一种转基因抗虫抗草甘膦棉花新品系的培育方法与流程

本发明属于作物新品种选育技术领域，具体涉及一种转基因抗虫抗草甘膦棉花新品系的培育方法。

背景技术：

棉花是我国的第一大经济作物，在国民经济中占有很重要的地位，棉纤维是一种重要的纺织原料，棉籽油和棉籽蛋白是重要的植物油料和蛋白质资源。随着我国经济的迅速发展和人民生活水平的提高，环保意识的提升，对纯棉纺织品的需求日益增加，生产上也要求有多抗的棉花品种，以减少化学农药防治所带来的环境污染。要达到减少劳动投入、提高产量、降低化学农药污染的目的，培育多抗如抗虫及抗草甘膦品种是最重要的途径之一。

棉花转基因技术在遗传改良方面已取得重大进展，成为生物技术在作物遗传改良中成功应用的范例，但是目前所能获得的转基因棉花，只能保证获得一种抗性，如抗虫或抗草甘膦，但是如何利用非转基因手段，将抗虫和抗草甘膦的基因都整合到植株中从而获得一种新的多抗棉花品种/品系，目前并没有相关详细研究。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种转基因抗虫抗草甘膦棉花新品系的培育方法，所述选育方法步骤合理、操作简单，可在较短的时间内将抗虫、抗草甘膦性状聚合在一起，所培育的新品系具有已有品种的优良性状，可迅速推广应用，加快品种的更新换代。新品系同时具有抗虫、抗草甘膦性状，可有效减少繁种和大面积生产的人工成本和用药成本，增加种子公司的利润，提高棉农的收益。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种转基因抗虫抗草甘膦棉花新品系的培育方法，包括以下步骤：(1)以转基因棉花抗虫品种为母本，以抗草甘膦品系为父本进行杂交，得转基因抗虫抗草甘膦杂交组合f1代；

(2)以所述杂交组合f1代为母本，以转基因抗虫品种为父本进行杂交，得回交一代bc1f1；

(3)以所述回交后代中的抗草甘膦植株为母本，以转基因抗虫品种为轮回父本，连续回交五代，得bc6f1；

(4)将所述bc6f1中的抗虫抗草甘膦植株自交，单株收种，得自交bc6f2；

(5)单株种植bc6f2，筛选所有植株都抗虫的株行中的抗草甘膦植株自交，单株收种，得bc6f3；

(6)单株种植bc6f3，筛选所有植株既抗虫又抗草甘膦的株行栓花自交，即获得转基因抗虫抗草甘膦棉花新品系。

优选的，步骤(1)所述转基因棉花抗虫品种包括gk19、中棉所41、鲁棉研28号或鲁6269。

优选的，步骤(1)所述抗草甘膦品系包括ggk-2。

优选的，步骤(1)～步骤(6)中对于抗虫性状的筛选，包括在棉苗5～7叶期，以质量百分浓度为0.8％的硫酸卡拉霉素溶液涂抹才展开的叶片，若叶片不变色则鉴定该植株具有抗虫性，若变色则不具有抗虫性。

优选的，步骤(1)～步骤(6)中对于抗草甘膦性状的筛选，包括在棉苗5～7叶期，用质量百分浓度为0.2％的草甘膦溶液喷施棉苗生长点，7～10天后，若棉苗生长点正常则该植株抗草甘膦，若棉苗生长点萎蔫或死亡的植株则不抗草甘膦。

本发明提供了一种转基因抗虫抗草甘膦棉花新品系的培育方法，利用转基因棉花抗虫品种与抗草甘膦品系杂交，再以杂交后代为母本，以转基因抗虫品种为父本进行回交，再以回交一代的抗草甘膦植株为母本，以转基因抗虫品种为轮回亲本连续回交五代，选择抗虫抗草甘膦植株自交两代后，筛选其中既抗虫又抗草甘膦的株行自交，即可得到转基因抗虫抗草甘膦棉花新品系。本发明所述培育方法操作简单，可在较短的时间内将抗虫、抗草甘膦性状聚合在一起，同时，所培育的新品系保持了已有品种的优良性状，可迅速推广应用，加快品种的更新换代。所培育的新品系同时具有抗虫、抗草甘膦性状，可有效减少繁种和大面积生产的人工成本和用药成本，增加种子公司的利润，提高棉农的收益。

附图说明

图1为本发明所述转基因抗虫抗草甘膦棉花新品系的培育流程图。

具体实施方式

本发明提供了一种转基因抗虫抗草甘膦棉花新品系的培育方法，流程如图1所示，包括以下步骤：(1)以转基因棉花抗虫品种为母本，以抗草甘膦品系为父本进行杂交，得转基因抗虫抗草甘膦杂交组合f1代；

(2)以所述杂交组合f1代为母本，以转基因抗虫品种为父本进行杂交，得回交一代bc1f1；

(3)以所述回交后代中的抗草甘膦植株为母本，以转基因抗虫品种为轮回父本，连续回交五代，得bc6f1；

(4)将所述bc6f1中的抗虫抗草甘膦植株自交，单株收种，得自交bc6f2；

(5)单株种植bc6f2，筛选所有植株都抗虫的株行中的抗草甘膦植株自交，单株收种，得bc6f3；

(6)单株种植bc6f3，筛选所有植株既抗虫又抗草甘膦的株行栓花自交，即获得转基因抗虫抗草甘膦棉花新品系。

本发明以转基因棉花抗虫品种为母本，以抗草甘膦品系为父本进行杂交，得转基因抗虫抗草甘膦杂交组合f1代。本发明所述转基因棉花抗虫品种优选包括gk19、中棉所41、鲁棉研28号或鲁6269。本发明所述抗草甘膦品系优选包括ggk-2(公开于赵龙飞等.陆地棉转gr79与gat基因对草甘膦抗性的鉴定及其遗传规律分析，《江苏农业学报》，2019年03期第531-536页)。本发明在进行所述杂交前优选还包括对亲本的抗虫性状和抗草甘膦性状进行筛选，对于抗虫性状的筛选，优选包括在棉苗5～7叶期，以质量百分浓度为0.8％的硫酸卡拉霉素溶液涂抹才展开的叶片，若叶片不变色则鉴定该植株具有抗虫性，若变色则不具有抗虫性；对于抗草甘膦性状的筛选，优选包括在棉苗5～7叶期，用质量百分浓度为0.2％的草甘膦溶液喷施棉苗生长点，7～10天后，若棉苗生长点正常则该植株抗草甘膦，若棉苗生长点萎蔫或死亡的植株则不抗草甘膦。本发明所述杂交可将抗虫基因和抗草甘膦基因聚合在同一个植株上。

得杂交组合f1代后，本发明以所述杂交组合f1代为母本，以转基因抗虫品种为父本进行杂交，得回交一代bc1f1。本发明所述转基因抗虫品种优选与上述相同，在此不再赘述。本发明所述杂交可将轮回亲本的遗传成分递增一半到杂交后代bc1f1中。本发明对抗虫性状的筛选优选与上述相同，在此不再赘述。

得回交一代bc1f1后，本发明以所述回交后代中的抗草甘膦植株为母本，以转基因抗虫品种为轮回父本，连续回交五代，得bc6f1。本发明对于母本的筛选并没有特殊限定，优选的抗草甘膦性状按照上述方法进行筛选即可。本发明所述回交六代可将轮回亲本的几乎所有遗传成分都传递给bc6f1中，使得bc6f1的主要性状已接近轮回亲本。

得bc6f1后，本发明将所述bc6f1中的抗虫抗草甘膦植株自交，单株收种，得自交bc6f2。本发明所述抗虫抗草甘膦植株的筛选方法优选与上述相同，在此不再赘述。本发明所述自交优选包括拴花自交。本发明所述自交可将抗虫基因纯合。

得自交bc6f2后，本发明筛选所有植株都抗虫的株行中的抗虫抗草甘膦的植株自交，单株收种，得bc6f3。本发明对所述抗虫抗草甘膦植株的筛选方法优选与上述相同，在此不再赘述。本发明所述自交优选包括拴花自交，并单株收种。本发明所述自交可将抗草甘膦基因纯合。

得bc6f3后，本发明筛选所述bc6f3中所有植株既抗虫又抗草甘膦的株行自交，即获得转基因抗虫抗草甘膦棉花新品系。本发明进行所述自交时，优选的单株种植形成株行，所有植株既抗虫又抗草甘膦的株行栓花自交繁殖，即获得转基因抗虫抗草甘膦棉花新品系。本发明对所述抗虫抗草甘膦植株的筛选方法优选与上述相同，在此不再赘述。本发明所述自交可将纯合的抗虫基因和抗草甘膦基因聚合在同一个植株上、且原有受体(轮回亲本)主要性状保持不变。

根据孟德尔作物遗传规律，杂交可将不同个体之间的部分遗传背景聚集在同一个个体上，回交可将轮回亲本的遗传背景递增到杂种后代中，理论上每回交1次，杂种后代所含轮回亲本的遗传成分将递增一半。通过连续5～6次回交，其后代的主要性状已接近轮回亲本，即回交六代所形成的材料基本保持了已有优良性状。且在本发明所述培育方法中，筛选的目标基因在bc6f1是杂合态，通过自交可对杂合基因纯合，连续2～3代自交选择可得到纯合基因，其所表达的性状可稳定地遗传给下一代。

下面结合实施例对本发明提供的一种转基因抗虫抗草甘膦棉花新品系的培育方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

转基因抗虫抗草甘膦棉花新品系rk635的选育

(1)2015年夏季，在四川成都种植转基因棉花抗虫品种鲁棉研28号和抗草甘膦品系ggk-2。在鲁棉研28号生长到7片真叶完全展开时，以质量百分浓度为1.0％的硫酸卡拉霉素溶液涂抹才展开的叶片，9天后所有植株的叶片都不变色，鲁棉研28号抗虫100％，抗虫基因是纯合的；ggk-2生长到5片真叶完全展开时，对其生长点喷施质量百分含量为0.2％的草甘膦溶液，10天后所有棉苗生长均正常，生长点没有萎蔫或死亡，说明ggk-2抗草甘膦100％，抗草甘膦基因是纯合的。到开花期后，鲁棉研28号植株在开花前一天下午花朵去掉雄蕊，利用ggk-2的花朵给其授粉杂交，收获5个杂交铃的种子，得抗虫抗草甘膦杂交种f1(材料名称rk)。

(2)2015年冬季，在海南种植在杂交种rk和转基因抗虫品种鲁棉研28号，采用上述(1)同样的方法鉴定其抗虫和抗草甘膦性状，所有rk植株均抗虫抗草甘膦，鲁棉研28号抗虫100％。在开花期，杂交种rk去雄，利用鲁棉研28的花朵给其授粉杂交，收获5个杂交铃的种子，得回交一代材料(材料名称rkbc1f1)。

(3)2016夏季，在成都种植回交一代材料rkbc1f1和鲁棉研28号，采用上述(1)方法，在5片真叶时鉴定rkbc1f1对草甘膦的抗性，7片真叶时鉴定其抗虫性，所有植株均抗虫，淘汰拔除不抗草甘膦的植株17株(占总株数的56.7％)，保留抗草甘膦的植株13株(43.3％)。在开花期，利用鲁棉研28的花朵给保留的rkbc1f1植株的花朵授粉杂交，收获15个杂交铃的种子，得回交二代材料种子(材料名称rkbc2f1)。

采用相同方法，以鲁棉研28号为轮回父本，杂交回交材料中的抗草甘膦植株为母本，连续回交四代得回交六代材料rkbc6f1。

(4)2018年冬季，在海南种植rkbc6f1材料，采用上述(3)方法，淘汰拔除不抗虫、不抗草甘膦的植株，保留既抗虫又抗草甘膦的植株14株(46.6％)，栓花自交，单株收种，每株收自交铃8个，得自交rkbc6f2。

(5)2019年夏季，在成都单株种植rkbc6f2材料，形成14个rkbc6f2株行。采用上述(1)方法，在5片真叶时鉴定抗虫性，有不抗虫植株出现的株行(6个)全部淘汰，不作进一步的工作。留下的8个株行喷施草甘膦鉴定抗性，淘汰拔除萎蔫或死亡(不抗草甘膦)的植株，留下的植株抗虫基因是纯合的，且又抗草甘膦。这些保留的植株栓花自交，单株收种，每株收自交铃8个，采用常规方法测定每个单株的单铃籽棉铃重、衣分、纤维品质，选择综合性状较好的15个单株种子，得自交rkbc6f3。

(6)2019年冬季，在海南种植rkbc6f3材料，形成15个rkbc6f3株行。采用上述(1)方法，在5片真叶时鉴定对草甘膦的抗性，有不抗草甘膦植株出现的株行(5个)全部淘汰，不作进一步的工作。留下的10个株行继续鉴定其抗虫性，全部抗虫，即这10个株行既抗虫又抗草甘膦，全部保留。对这些保留的株行栓花自交，混收自交铃，采用常规方法测定每个株行的单铃籽棉铃重、衣分、纤维品质，选择综合性状较好的4株行栓花自交混收，即获得转基因抗虫抗草甘膦棉花新品系rk635。

表1抗虫抗草甘膦新品系rk635主性状(4个株系)

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。