本发明属于农业科学技术领域，具体涉及一种芹菜小孢子诱导培养基及小孢子诱导培养方法。
背景技术：
芹菜，别名芹、早芹、香芹、蒲芹、药芹菜、野芫荽，为伞形科芹属中一、二年生草本植物，原产于地中海沿岸地区，汉代传入我国。作为一种传统蔬菜，芹菜不仅营养丰富、爽脆适口，而且还能治病健身，被誉为佳蔬良药。近二三十年以来，随着人们生活质量的提高，芹菜消费量不断增加，种植面积也随之扩大，现已成为我国非常重要的蔬菜之一。目前，市场上的芹菜大致分为两种，一种为中国芹菜，即本芹，特点是特点是分蘖多，叶柄细瘦、多为空心，叶丛开张，香味浓，平均单株重0.5kg左右；另一种为西洋芹菜，即西芹，以美国引进品种居多，特点是分蘖少，叶柄肥厚实心，节处缢痕明显，叶丛较紧凑，香味较淡，平均单株重1kg左右，亩产量较高。据现代科学分析，每100克芹菜中约含有蛋白质0.8克、脂肪0.1克、糖类3.9克、膳食纤维1.4克、钠517毫克、钙160毫克、磷61毫克，还含有维生素c、维生素e、胡萝卜素等其他多种维生素。芹菜还有很好的药用价值。研究表明，芹菜中具有许多药理活性成分，主要包括芹菜素、挥发油化合物、不饱和脂肪酸、香豆素衍生物等，目前，研究最多、最深入的是芹菜素，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、降血压扩血管等作用。中医认为芹菜具有平肝清热、祛风利湿、除烦消肿、凉血止血、解毒宣肺、健胃利血、清肠利便、润肺止咳、降低血压、健脑镇静的功效。
芹菜在我国栽培历史悠久，产地分布十分广泛，全国所有省份都有芹菜种植。随着芹菜种植规模的进一步扩大，对芹菜高产、抗病或专用型优良品种的需求也越来越大，因此芹菜的育种工作将是一项研究重点。然而我国芹菜育种起步较晚，研究力量比较薄弱，尽管已经选育出一些优良品种并在生产中得到推广，但总的育种水平还不高，缺乏竞争力。我国芹菜的育种方式一直以来都以常规杂交育种为主，周期长、见效慢，不能切实满足生产上对芹菜良种的迫切需求。单倍体育种是一种能够提高育种选择效率、缩短育种进程的育种方法，目前国内外广泛采用通过获取单倍体植株，加倍后成为纯合的二倍体材料，来用于作物育种，基因突变及转基因的研究。花药培养和小孢子培养都是获得单倍体植株的主要途径，经培养得到的花粉株系间性状变异幅度大，超亲现象和出现特殊优良性状的频率要显著高于常规育种，株系内性状整齐，世代间稳定性强，通过花药或小孢子培养选育出的自交系具有高度的纯和性，以此配制的杂交组合往往具有更强的杂种优势。
小孢子培养是一种从单细胞水平上快速创制单倍体和纯合二倍体（dh）的现代生物技术手段。与花药培养相比而言，小孢子培养具有很大的优势，由于小孢子体积小而数量大，因此可以采用类似微生物培养的方法进行培养而省工、省时；由于去除了小孢子和花粉壁绒毛层细胞之间可能存在的营养竞争现象，使得能在更大的基因型范围内，以更高的频率诱导小孢子的胚胎发生、以更低的成本获得遗传上完全纯合的双单倍体植株。小孢子培养技术已经在多种作物上得到了应用，其中取得较好进展的有小麦、水稻、大白菜、油菜、番茄、辣椒等。然而目前国内有关芹菜小孢子培养的文献报道很少，芹菜小孢子培养体系尚未建立，芹菜单倍体育种工作也尚未开展。
小孢子培养的影响因素很多，首先是基因型的差异。不同物种之间、同一物种不同种属之间小孢子培养的诱导频率差异显著。还有供体植株的生长环境、花粉发育时期、培养条件（如光照强度、时间、黑暗、温度等）之间的互作以及基因型与培养条件之间的关系等，尤其是诱导培养基的成分对小孢子培养的诱导频率也有显著影响。我们对芹菜小孢子培养进行了深入研究，摸索出了一种芹菜小孢子诱导培养基及芹菜小孢子诱导出愈伤组织的方法，为今后的芹菜单倍体育种奠定了物质基础。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种芹菜小孢子诱导培养基及小孢子诱导培养方法，为芹菜小孢子培养体系的建立乃至芹菜单倍体育种工作的开展提供技术支持。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种芹菜小孢子诱导培养基及小孢子诱导培养方法，其特征在于，所述小孢子诱导培养基的配方如下（按1l计）：kno3350-380mg，（nh4）2so460-70mg，kh2po4120-130mg，mgso4·7h2o126-134mg，cacl2·2h2o427-435mg，mnso4·4h2o17-20mg，znso4·7h2o8-12mg，h3bo36.1-6.5mg，ki0.8-0.9mg，cuso4·5h2o0.02-0.03mg，cocl2·6h2o0.02-0.03mg，na2moo4·2h2o0.22-0.28mg，feso4·7h2o27-29mg，na2-edta35-37mg，肌醇73-79mg，l-半胱氨酸28-33mg，天冬氨酸10-14mg，丙氨酸6-9mg，腐植酸钠3.3-4.1mg，维生素b10.3-0.6mg，维生素b60.4-0.7mg，生育酚0.2-0.3mg，黑木耳多糖4.2-4.6mg，呋苯硫脲0.5-0.7mg，2，4-d0.2-0.4mg，二苯基脲磺酸钙1.4-1.6mg，5-溴去氧尿核苷2.1-2.7mg，亚硒酸钠0.06-0.09mg，甘露醇30-34g，蔗糖32-36g，聚乙烯醇0.7-1.1g，硅藻土0.35-0.45g，ph调节为6.0-6.4；
所述小孢子诱导培养方法包括以下步骤：
（1）花蕾选取和预处理：在芹菜正常现蕾开花季节，于晴天上午7:00-9:00采集健康植株上的花蕾，用染色法进行小孢子发育时期鉴定，选取小孢子处于单核靠边期的花蕾，低温预处理3d；
（2）小孢子悬浮液的制备：将上述花蕾进行表面消毒，然后取40-50个花蕾于1支离心管中，加入5ml提取液，并放入1颗钢珠，置于细胞破碎仪中以3500r/min的转速破碎10s，再经400目筛网将滤液过滤至另1支离心管中，1000r/min离心3min，弃去上清液，再加入提取液离心，如此重复2次后，向离心管中加入适量小孢子诱导培养基来调整小孢子密度，混合均匀后制成小孢子悬浮液；
（3）小孢子诱导培养：在无菌条件下，用移液器吸取小孢子悬浮液到无菌培养皿中，parafilm封口膜封口后先置于32℃热激处理2d，再置于23-25℃、黑暗的环境下培养，培养40-50d可形成愈伤组织；在培养期间每隔15d进行1次特定电磁波辐照处理。
所述小孢子诱导培养基的优选配方如下（按1l计）：kno3365mg，（nh4）2so465mg，kh2po4125mg，mgso4·7h2o130mg，cacl2·2h2o431mg，mnso4·4h2o18.5mg，znso4·7h2o10mg，h3bo36.3mg，ki0.85mg，cuso4·5h2o0.025mg，cocl2·6h2o0.025mg，na2moo4·2h2o0.26mg，feso4·7h2o28mg，na2-edta36mg，肌醇76mg，l-半胱氨酸31mg，天冬氨酸12mg，丙氨酸7.5mg，腐植酸钠3.7mg，维生素b10.5mg，维生素b60.6mg，生育酚0.25mg，黑木耳多糖4.4mg，呋苯硫脲0.6mg，2,4-d0.3mg，二苯基脲磺酸钙1.5mg，5-溴去氧尿核苷2.4mg，亚硒酸钠0.075mg，甘露醇32g，蔗糖34g，聚乙烯醇0.9g，硅藻土0.34g，ph调节为6.2。
所述步骤（1）中染色法是指醋酸洋红染色法，具体操作为：将花蕾中的花药挑取1-3枚碾碎，释放出花粉，用醋酸洋红染色后镜检观察。
所述步骤（1）中低温预处理的具体操作为：将选取的花蕾用湿润的纱布包裹，然后放置于4℃冰箱中。
所述步骤（2）中表面消毒的具体操作为：将花蕾用自来水冲洗30min左右，然后置于无菌工作台中，先在75%乙醇中浸泡5min，用蒸馏水冲洗干净，再在添加了2-3滴吐温-20的0.5%邻苯二甲醛中浸泡8min，用蒸馏水冲洗干净，无菌滤纸吸干表面水分。
所述步骤（2）中提取液的配方为（按1l计）：kno32200-2400mg，mgso4·7h2o240-260mg，nh4no3107-115mg，nah2po4133-139mg，cacl2·2h2o175-185mg，mnso4·4h2o10-12mg，znso4·7h2o2.4-2.8mg，h3bo33.2-3.6mg，ki0.9-1.1mg，cocl2·6h2o0.024-0.026mg，na2moo4·2h2o0.23-0.25mg，柠檬酸铁29.6-30.6mg，肌醇95-105mg，赖氨酸3-5mg，丝氨酸3-5mg，维生素b11.0-1.2mg，维生素b62.3-2.5mg，生物素2.8-3.2mg，低聚果糖3.5-4.5g，蔗糖27-33g/l，玉米浆20-25ml，ph调节为5.6-6.0。
所述步骤（2）中小孢子密度为1.0×105-2.0×105个/ml。
所述步骤（3）中特定电磁波辐照处理的具体操作为：将培养皿放在距离特定电磁波辐射器50cm的地方，辐照处理6min；辐射器的辐射功率为250w，波谱范围为2-50微米。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明的芹菜小孢子诱导培养基是在常规培养基的基础上加以改进，调整了常规营养元素的配比，调整了碳源浓度，调节了渗透压，添加更多有机成分和促进因子，使用不同高效植物生长调节剂进行复配，达到促进小孢子生长发育，提高愈伤组织诱导率的效果。
2、本发明初步建立了芹菜小孢子诱导培养方法，通过严格限定花蕾取材时期、花蕾低温预处理、热激处理以及特定电磁波辐照处理综合提高了小孢子愈伤组织诱导率，使诱导率达到9.39%-17.44%，为进一步获得芹菜单倍体或双单倍体植株提供了大量试验材料，也为芹菜小孢子完整培养体系的建立奠定了物质基础。
具体实施方式
下面结合实施案例对本发明的有益效果作进一步说明，而非限制本发明。
实施例1
按照本发明的技术方案进行芹菜小孢子诱导培养试验，具体步骤如下：
（1）花蕾选取和预处理：以芹菜品种文图拉和津奇1号作为供试材料，在芹菜正常现蕾开花季节，于晴天上午7:00-9:00采集健康植株上的花蕾，用醋酸洋红染色法进行小孢子发育时期鉴定，具体操作为：将花蕾中的花药挑取1-3枚碾碎，释放出花粉，用醋酸洋红染色后镜检观察，选取小孢子处于单核靠边期的花蕾，用湿润的纱布包裹，然后放置于4℃冰箱中低温预处理3d。
（2）小孢子悬浮液的制备：将上述花蕾用自来水冲洗30min左右，然后置于无菌工作台中，先在75%乙醇中浸泡5min，用蒸馏水冲洗干净，再在添加了2-3滴吐温-20的0.5%邻苯二甲醛中浸泡8min，用蒸馏水冲洗干净，无菌滤纸吸干表面水分。然后取40-50个花蕾于1支离心管中，加入5ml提取液（配方为（按1l计）：kno32300mg，mgso4·7h2o250mg，nh4no3111mg，nah2po4136mg，cacl2·2h2o180mg，mnso4·4h2o11mg，znso4·7h2o2.6mg，h3bo33.4mg，ki1.0mg，cocl2·6h2o0.025mg，na2moo4·2h2o0.24mg，柠檬酸铁30.1mg，肌醇100mg，赖氨酸4mg，丝氨酸4mg，维生素b11.1mg，维生素b62.4mg，生物素3.0mg，低聚果糖4.0g，蔗糖30g/l，玉米浆22.5ml，ph调节为5.8），并放入1颗钢珠，置于细胞破碎仪中以3500r/min的转速破碎10s，再经400目筛网将滤液过滤至另1支离心管中，1000r/min离心3min，弃去上清液，再加入提取液离心，如此重复2次后，向离心管中加入适量小孢子诱导培养基来调整小孢子密度孢子为1.0×105-2.0×105个/ml，混合均匀后制成小孢子悬浮液；
小孢子诱导培养基的配方如下（按1l计）：kno3365mg，（nh4）2so465mg，kh2po4125mg，mgso4·7h2o130mg，cacl2·2h2o431mg，mnso4·4h2o18.5mg，znso4·7h2o10mg，h3bo36.3mg，ki0.85mg，cuso4·5h2o0.025mg，cocl2·6h2o0.025mg，na2moo4·2h2o0.26mg，feso4·7h2o28mg，na2-edta36mg，肌醇76mg，l-半胱氨酸31mg，天冬氨酸12mg，丙氨酸7.5mg，腐植酸钠3.7mg，维生素b10.5mg，维生素b60.6mg，生育酚0.25mg，黑木耳多糖4.4mg，呋苯硫脲0.6mg，2,4-d0.3mg，二苯基脲磺酸钙1.5mg，5-溴去氧尿核苷2.4mg，亚硒酸钠0.075mg，甘露醇32g，蔗糖34g，聚乙烯醇0.9g，硅藻土0.34g，ph调节为6.0。
（3）小孢子诱导培养：在无菌条件下，用移液器吸取小孢子悬浮液到无菌培养皿中，parafilm封口膜封口后先置于32℃热激处理2d，再置于24℃、黑暗的环境下培养，培养40-50d可形成愈伤组织；在培养期间每隔15d进行1次特定电磁波辐照处理，具体操作为将培养皿放在距离特定电磁波辐射器50cm的地方，辐照处理6min；辐射器的辐射功率为250w，波谱范围为2-50微米；分别统计文图拉和津奇1号两个品种的愈伤组织诱导率。
实施例2
不同诱导培养基对小孢子愈伤组织诱导率的影响：采用植物组织培养常规培养基nln、ms、b5、w14、n6并分别附加2,4-d0.3mg/l作为诱导培养基，按照实施例1提供的小孢子诱导出愈伤组织的方法进行试验，统计文图拉和津奇1号两个品种的愈伤组织诱导率，结果见下表1。
由表1可以看出，使用本发明的诱导培养基，文图拉的愈伤组织诱导率达到9.39%，津奇1号的愈伤组织诱导率达到17.44%，均显著高于使用其他培养基的愈伤组织诱导率。而文图拉和津奇1号两个品种之间的诱导率差异，主要是由于基因型不同造成的。本发明的诱导培养基调节了各营养元素的配比，调整碳源浓度，使其更适合于芹菜小孢子的生长，还添加了黑木耳多糖、5-溴去氧尿核苷、亚硒酸钠、甘露醇、聚乙烯醇、硅藻土等促进因子，使用了呋苯硫脲、二苯基脲磺酸钙作为植物生长调节剂，都能够达到提高愈伤组织诱导率的目的。
实施例3
不同低温预处理天数对小孢子愈伤组织诱导率的影响：按照实施例1提供的小孢子诱导出愈伤组织的方法进行试验，其中步骤（1）中低温预处理天数设置为1d、2d、3d、4d，以不进行低温预处理作为对照，其它操作不变，统计文图拉和津奇1号两个品种的愈伤组织诱导率，结果见下表2。
由表2可以看出，在一定范围内，随着低温预处理天数的增加，文图拉和津奇1号两个品种的愈伤组织诱导率也逐步提高，到第3d时诱导率达到最高值，随后愈伤组织诱导率又逐步下降，说明适当的低温预处理有利于提高芹菜小孢子愈伤组织诱导率，而处理时间过长可能会降低小孢子活性，影响愈伤组织的形成。
实施例4
不同热激处理温度对小孢子愈伤组织诱导率的影响：按照实施例1提供的小孢子诱导出愈伤组织的方法进行试验，其中步骤（3）中热激处理温度设置为28℃、30℃、32℃、34℃、36℃，以不进行热激预处理作为对照，其它操作不变，统计文图拉和津奇1号两个品种的愈伤组织诱导率，结果见下表3。
由表3可以看出，在一定范围内，随着热激处理温度的提高，文图拉和津奇1号两个品种的愈伤组织诱导率也逐步提高，在32℃时诱导率达到最高值，随后愈伤组织诱导率又逐步下降，说明适宜温度的热激处理也有利于提高芹菜小孢子愈伤组织诱导率，而处理温度过高也会降低小孢子活性，影响愈伤组织的形成。
实施例5
特定电磁波处理对小孢子愈伤组织诱导率的影响：按照实施例1提供的小孢子诱导出愈伤组织的方法进行试验，取消步骤（3）中的特定电磁波处理，其它操作不变，统计文图拉和津奇1号两个品种的愈伤组织诱导率，结果见下表4。
由表4可以看出，与不处理相比，在进行特定电磁波处理后，文图拉和津奇1号两个品种的愈伤组织诱导率有了显著提高。已有研究表明特定电磁波辐射处理对动植物有许多良好的生物学效应。而本发明在芹菜小孢子愈伤组织诱导培养期间进行特定电磁波辐射处理，能够提高愈伤组织诱导率，可能原因是特定电磁波处理能够提高小孢子细胞中酶的活力，从而提高小孢子活性，促进小孢子细胞的分裂增殖和新陈代谢。
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