本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及利用碳纳米管进行植物组培快繁方法。
背景技术
碳纳米管(carbonnanotubes,cnts)是日本nec公司基础研究实验室的电镜专家iijima于1991年从电弧法生产的碳纤维中发现的一种新型的碳晶体。碳纳米管自被发现以来，因其特殊的纳米结构和独特的力学、电学、热学和化学性能，以及由此带来的在电学、光学、生物医学、储能、催化和传感等诸多领域的应用前景，引起了世界各国科学界和产业界的高度关注。有研究表明，碳纳米管能够刺透种皮，促进水分吸收，从而促进种子萌发和幼苗的生长、生根。
目前植物组培快繁的技术体系中，均以添加不同浓度的生长调节剂诱导外植体进行脱分化和再分化，从而获得无菌苗。存在的问题是所获得的无菌苗在失去高浓度植物生长调节剂的刺激后，生长缓慢甚至停顿，导致无菌苗移栽后存在一个漫长的缓苗期，部分无菌苗甚至会死亡。因此建立一种有效缩短植物组培苗生根后缓苗期的组培快繁方法，对于植物组培技术的进一步发展具有重要的意义。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种在利用植物生长调节剂获得丛生芽后，不再使用植物生长调节剂，而是利用碳纳米管对植物生长的促进作用进行植物组培快繁的方法。
该方法具体是：
步骤(1)、外植体灭菌、消毒；
步骤(2)、诱导丛生芽；
芽诱导培养基采用常用芽诱导培养基，但必须含有一定浓度植物生长调节剂以及0.5-5mg/l的碳纳米管；植物生长调节剂浓度的选择为本领域技术人员熟知技术。
步骤(3)、增殖不定芽；
芽增殖培养基采用常用芽增殖培养基，但必须含有一定浓度植物生长调节剂以及0.5-4.5mg/l的碳纳米管；植物生长调节剂浓度的选择为本领域技术人员熟知技术。
步骤(4)、壮芽培养；
壮芽培养基包括碳纳米管0.5～4mg/l、蔗糖35～45mg/l以及其他成分，但一定不能含有植物生长调节剂。碳纳米管、蔗糖以及其他成分的具体选择及浓度根据具体种属苗进行调节。
步骤(5)、壮苗生根共培养；
培养基里面包括碳纳米管0.5～3mg/l、蔗糖35～45mg/l以及其他成分，但一定不能含有植物生长调节剂。碳纳米管、蔗糖以及其他成分的具体选择及浓度根据具体种属苗进行调节。
步骤(6)、炼苗移栽。
所述的植物生长调节剂一般为6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)、萘乙酸(naa)。
所述的碳纳米管为多壁碳纳米管、单壁碳纳米管或其他经过简单修饰碳纳米管(如多壁羧化碳纳米管)等。
本发明具有的有益效果是：
1.本发明在壮芽及壮苗和生根阶段用碳纳米管代替植物生长调节剂有效的缩短了无菌苗移栽的缓苗期，提高了移栽的成活率，大大提高了组培快繁的繁殖效率；
2.由于碳纳米管对植物的生长、生根均有显著的促进作用。本发明以采用植物生长调节剂和碳纳米管协同作用，诱导丛生芽的萌发和增殖，可大大的提高组培快繁的繁殖系数；同时以碳纳米管代替植物生长调节剂可以使壮苗培养和生根培养同时进行，大大加快了植物组培快繁的进程，缩短了组培周期。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。
实施例1.石蒜属组培快繁体系的建立
具体步骤：1)将石蒜属地下鳞茎经过灭菌、诱导丛生芽、增殖不定芽、壮芽培养后获得新生鳞茎；2)将新生鳞茎接入到愈伤组织诱导培养基中进行暗培养获得直径1.5～2.5cm的愈伤组织；3)将愈伤组织切割为直径1～2cm的团块后接种到芽诱导培养基中进行愈伤组织的分化15～20d得到丛生芽；4)将丛生芽接种到壮芽生根培养基中进行壮芽生根培养后获得组培苗。
本发明将石蒜地下鳞茎经过灭菌、诱导丛生芽、增殖不定芽、壮芽培养后获得新生鳞茎。所述石蒜品种优选为中国石蒜；所述的石蒜地下鳞茎优选为3年生以上，更优选为3～5年生，直径1.5～4cm的地下鳞茎。本发明在对地下鳞茎灭菌前，优选的对地下鳞茎进行预处理得到块状鳞茎；所述的预处理包括获得鳞茎盘、对鳞茎盘进行清洗、切块和洗涤。
本发明优选去除地下鳞茎的外层鳞叶，切除地下鳞茎全部的根和1/2～2/3的鳞叶，保留鳞茎盘；所述清洗优选的使用毛刷、清水洗去鳞茎盘表面泥土；所述切块获得的块状鳞茎盘大小优选为1.0～1.5cm3；所述洗涤优选为震荡洗涤，所述洗涤所用的洗涤液优选为84消毒液；所述洗涤的时间优选为15～50min，更优选为25～40min。所述洗涤后，本发明优选采用流动清水冲洗所述洗涤后的鳞茎盘25～35min。
本发明在得到鳞茎盘后，对所述鳞茎盘进行灭菌。所述灭菌操作优选的在超净工作台内进行；所述灭菌优选的包括酒精漂洗、hgcl2灭菌和无菌水冲洗。在本发明中，所述酒精漂洗所用酒精的为体积分数优选为70～80％，更优选为75％；所述酒精漂洗的时间优选为25～35s，更优选为30s。在本发明中，所述hgcl2灭菌用hgcl2溶液的质量分数优选为0.05～0.15％的hgcl2溶液；所述hgcl2溶液灭菌的时间优选为35～45min，更优选为40min。在本发明中，所述无菌水冲洗的次数优选为4～6次，更优选为5次。本发明在无菌水冲洗完成后，优选的采用无菌纸吸干鳞茎盘表面的水分。
所述灭菌后，本发明在将所述灭菌后的鳞茎进行诱导丛生芽。本发明中优选将已灭菌的块状鳞茎以基盘向下的方式直接接种到芽诱导培养基进行培养；所述芽诱导培养基优选为包括25～35g/l的蔗糖，5～10g/l的琼脂，1.0-3.0mg/l多壁碳纳米管，5.5-10.0mg/l的6-苄氨基腺嘌呤和1～2.0mg/l萘乙酸的ms培养基；更优选为包括30g/l的蔗糖，7.5g/l的琼脂，6.0mg/l的6-苄氨基腺嘌呤和1.5mg/l萘乙酸，3.0mg/l多壁碳纳米管的ms培养基。
本发明中所述诱导丛生芽的过程优选的包括原代培养和继代培养，具体为：将所述灭菌后的鳞茎在芽诱导培养基上依次进行原代培养和继代培养。在本发明中，所述原代培养的时间优选为35～45d，更优选为40d；所述继代培养的时间优选为35～45d，更优选为40d；所述诱导丛生芽的培养温度优选为24～26℃，更优选为25℃；所述诱导丛生芽的光照强度优选为100～300μmol·m-2·s-1，更优选为200μmol·m-2·s-1；光照的时间优选为10～14h/d，更优选为12h/d。
本发明在诱导丛生芽后，将得到的鳞茎丛生芽进行增殖不定芽，具体为将所述诱导丛生芽得到的移植到芽增殖培养基中，进行不定芽增殖。在本发明中，所述芽增殖培养基优选为包括25～35g/l的蔗糖，5～10g/l的琼脂，1.0-2.5mg/l多壁碳纳米管，2.5～3.5mg/l的6-苄氨基腺嘌呤和0.5～1.5mg/l萘乙酸的ms培养基，更优选为包括30g/l的蔗糖，7.5g/l的琼脂，3.0mg/l的6-苄氨基腺嘌呤和1.0mg/l萘乙酸，2.5mg/l多壁碳纳米管的ms培养基。
在本发明中，所述增殖不定芽的培养温度优选为24～26℃，更优选为25℃；所述增殖不定芽的光照强度优选为100～300μmol·m-2·s-1，更优选为200μmol·m-2·s-1；所述光照的时间优选为14～18h/d，更优选为16h/d；所述增殖不定芽培养的时间优选为35～45d，更优选为40d。
本发明在完成不定芽增殖后，将得到的鳞茎不定芽进行壮芽培养，获得新生鳞茎。在本发明中，所述的壮芽培养优选的包括1～2次继代培养，每次继代培养的时间优选为25～35d；更优选为30d。本发明中，所述壮芽培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃；所述壮芽培养的光照强度优选为100～300μmol·m-2·s-1，更优选为200μmol·m-2·s-1；所述壮芽培养的光照时间优选为14～18h/d，更优选为16h/d。
在本发明中，所述壮芽培养具体为：将增殖不定芽得到的鳞茎不定芽移栽到壮芽培养基上进行壮芽培养。在本发明中，所述壮芽培养用培养基优选为包括35～45g/l的蔗糖，5～10g/l的琼脂，1.0-2.5mg/l多壁碳纳米管的ms培养基；更优选为包括40g/l的蔗糖，7.5g/l的琼脂，2.5mg/l的多壁碳纳米管的ms培养基。在本发明所述壮芽培养完成后，得到直径2～3mm的新生小鳞茎。
本发明在完成壮芽培养后，将得到的新生小鳞茎进行壮苗和生根共培养，获得新生鳞茎。在本发明中，所述的壮芽和生根共培养优选的包括1～2次继代培养，每次继代培养的时间优选为25～35d；更优选为30d。本发明中，所述壮芽培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃；所述壮芽培养的光照强度优选为100～300μmol·m-2·s-1，更优选为200μmol·m-2·s-1；所述壮芽培养的光照时间优选为14～18h/d，更优选为16h/d。
在本发明中，所述壮苗和生根共培养具体为：将新生小鳞茎及带带到壮芽生根共培养的培养基上。在本发明中，所述壮芽和生根共培养用培养基优选为包括35～45g/l的蔗糖，5～10g/l的琼脂，0.5-2.0mg/l多壁碳纳米管的ms培养基；更优选为包括40g/l的蔗糖，7.5g/l的琼脂，2.0mg/l的多壁碳纳米管的ms培养基。在本发明所述壮芽培养完成后，得到直径3～5mm，不定根3～5条的新生鳞茎。
本发明在获得具根的新生鳞茎后，将获得的小鳞茎进行炼苗和移栽。炼苗在室内进行。将组培瓶开盖，置于自然散射光下，放置2-3d。炼苗完成后，用镊子将试管苗取出，洗去根部的培养基，移栽到10×10的穴盘中。栽培基质为泥炭土：珍珠岩：田园土＝1:1:1，栽培基质须经800-1000倍多菌灵消毒处理。之后进行正常的水肥管理。
实施例2.大花蕙兰组培快繁体系的建立
具体步骤：1)外植体的消毒；2)丛生芽诱导；3)丛生芽的增殖；4)壮芽培养；5)壮苗和生根培养；6)炼苗和移栽。
所述步骤1)以大花蕙兰原球茎为外植体，先用洗涤剂洗净原球茎表面，再用流水冲洗1h。在超净工作台上用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗后经5％naclo溶液消毒15min，期间不停摇动，无菌水冲洗3～4遍，无菌滤纸吸干原球茎表面水分。
所述步骤2)将消毒后的原球茎接种到丛生芽诱导培养基中，诱导获得丛生芽；所用基本培养基为1/2ms，均添加蔗糖30g·l-1和琼脂粉7-8g·l-1，0.5-2.5mg/l单壁碳纳米管，培养基在灭菌前加入0.15-0.25mg·l-1naa和1.0-2.0mg·l-16-ba，培养条件：光照时间12h，光强2000～2500lx，培养温度25±1℃；
所述步骤3)将原球茎诱导获得的丛生芽继代至丛生芽增殖培养基中，所用基本培养基为1/2ms；培养基中均添加蔗糖30g·l-1和琼脂粉7g·l-1；培养基在灭菌前加入0.05-0.1mg·l-1naa和0.5-1.5mg·l-16-ba，0.5-2.0mg/l单壁碳纳米管，光照时间16h，光强2000～2500lx，培养温度25±1℃，进行丛生芽的增殖；
诱导得到的丛生芽移植到芽增殖培养基中，进行不定芽增殖。在本发明中，所述芽增殖培养基优选为包括25～35g/l的蔗糖，7～8g/l的琼脂，0.5-1.5mg/l的6-苄氨基腺嘌呤和0.1-0.3mg/l萘乙酸，0.5-2.0mg/l单壁碳纳米管的1/2ms培养基，更优选为包括30g/l的蔗糖，7.5g/l的琼脂，1.0mg/l的6-苄氨基腺嘌呤和0.2mg/l萘乙酸,1.0mg/l单壁碳纳米管的1/2ms培养基。
本发明在完成不定芽增殖后，进行壮芽培养，获得新生原球茎。在本发明中，所述的壮芽培养优选的包括1～2次继代培养，每次继代培养的时间优选为25～35d；更优选为30d。本发明中，所述壮芽培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃；所述壮芽培养的光照强度优选为100～300μmol·m-2·s-1，更优选为200μmol·m-2·s-1；所述壮芽培养的光照时间优选为14～18h/d，更优选为16h/d。
在本发明中，所述壮芽培养具体为：将不定芽增殖得到的不定芽接种到壮芽培养基上进行壮芽培养。在本发明中，所述壮芽培养用培养基优选为包括35～45g/l的蔗糖，5～10g/l的琼脂，0.5-2.5mg/l单壁碳纳米管的1/2ms培养基；更优选为包括40g/l的蔗糖，7.5g/l的琼脂，1.5mg/l的单壁碳纳米管的1/2ms培养基。在本发明所述壮芽培养完成后，得到直径2～3mm的原球茎。
本发明在完成壮苗培养后，将得到的新生原球茎进行壮苗和生根共培养，获得大花蕙兰无菌苗球茎。在本发明中，所述的壮苗和生根共培养优选的包括1～2次继代培养，每次继代培养的时间优选为25～35d；更优选为30d。本发明中，所述壮芽培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃；所述壮芽培养的光照强度优选为100～300μmol·m-2·s-1，更优选为200μmol·m-2·s-1；所述壮芽培养的光照时间优选为14～18h/d，更优选为16h/d。
在本发明中，所述壮苗和生根共培养具体为：将新生原球茎继代到壮苗生根共培养的培养基上。在本发明中，所述壮芽和生根共培养用培养基优选为包括35～45g/l的蔗糖，7-8g/l的琼脂，0.5-3.0mg/l单壁碳纳米管的ms培养基；更优选为包括40g/l的蔗糖，7.5g/l的琼脂，1.5mg/l的单壁碳纳米管的1/2ms培养基。在本发明所述壮芽培养完成后，得到直径3～5mm，不定根3～5条的新生原球茎。
本发明在获得具根的新生原球茎后，将获得的原球茎进行炼苗和移栽。炼苗在室内进行。将组培瓶开盖，置于自然散射光下，放置2-3d。炼苗完成后，用镊子将试管苗取出，洗去根部的培养基，移栽到10×10的穴盘中。栽培基质为苔藓:椰糠:珍珠岩＝1︰9︰12，栽培基质须经800-1000倍多菌灵消毒处理。之后进行正常的水肥管理。
下面针对石蒜和大花蕙兰分别进行三种不同的培养方案，并比较其实验结果，具体见表1。
表1
注：配方中统一添加7.5mg/l琼脂。mwcnts：多壁碳纳米管；swcnts：单壁碳纳米管。
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。