石墨烯抗菌复合膜的制备方法、制得的抗菌复合膜与流程

本发明涉及复合材料技术领域，具体涉及一种石墨烯抗菌复合膜的制备方法、制得的抗菌复合膜。

背景技术：

细菌纤维素是一种由细菌在不同条件下合成的具有生物降解性的纤维素的统称，作为一种环境友好、可再生的生物高分子材料，具有极大的商业价值和良好的发展前景。与天然的植物纤维素相比，细菌纤维素具有：(1)高持水性和高透气性；(2)良好的生物相容性和可降解性；(3)高化学纯度和可调控性；(4)高抗张强度和弹性模量以及合成时的可调控性等优点。这些优异性质使细菌纤维素在生物医药、造纸及化妆品等领域被广泛应用。

细菌纤维素虽然具有很多优异的性能，但其自身没有抗菌活性，因此其应用受到很大限制。目前，纳米复合材料因其粒径小，比表面积大而被广泛应用于生物医学，环境保护和能源器件等领域。研究表明纳米颗粒如银、氧化锌和铜及其氧化物等通过在水溶液中释放出具有杀菌效果的ag⁺、zn²⁺、cu²⁺而具有良好的抗菌能力，且不易产生耐药性。其中，银离子以抗菌活性高、毒性小等优点而成为理想的新型纳米抗菌材料，在食品包装，水质净化和医疗器械生产等领域具有广泛前景。但是，由于银纳米颗粒粒径小，容易发生聚集而严重的限制了其各方面的应用。因此选择一种合适的载体不仅可以解决纳米颗粒的溶解性和稳定性问题，而且能够最大程度的发挥二者的协同功能。

石墨烯作为一种新兴的二维碳材料，因其独特的结构而具有超高的比表面积和良好的力学、电学性质等优点而被广泛使用。氧化石墨烯作为石墨烯的一种衍生物，其二维片层上含有许多含氧基团，这使得氧化石墨烯能够均匀的分散在水溶液中。同时它还可以作为一种优秀的载体使纳米颗粒均匀的分散在其二维平面之上。目前，有关石墨烯复合材料的制备主要集中在先将go还原为石墨烯，后再与其它组分或前驱体通过物理或化学方法复合，通常涉及到危险的化学试剂，毒性大且会对环境造成一定的危害，如公开号为cn102125056a的专利公开一种银/石墨烯抗菌复合材料的制备方法，因此寻找一种绿色环保、高效安全的石墨烯-银复合材料的制备方法成为了当今研究热点。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于现有技术中的石墨烯抗菌复合材料的制备涉及到危险的化学试剂，毒性大且会对环境造成一定的危害。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

本发明提供一种石墨烯抗菌复合膜的制备方法，包括以下步骤：

(1)在氧化石墨烯水溶液中加入硝酸银粉末，超声，得到氧化石墨烯/硝酸银复合材料；

(2)将步骤(1)中制得的氧化石墨烯/硝酸银复合材料分散在细菌纤维素膜上，获得细菌纤维素/氧化石墨烯/硝酸银复合膜；

(3)在惰性保护气体中用等离子体处理细菌纤维素/氧化石墨烯/硝酸银复合膜后，用去离子水清洗，自然干燥后，即获得石墨烯抗菌复合膜。

有益效果：本发明采用等离子体还原耗时短，效果明显，绿色无污染，无需任何化学还原剂和对环境有害的还原剂，可在室温环境下操作，反应条件温和；制备的金属纳米粒子粒径小且分布均匀；低成本且样品无杂质残留，先将氧化石墨烯和硝酸银混合在一起，再用等离子体对其放电，将其还原成石墨烯和银复合材料后与细菌纤维素膜进行复合，使得石墨烯/银能够稳定的附着在其表面。

本发明使用等离子体技术将石墨烯和纳米银复合在细菌纤维素载体之上，充分发挥了等离子体制备材料的优点，使得纳米银颗粒均匀的分散在石墨烯片层之上的同时，二者又稳定的分布在细菌纤维素之中，并且与纤维融为一体。其中，细菌纤维素原有的优良性能并未损失，同时获得的复合材料薄膜可以用作抗菌膜。步骤(1)中超声使硝酸银更均匀的附着在氧化石墨烯片层上。

优选地，所述氧化石墨烯水溶液的制备方法包括以下步骤：将石墨加入浓硫酸中，冰浴条件下，加入高锰酸钾，搅拌后，于40℃反应1h，升温至85℃，加入水，反应30min，再加入h2o2，继续搅拌5min，停止反应后洗涤，将获得的固体产物分散在水中，超声2h。

有益效果：上述制备方法获得的氧化石墨烯水溶液成本低且水溶性好。

优选地，所述石墨的质量与浓硫酸的体积之比为1g:40ml。

优选地，所述石墨与高锰酸钾的质量比为1:3。

优选地，所述氧化石墨烯水溶液的制备方法具体包括以下步骤：将1g石墨加入到40ml浓硫酸中，冰浴条件下，加入3g高锰酸钾，搅拌1h；然后转移到40℃油浴锅中继续反应1h，温度升至85℃，加入80-85mlh2o，反应30分钟；最后加入h2o2，直至没有明显气泡产生，停止反应；得到的产物经洗涤后，干燥处理，得到固体产物；将固体产物在水中分散并超声2h，得到氧化石墨烯水溶液。

优选地，所述硝酸银粉末的加入量与氧化石墨烯的质量比为3:10。

优选地，所述细菌纤维素膜的制备方法包括以下步骤：

(1)木醋杆菌活化；

(2)将活化后的木醋杆菌以10％的接种量接种到木醋杆菌培养基培养，得到淡黄色的细菌纤维素；

(3)用蒸馏水冲洗细菌纤维素表面的杂质后，浸泡在80℃、0.1m氢氧化钠溶液中，保温处理1h后，用去离子水冲洗，即获得细菌纤维素膜。

优选地，所述木醋杆菌活化的方法包括以下步骤：将0.5ml无菌水注入木醋杆菌冻干管，轻轻吹打充分溶解成悬浮液，吸取菌悬液，200μl打入培养基表面，30℃下培养2d。

优选地，所述步骤(1)中超声处理频率为40kw，超声处理时间为2h。

本发明还提供一种由上述制备方法制得的石墨烯抗菌复合膜。

本发明的优点在于：本发明的方法反应简单，条件温和，制备快速；本发明使用等离子体技术将石墨烯和纳米银复合在细菌纤维素载体之上，充分发挥了等离子体制备材料的优点，使得纳米银颗粒均匀的分散在石墨烯片层之上的同时，二者又稳定的分布在细菌纤维素之中，并且与纤维融为一体。其中，细菌纤维素原有的优良性能并未损失，同时获得的复合材料薄膜可以用作抗菌膜。

本发明利用等离子体一步制备细菌纤维素/石墨烯/银复合材料薄膜，具有工艺简单，操作方便，条件温和，过程可控(改变参数如材料浓度、放电电压或电流的大小、通电时间等)，是一种环境友好的绿色制备新技术。

本发明制备的细菌纤维素/石墨烯/银复合材料薄膜，稳定性强，无需其它处理，即产即用。

本发明制备的细菌纤维素/石墨烯/银复合材料薄膜具有优异的抗菌性质，对革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌都具有良好的抗菌活性。

附图说明

图1为发明实施例1中氧化石墨烯的电镜图；

图2为本发明实施例中直流放电等离子体装置的结构示意图；

图3为本发明实施例1中等离子体处理得到的材料的宏观图片；

图4为本发明实施例1中等离子体处理得到的材料自然干燥成膜后的宏观图片；

图5为本发明实施例1中bc膜的sem图片；图中左边的比例尺为1μm，图中右边的比例尺为300nm；

图6为本发明实施例1中等离子体处理得到的材料的sem图片；图中左边的比例尺为1μm，图中右边的比例尺为200nm；

图7为本发明实施例1中等离子体处理得到的材料的抑菌圈实验结果对比图；图中左边为大肠杆菌，图中右边为金黄色葡萄球菌。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

以下实施例中菌株型号及购买来源为：北纳创联生物技术有限公司，bncc339798(木醋杆菌)，bncc335834(大肠杆菌)，bncc186335(金黄色葡萄球菌)。

等离子体放电装置的型号为：上海电阻厂生产的4mr-300，

实施例1

石墨烯抗菌复合膜的制备，包括以下步骤：

(1)氧化石墨烯水溶液的制备：在烧瓶中放入约40ml浓硫酸(98％)，将1g鳞片石墨在室温下先搅拌一小时使其充分混合均匀，然后将混合物置于冰浴中，缓慢加入3g高锰酸钾，反应1h。随后将反应体系转移到油浴中，45℃下反应1h。温度升至85℃，缓慢滴入85ml水，之后加入约30ml过氧化氢，继续搅拌至没有明显的气泡产生，反应结束。产物用5％盐酸进行洗涤并过滤，最终用透析袋进行透析纯化，然后于-50℃冷冻干燥12h，将固体产物在水中分散并在40kw条件下超声2h，得到最终浓度约为2mg/ml的氧化石墨烯水溶液。如图1所示，本实施例中获得的氧化石墨烯片层较大，为微米级。

(2)加入硝酸银固体粉末(3mg)于20ml氧化石墨烯水溶液(0.5mg/ml)中，于40kw条件下超声2h，制备成氧化石墨烯/硝酸银复合材料。

(3)活化：将0.5ml无菌水注入冻干管，轻轻吹打充分溶解成悬浮液。吸取菌悬液，200μl打入培养基表面，30℃下培养，两天后木醋杆菌固体培养基上会长出新的菌落。木醋杆菌固体培养基：酵母膏5.0g，葡萄糖50.0g，琼脂15.0g，碳酸钙12.5g，蒸馏水1.0l。ph＝6.6-7.0，121℃，30min灭菌。

在培养瓶内装入50ml培养基，以10w/v％的接种量将活化好的种子培养液接入其中，充分振荡使种子培养液中的菌体均匀分散在培养基中，30℃静置培养三天得到淡黄色的细菌纤维素。配置木醋杆菌液体培养基：将50g葡萄糖，5g蛋白胨，5g酵母膏，2g磷酸氢二钠，1g磷酸二氢钾和1g柠檬酸溶于1000ml去离子水中，将配制的培养基在立式灭菌锅中121℃灭菌30分钟。

从培养基中取出细菌纤维素膜，用蒸馏水冲洗掉表面的培养基和杂质后完全浸泡在80℃、0.1m氢氧化钠溶液中，保温处理1h以除去残存的菌体和培养基，最后取出细菌纤维素膜用去离子水反复冲洗至中性，得到呈乳白色半透明状bc(bacterialscellulose)膜。

(4)将氧化石墨烯/硝酸银复合材料分散在细菌纤维膜之上，用直流放电等离子体放电处理1分钟，等离子体放电装置如图2所示，具体为：分别使用不锈钢针和不锈钢板作为阳极和阴极。阴极放置在距膜表面3mm处，阳极极浸入溶液中，溶液的高度为5cm，两个电极都与直流电源相连。当电压超过阈值时，放电等离子体在气体中形成气溶液界面，然后通过降低电压保持稳定。在放电之前，将氩气引入反应器以除去空气。当放电稳定时，电流约为40ma，电压约为1300v(10％)。完成后用去离子水冲洗三次，除去可能存在的自由基和杂离子，自然干燥后，即可得到石墨烯抗菌复合膜。

对上述得到的薄膜材料进行表征，得到的薄膜图片如图3所示，自然干燥成膜后如图4所示，单独的bc薄膜和石墨烯抗菌复合膜的微观结构分别如图5和图6所示。与单独的bc薄膜中，纤维之间纵横交错形成的大孔径相比，石墨烯及纳米银的加入一方面可以有效的抵挡细菌的进入，另一方面通过吸附作用可以有效的抵挡病菌的进入，有效的说明了其在抑菌抗菌领域的潜在应用。

抑菌实验测定：

将100ul菌液浓度约为3×10⁷的大肠杆菌菌液和金黄色葡萄球菌菌液涂于固体培养基之上，将实施案例3所得到的石墨烯抗菌复合膜制成4mm左右的抑菌膜，覆于lb固体培养基之上，于37℃恒温培养箱中过夜培养，测量抑菌圈直径，每个样品重复三次。

如图7所示，出现抑菌圈，且抑菌圈直径随菌液浓度的减小而增大。

实施例2

石墨烯抗菌复合膜的制备，包括以下步骤：

(1)氧化石墨烯水溶液的制备：在烧瓶中放入约80ml浓硫酸(98％)，将2g鳞片石墨在室温下先搅拌1h使其充分混合均匀，然后混合物置于冰浴中，缓慢加入6g高锰酸钾，反应1h。随后将反应体系转移到油浴中，45℃下反应1h。温度升至85℃，缓慢滴入85ml水，之后加入约40ml过氧化氢，继续搅拌至没有明显的气泡产生，反应结束。产物用5％盐酸进行洗涤并过滤，最终用透析袋进行透析纯化，然后于-50℃冷冻干燥12h，将固体产物在水中分散并在40kw条件下超声2h，得到最终浓度约为2mg/ml的氧化石墨烯水溶液。

(2)加入硝酸银固体粉末(6mg)于40ml氧化石墨烯水溶液(0.5mg/ml)中，于40kw条件下超声2h，制备成氧化石墨烯/硝酸银复合材料。

(3)活化：将0.5ml无菌水注入冻干管，轻轻吹打充分溶解成悬浮液。吸取菌悬液，200μl打入培养基表面，30℃下培养，两天后木醋杆菌固体培养基上会长出新的菌落。木醋杆菌固体培养基：酵母膏5.0g，葡萄糖50.0g，琼脂15.0g，碳酸钙12.5g，蒸馏水1.0l。ph＝6.6-7.0，121℃，30min灭菌。

在培养瓶内装入50ml培养基，以10w/v％的接种量将活化好的种子培养液接入其中，充分振荡使种子培养液中的菌体均匀分散在培养基中，30℃静置培养三天得到淡黄色的细菌纤维素。配置木醋杆菌液体培养基：将50g葡萄糖，5g蛋白胨，5g酵母膏，2g磷酸氢二钠，1g磷酸二氢钾和1g柠檬酸溶于1000ml去离子水中，将配制的培养基在立式灭菌锅中121℃灭菌30分钟。

从培养基中取出细菌纤维素膜，用蒸馏水冲洗掉表面的培养基和杂质后完全浸泡在80℃、0.1m氢氧化钠溶液中，保温处理1h以除去残存的菌体和培养基，最后取出细菌纤维素膜用去离子水反复冲洗至中性，得到呈乳白色半透明状bc膜。

(4)将氧化石墨烯/硝酸银复合材料分散在细菌纤维膜之上，用直流放电等离子体放电处理1分钟，等离子体放电装置如图2所示，具体为：分别使用不锈钢针和不锈钢板作为阳极和阴极。阴极放置在距膜表面4mm处，阳极极浸入溶液中，溶液的高度为6cm，两个电极都与直流电源相连。当电压超过阈值时，放电等离子体在气体中形成气溶液界面，然后通过降低电压保持稳定。在放电之前，将氦气引入反应器以除去空气。当放电稳定时，电流约为40ma，电压约为2000v(10％)。完成后用去离子水冲洗三次，除去可能存在的自由基和杂离子，自然干燥后，即可得到石墨烯抗菌复合膜。

实施例3

石墨烯抗菌复合膜的制备，包括以下步骤：

(1)氧化石墨烯水溶液的制备：在烧瓶中放入约60ml浓硫酸(98％)，将1.5g鳞片石墨在室温下先搅拌一小时使其充分混合均匀，然后将混合物置于冰浴中，缓慢加入4.5g高锰酸钾，反应1h。随后将反应体系转移到油浴中，45℃下反应1h。温度升至85℃，缓慢滴入85ml水，之后加入约35ml过氧化氢，继续搅拌至没有明显的气泡产生，反应结束。产物用5％盐酸进行洗涤并过滤，最终用透析袋进行透析纯化，然后于-50℃冷冻干燥12h，将固体产物在水中分散并在40kw条件下超声2h，得到最终浓度约为2mg/ml的氧化石墨烯水溶液。

(2)加入硝酸银固体粉末(9mg)于60ml氧化石墨烯水溶液(0.5mg/ml)中，于40kw条件下超声2h，制备成氧化石墨烯/硝酸银复合材料。

(3)活化：将0.5ml无菌水注入冻干管，轻轻吹打充分溶解成悬浮液。吸取菌悬液，200μl打入培养基表面，30℃下培养，两天后木醋杆菌固体培养基上会长出新的菌落。木醋杆菌固体培养基：酵母膏5.0g，葡萄糖50.0g，琼脂15.0g，碳酸钙12.5g，蒸馏水1.0l。ph＝6.6-7.0，121℃，30min灭菌。

在培养瓶内装入50ml培养基，以10w/v％的接种量将活化好的种子培养液接入其中，充分振荡使种子培养液中的菌体均匀分散在培养基中，30℃静置培养三天得到淡黄色的细菌纤维素。配置木醋杆菌液体培养基：将50g葡萄糖，5g蛋白胨，5g酵母膏，2g磷酸氢二钠，1g磷酸二氢钾和1g柠檬酸溶于1000ml去离子水中，将配制的培养基在立式灭菌锅中121℃灭菌30分钟。

从培养基中取出细菌纤维素膜，用蒸馏水冲洗掉表面的培养基和杂质后完全浸泡在80℃、0.1m氢氧化钠溶液中，保温处理1h以除去残存的菌体和培养基，最后取出细菌纤维素膜用去离子水反复冲洗至中性，得到呈乳白色半透明状bc(bacterialscellulose)膜。

(4)将氧化石墨烯/硝酸银复合材料分散在细菌纤维膜之上，用直流放电等离子体放电处理1分钟，等离子体放电装置如图2所示，具体为：分别使用不锈钢针和不锈钢板作为阳极和阴极。阴极放置在距膜表面3mm处，阳极极浸入溶液中，溶液的高度为5cm，两个电极都与直流电源相连。当电压超过阈值时，放电等离子体在气体中形成气溶液界面，然后通过降低电压保持稳定。在放电之前，将氩气引入反应器以除去空气。当放电稳定时，电流约为40ma，电压约为3000v(10％)。完成后用去离子水冲洗三次，除去可能存在的自由基和杂离子，自然干燥后，即可得到石墨烯抗菌复合膜。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。