一种干细胞冻存液及其制作方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种干细胞冻存液及其制作方法。
背景技术：
：干细胞治疗是指自体或异体来源的干细胞经过体外扩增或定向诱导分化，制备成为治疗所需要的特定细胞，通过细胞移植修复机体损伤的治疗方法。目前国内外已开展了多项干细胞临床应用研究，涉及多种干细胞类型及多种疾病类型。其中研究最广泛的成体干细胞类型是间充质干细胞，主要来源于骨髓、脂肪组织以及母胎来源，它们具有一定的多向分化潜能及抗炎和免疫调控等能力。与骨髓和脂肪等来源的间充质干细胞相比，来源于母胎的间充质干细胞具有明显的优势。脐带和胎盘是胎儿生产的附属物，胎儿出生后即成为医疗废弃物，采集对供者不再造成任何痛苦。与其他成体来源的细胞相比，母胎来源的细胞个体差异较小，质量容易控制，而且细胞的干性和功能活性更好，对许多疾病的治疗效果也更明显。作为一种新型的生物治疗产品，由于生产制备过程的每一阶段都会影响干细胞制剂的质量，因此需对临床使用的干细胞制剂的质量进行相关的研究和控制，而细胞的冷冻保存阶段就是非常重要的质量控制阶段之一。目前大多数的冻存保护液专利，如专利申请号200910167171.2所述的干细胞冻存液及干细胞的冻存方法和专利申请号201110227449.8所述的用于脂肪干细胞的无血清冻存液及脂肪干细胞库的建立，其含有血清或dmso(二甲基亚砜)，可导致细胞复苏后的培养基中被引入血清，而dmso对细胞有微毒性。此外，根据现行版《中国药典》的规定，生产临床用干细胞制剂的培养基不应使用任何血清，这是因为：1.血清成分复杂，质量不易控制，造成不同厂商、不同批次间的产品差异较大，不利于细胞生产的标准化；2.使用血清容易引入外源微生物污染，如牛源病毒、人源病毒等；3.血清中的外源性蛋白质或其它分子残留有可能会引起患者的过敏反应，甚至会造成休克，为干细胞制剂的临床使用带来隐患。因而，现在需要一种干细胞冻存液，使整个培养体系没有被外源性动物成分污染的风险，且合乎《中国药典》及细胞治疗相关法律法规的规定。技术实现要素：本发明的目的是提供一种干细胞冻存液，其稳定可靠，可长时间有效地保护细胞的分化潜能，保证了细胞生物活性。本发明的目的是提供一种干细胞冻存液的制作方法，其操作简单易行，具有较好的实用价值。本发明的目的是通过这样的技术方案实现的，一种干细胞冻存液，其特征在于，包括如下体积百分比的物质：低糖型dmem35～55％，ultroserg血清替代物15～35％，甘油5～20％，重组人血白蛋白5～10％，右旋糖苷4010-20％；还包括bfgf4～10mg/l，无结晶水型海藻糖250～700mmol/l。本发明中，低糖型dmem(dulbecco'smodifiedeaglemedium，dmem)是一种广泛使用的基础培养基，可用于支持很多种类的哺乳动物细胞生长。低糖型是指葡萄糖浓度较一般的dmem培养基低，为1g/l，优选美国赛默飞世尔科技公司生产的产品，也可以选用品牌为雷布斯、型号为sh30021.01b的产品。ultroserg血清替代物是一种哺乳动物细胞培养基添加物，用于替代血清。这是一种混合物，由于成分的一致性和稳定性，使得培养细胞批次差异小，质量稳定。优选美国颇尔公司生产的产品，其型号为15950-017。bfgf即重组人碱性成纤维细胞生长因子(又称为碱性fgf、fgf2、fgf-β或者肝素结合生长因子)，是一种适用于细胞培养应用的生物活性蛋白质，优选美国赛默飞世尔科技公司生产的产品。海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用。因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征，优选日本林原产商生产的产品。甘油即丙三醇，用于替代dmso，可避免细胞内的水分子在极低温下形成结晶，保护细胞结构不被破坏，优选日本东京化成工业株式会社生产的甘油。重组人血白蛋白可维持细胞渗透压，保护细胞结构不被破坏。优选中国华北制药股份有限公司生产的产品。右旋糖苷40也叫葡聚糖、右聚糖，它是葡萄糖的聚合物，是一种类似淀粉和糊精的粘性物质，作用是维持细胞渗透压，优选山东鲁抗辰欣药业有限公司生产的产品。本发明中，低糖型dmem作为基础培养基，ultroserg血清替代物用来保证培养细胞批次差异小，质量稳定，bfgf提供细胞培养所需的生物活性蛋白质，重组人血白蛋白与右旋糖苷40共同协同，起到维持细胞渗透压，保护细胞结构不被破坏，四种物质提供了细胞生长所需物质，且保证了细胞的质量稳定。甘油避免细胞内的水分子在极低温下形成结晶，保护细胞结构不被破坏；无结晶水型海藻糖使得在低温环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征，与甘油相互协同在低温下仍可保护细胞，保证了在低温下细胞的复苏细胞存活率和生物活性。此外，不含有血清或dmso，降低了外源性微生物感染和过敏风险。本发明中的另一目的是通过这样的技术方案实现的，一种干细胞冻存液的制作方法，将低糖型dmem、ultroserg、甘油、重组人血白蛋白和右旋糖苷40按照相应的比例均匀混合，临用前添加相应比例的bfgf即可获得干细胞冻存液。本发明中的制作方法中，bfgf的使用前的临时添加，保证其活性且可提供细胞培养所需的生物活性蛋白质，整个干细胞冻存液的制作过程也简单易行，具有较强的实用性。由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：干细胞冻存液稳定可靠，可长时间有效地保护细胞的分化潜能，保证了细胞生物活性，且降低了外源性微生物感染和过敏风险；其制作方法操作简单易行，具有较好的实用价值。附图说明图1为本发明中一种干细胞冻存复苏示意图；图2为本发明中一种干细胞对数生长期示意图；图3为本发明中一种干细胞间充质干细胞阳性标志流式检测示意图；图4为本发明中一种间充质干细胞阴性标志流式检测示意图；图5为本发明中成脂分化中油红o染色结果示意图；图6为本发明中成骨分化中茜素红染色结果示意图。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1一种干细胞冻存液，包括如下体积百分比的物质：低糖型dmem35～55％，ultroserg血清替代物15～35％，甘油5～20％，重组人血白蛋白5～10％，右旋糖苷4010-20％；还包括bfgf4～10mg/l，无结晶水型海藻糖250～700mmol/l。实施例2一种干细胞冻存液，包括如下体积百分比的物质：低糖型dmem35％，ultroserg血清替代物15％，甘油20％，重组人血白蛋白10％，右旋糖苷4020％；还包括bfgf4mg/l，无结晶水型海藻糖700mmol/l。实施例3一种干细胞冻存液，包括如下体积百分比的物质：低糖型dmem55％，ultroserg血清替代物25％，甘油5％，重组人血白蛋白5％，右旋糖苷4010％；还包括bfgf10mg/l，无结晶水型海藻糖250mmol/l。实施例4一种干细胞冻存液，包括如下体积百分比的物质：低糖型dmem40％，ultroserg血清替代物35％，甘油10％，重组人血白蛋白8％，右旋糖苷4012％；还包括bfgf7mg/l，无结晶水型海藻糖500mmol/l。实施例5一种干细胞冻存液的制作方法，将低糖型dmem、ultroserg、甘油、重组人血白蛋白和右旋糖苷40按照相应的比例均匀混合，临用前添加相应比例的bfgf即可获得干细胞冻存液。实验检测：鉴别标准：国际细胞治疗协会(theinternationalsocietyforcelltherapy，isct)推荐的人源性间充质干细胞鉴别标准：1.细胞应贴壁生长。2.流式细胞术检测细胞表型为阴性标志：cd14、cd34、cd45、cd79a和hla-dr应≤2％；阳性标志：cd73、cd90、cd105应≥95％。3.在体外可以诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞。针对本发明中的实验检测，本次设置四个实验组进行检测，且所用的细胞均为同一批次培养的细胞，实验组中冻存细胞均是使用了上述实施例1至4中的比例物质以实施例5的制作方法制作的干细胞冻存液后进行的冻存，实验组如下：实验组一：冻存前细胞实验组二：冻存3个月的细胞实验组三：冻存6个月的细胞实验组四：冻存12个月的细胞实验一冻存前、后细胞增殖能力对比1.取脐带间充质干细胞若干，连续传三代后，取对数生长期的细胞用于试验；冻存的细胞复苏后再连续传三代，取对数生长期的细胞用于试验，每个实验组分别做5组平行实验。2.按每1ml含104的细胞浓度接种细胞，每天计数活细胞，连续观察一周，并绘制生长曲线。3.细胞倍增时间的测定按生长曲线计算细胞的倍增时间，取细胞峰值前一天的细胞计数(y)、接种细胞数(x)及生长时间(t)计算。倍增时间＝t/a，a＝log2y/x。实验结果如下表：实验组一：冻存前细胞冻存前yxt(h)log2y/xt/a(h)12.07*1041*1041441.0496137.222.03*1041*1041441.0215141.032.13*1041*1041441.0909132.042.09*1041*1041441.0635135.452.02*1041*1041441.0144142.0计算倍增时间标准差s＝3.667(h)。实验组二：冻存3个月的细胞冻存3个月yxt(h)log2y/xt/a(h)11.40*1040.77*1041920.8600223.321.44*1040.72*1041921.0000192.031.46*1040.79*1041920.8860216.741.49*1040.75*1041920.9904193.951.51*1040.72*1041921.0683179.7计算倍增时间标准差s＝16.302(h)实验组三：冻存6个月的细胞冻存6个月yxt(h)log2y/xt/a(h)11.35*1040.63*1041941.0996176.421.40*1040.66*1041941.0847178.931.32*1040.68*1041940.9569202.741.37*1040.61*1041941.1674166.251.41*1040.69*1041941.0307188.2计算倍增时间标准差s＝12.300(h)实验组四：冻存12个月的细胞冻存12个月yxt(h)log2y/xt/a(h)11.07*1040.55*1042160.9598225.021.05*1040.59*1042160.8319259.631.11*1040.58*1042160.9366230.641.02*1040.56*1042160.8647249.851.04*1040.60*1042160.7933272.3计算倍增时间标准差s＝17.656(h)由上述实验一结果可以看出，冻存前细胞的增殖能力明显优于冻存复苏后的细胞，冻存时间越长则倍增时间越长。实验二冻存前、后的细胞活率及表面标志检测1.取脐带间充质干细胞若干，连续传三代后，取对数生长期的细胞用于试验；冻存的细胞复苏后再连续传三代，取对数生长期的细胞用于试验。2.按104/ml的细胞浓度接种细胞，每个实验组分别做5组平行实验。3.当细胞浓度达到108/ml时，收集细胞。离心后加入0.5ml鞘液重悬。准备5支1.5ml的试管，每支加入100μl样本细胞悬液，然后给每一支试管依次编号①②③④。4.抗体孵育⑴向①试管加入抗cd14和cd73抗体；⑵向②试管加入抗cd34和cd90抗体；⑶向③试管加入抗cd45和cd105抗体；⑷向④试管加入抗cd79a和hla-dr抗体；⑸所有试管用漩涡混匀仪vortex-genie2混匀后4℃避光孵育15分钟。5.离心每支试管中加入1ml鞘液，用漩涡混匀仪vortex-genie2混匀后用thermoscientificsorvallst16r离心机以300g加速度4℃离心5分钟。6.鉴别细胞活率用移液器移除上清液，每支离心管中加入150～300μl鞘液后混匀重悬，加入7-氨基-放射菌素d溶液，使其终浓度为2.5μm/ml，常温下避光孵育3～5分钟，再次进行重悬操作，得到重悬液；7.检测用微量移液器小心移除上清液，每支试管中加入200μl鞘液用漩涡混匀仪vortex-genie2混匀重悬，用beckman临床型流式细胞仪dxflex上机检测。8.检测数据分析用流式数据分析软件打开数据文件，区分出死细胞群和活细胞群，并统计活细胞百分比，在活细胞群中统计各标志物百分比。其中阴性标志cd14、cd34、cd45、cd79a和hla-dr应≤2％，阳性标志cd73、cd90、cd105应≥95％。实验结果如下表：①冻存前②冻存3个月③冻存6个月④冻存12个月由上述实验二结果结合图3和图4表明，流式细胞术检测间充质干细胞的5个阴性标志：cd14、cd34、cd45、cd79a和hla-dr的表达率均<1％；3个阳性标志：cd73、cd90、cd105的表达率均>98％。完全符合国际细胞治疗协会(theinternationalsocietyforcelltherapy，isct)推荐的标准即间充质干细胞表型为阴性标志：cd14、cd34、cd45、cd79a和hla-dr应≤2％；阳性标志：cd73、cd90、cd105应≥95％，所以本冻存保护液是稳定可靠的。实验三、冻存前、后的干细胞分化能力检测1.成骨诱导分化①取脐带间充质干细胞若干，连续传三代后，取对数生长期的细胞用于试验。冻存的细胞复苏后再连续传三代，取对数生长期的细胞用于试验。②配制成骨诱导培养基10mmol/lβ-甘油磷酸钠，10nmol/l地塞米松，50mg/l维生素c加入基础培养基。③将细胞以2*103/cm2密度接种于6孔培养板，每个实验组分别做5组平行实验。等细胞生长至80％融合度后，更换为成骨诱导培养基，每两天换液1次。④茜素红染色于诱导1、2、3周后，去培养基，pbs洗2次；70％乙醇固定，4℃环境下1小时；去离子水洗2次；40mmol/l茜素红溶液(ph4.2)室温染色1-10分钟；显微镜下观察并拍照。结合图5可知，成骨诱导分化中，间充质干细胞经成骨诱导后，茜素红染色阳性，说明冻存复苏后的细胞仍然具有成骨分化潜能。2.成脂诱导分化①取脐带间充质干细胞若干，连续传三代后，取对数生长期的细胞用于试验。冻存的细胞复苏后再连续传三代，取对数生长期的细胞用于试验。②配制成脂诱导培养基0.5mmol/l异丁基-甲基黄嘌呤，60μmol/l吲哚美辛，0.5μmol/l氢化可的松，10μg/l胰岛素加入培养基。③将细胞以2*103/cm2密度接种于6孔培养板，每个实验组分别做5组平行实验，诱导4周后检测。④染色检测去培养基，用pbs洗2次；甲醛-钙室温固定15分钟；pbs洗2次；60％异丙醇媒染1分钟；去异丙醇，油红o工作液室温染色30分钟；60％异丙醇浸洗1次；pbs洗2次；显微镜下观察并拍照。结合图6可知，成脂诱导分化间充质干细胞经成脂诱导后，油红o染色可见明显的脂肪滴形成，说明冻存复苏后的细胞仍然具有成脂分化潜能。综上可知，本冻存保护液对细胞的抗极低温保护是有效且稳定的，且时间较长。当前第1页12