组成如下:
(2)取上清液2.5μL点样，恒流20mA电泳，待溴酚蓝走出分离胶 30min后，电泳结束，取下胶用染色液(500ml染色液组成：325ml蒸馏水、0.5g考马斯亮蓝R-250、125ml异丙醇、50ml冰醋酸)染色1-2 h，清水漂洗脱色至凝胶背景清晰后，照相保存结果，结果如图3所示。
下面结合图1-图3及具体实施例对本发明作进一步描述。
一种小麦二位点表达的HMW-GS数目变异全套近等基因系的创制方法，包括以下操作：
1)以3个Glu-1位点表达0个HMW-GS的普通小麦为母本，2 个Glu-1位点表达4个(如，蜀麦126，其Glu-A1,Glu-B1和Glu-D1 HMW-GS组成为Axnull,Bx7+By9,Dx2+Dy12,即N,7+9,2+12)的普通小麦为父本，常规杂交产生杂交F1种子。
2)种植杂交F1种子，开花前套袋自交，结实、收获F2种子。 F2种利用半粒法(不含胚的小半粒)分单粒鉴定HMW-GS组成，选择 HMW-GS组成与原父本蜀麦126一致的单粒种子种植(含胚的大半粒),开花前套袋自交，分单株收获F3种子。
3)每个单株选择10粒F3种子鉴定HMW-GS组成，如某1个单株内10粒种子在B和D 2个Glu-1位点的HMW-GS都出现有带和无带的分离，则推测其上一代(F2)HMW-GS的基因组成在2个位点都为杂合型，则为目标单株,(选择2位点杂合基因型有2个重要原因, 一是通过连续选择Glu-1位点杂合基因型从而使其在除Glu-1位点外的其它位点形成连续自交,二是保证在最后一步的近等基因系选择过程中能具有全部4种类型,否则类型将不完整。
目标单株内所有种子分单粒SDS-PAGE鉴定HMW-GS组成，选择与原父本蜀麦126HMW-GS组成相同的所有种子,如蜀麦126的 HMW-GS组成为N,7+9,2+12，则选择HMW-GS蛋白表现型全部为 N,7+9,2+12的种子，表现型为其它类型的均不选(如图2所示)，分单粒种植，开花前套袋自交，分单株收获F4种子。
4)每个单株选择10粒F4种子鉴定HMW-GS组成，如某1个单株内10粒种子在B和D 2个Glu-1位点的HMW-GS都出现有带和无带的分离，则推测其上一代(F3)HMW-GS的基因组成在2个位点都为杂合型，则为目标单株。
目标单株内所有种子分单粒SDS-PAGE鉴定HMW-GS组成，选择与原父本蜀麦126HMW-GS组成相同的所有种子分单粒种植，开花前套袋自交，分单株收获F5种子。
5)每个单株选择10粒F5种子鉴定HMW-GS组成，如某1个单株内10粒种子在B和D 2个Glu-1位点的HMW-GS都出现有和无的分离，则推测其上一代(F4)HMW-GS的基因组成在2个位点都为杂合基因型，则为目标单株。目标单株内所有种子分单粒SDS-PAGE 鉴定HMW-GS组成，以蜀麦126为父本的为例,分成4类，其蛋白表型分别为A(N，N,N)、B(N,7+9,N)、C(N,N,2+12)、D(N,7+9, 2+12)。
6)上述种子分类分单粒种植，开花前套袋自交，分单株收获F6种子。
7)每个单株选择10粒F6种子鉴定HMW-GS组成，如果10粒种子HMW-GS组成一致，则该单株可能为HMW-GS稳定的目标单株并再鉴定10粒进行确认，直至选择到4种HMW-GS表现纯合稳定(即在基因组成上表现纯合)的类型，由此构成了一套HMW-GS数目0-4个的近等基因系。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。