专利名称：：抗根结线虫属线虫的新型食线虫剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及拟对付根结线虫尾线虫的一种新型食线虫剂，以及通过利用蘑菇菌ArthrobotrysConoidesDrechsler的新菌株来对付这些线虫繁殖的一种方法。目前工艺水平人们早就知道，食植物的线虫会对作物造成重大的损失＿每年以30亿法朗计。在全世界引起最重大损失的最普遍的种类属于根结线虫属。的确，该在农民中称做“瘿线虫”，其关系到受感染植物胚根系上瘿的形成。这些极端多食性线虫几乎可攻击任何作物，因而牵涉到产量的损失-约为50-70％。在许多地区，异皮线虫属H.carotae尤其会造成胡萝卜作物的危害，其螯针引起胡萝卜上侧生细根的非正常性繁生，使得胡萝卜不适合在市场上销售。另一种线虫双垫刃属D.myceliophagus会造成对蘑菇床苗中外生性伴菌的重大损害。为了对付这些危害，在农民们采用了多种方法，在细耕农业中有以下几种-使用熏剂(溴代甲烷、三氯硝基甲烷、二氯丙烯……)的耕作前预防性土壤除菌法。这些产品具有很广的效力范围，可使土壤灭菌并破坏生太平衡。不过，在轻土壤中，这些产品的残余物可以保持在地下水中，而在重土壤中，其效力由于低扩散性而降低。-或就地对某些培养物的一些治疗性处理，对于非食用性产物如花卉培养物或树木苗圃，使用的是由汁液所输送的内吸产物(氨基甲酸酯或寡磷酸成份)。这些产品对动物和人都是危险的，因为其可以进入植物并在其中留下一些毒性残余物。这两种技术只能影响到土壤的最初30厘米。然而，生活在更深土层的线虫在培养物渐趋成熟期间会再次感染所治愈的区域。这就意味着无休止的灭菌过程。另外，由于这些产品对人有毒，在许多国家，例如荷兰、瑞士、德国中很多杀线虫的化学药品是禁用的。本发明的概述因此，本发明的目的就是使用一种天然杀线虫剂，其对人及其环境均无害。因此，本发明涉及一种拟对付根结线虫属、异皮线虫属及双垫刃属D.myceliophasus线虫的新型食线虫剂，这几种线虫选自蘑菇菌ArthrobotrysconosidesDreschler的6个菌株。本发明的另一个方面是对付根结线虫属、异皮线虫属及双垫刃属D.myceliophequs的一种方法、包括通过用蘑菇菌接种物事先接种的谷粒将ArthrobotrysconoidesDreschler掺混到耕作土壤中。附图简述本发明的目的及特点结合附图如下所述，以说明本发明的某些方面。图1以图解形式表示出依据本发明的菌株Arthrobotrysconoides的分生孢子梗和分生孢子。图2图示了由依据本发明的菌株ArthrobotrysConoides所形成的捕捉线虫的陷阱。图3为一表格，显示出用于区分不同的Arthrobotrysconoides的电泳凝胶结果。本发明详述本发明的主题ArthrobotrysconoidesDreschler的6个菌株来自不同地域。检验不同菌株是否属于同一种类的主要标准是对分生孢子(这些蘑菇菌的毓器官)的测度。如图1所示，在分生孢子醒上分生孢子以20或30个为一簇相聚。分生孢子梗在第一个分生孢子头之后可进一步发育，在一定生长长度之后形成第二簇分生孢子，直到生成5-6个额外的分生孢子簇。菌株42A来自布告纳法索的FadaN′Gourma，由含分室化玻璃状菌丝的菌丝体构成。分生孢子梗止于一个约20个紧密分生孢子的头中；在旧培养物上，它们继续发育，可相继产生5-10个额外的分生孢子簇。分生孢子接近其基部稀疏得多，它们几乎为锥形，由两个大小不同的细胞构成，平均总长度为27μm。该菌株保藏于国立微生物培养物保藏中心(CNCM，位于巴斯德研究所中)，保藏号为I-1425。菌株42A′来自布吉纳法索的Leguema。分子孢子梗止于一个约3-20个紧密服生孢子的头中；在旧培养物上，它们继续发育，可相继产生3-5个额外的分生孢子簇。分生孢子接近其基部稀疏得多，它们几乎为锥形，由两个大小不同的我成，平均总长度为30μm。该菌株保藏于CNCM(巴斯德研究所)中，保藏号为I-1426。菌株42B来自荷兰的Baarn菌类植物保藏中心。在育龄短的培养物上(短于1个月)，分生孢子梗罕见，止于一个约3-20个紧密分生孢子的头中；额外分生孢子簇的形成罕见。分生孢子接近其基部稀疏得多，它们几乎为锥形，由两个大小不同的细胞构成，平均总长度为28μm。该菌株保藏于CNCM(巴斯德研究所)中，保藏号为I-1427。菌株42Br来自巴西。分生孢子梗止于一个约10-20个紧密分生孢子的头中。它们继续发育，可相继生成5-10个额外的分生孢子簇。分生孢子接近其基部稀疏得多，其几首为锥形，由两个大小不同的细胞构成，平均总长度为23μm。该菌株保藏于CNCM(巴斯德研究所)中，保藏号为I-1428。菌株427采集于ToursIndre-et-Loire(法国)。分生孢子梗止于一个约10-20个紧密分生孢子的头中。在旧培养物上，它们继续发育，可相继生成3-5个额外的分生孢子簇。分生孢子接近其基部稀疏得多，其几乎为锥形，由两个大小不同的细胞构成，平均总长度为28μm。该菌株保藏于CNCM(巴斯德研究所)中，保藏号为I-1429。菌株42V1采集于VilleneuveLoubefAlpes-Maritimes(法国)。分生孢子止于一个约10-20个紧密分生孢子的头中。在旧培养物上，它们继续发育。可相继生成20-30个额外的分生孢子簇。分生孢子接近其基部稀疏得多，它们几乎为锥形，由两个大小不同的细胞构成，平均总长度为23μm。该菌株保藏于CNCM(巴斯德研究所)中，保藏号为I-1430。食线虫蘑菇菌的菌丝体具有生成可捕获线虫的捕捉器官的能力。依据本发明的6个Arthrobotrysconoides菌株的菌丝体陷阱的形状为菌丝环状物，其可以通过菌丝联结作用使自身转变为多少有些缠绕的网络(如图2所示)。在所研究的6个菌株中，只有菌株42A可自发地形成陷阱。对于其他5个菌株而言，生长培养基中线虫的存在可诱导陷阱的形成。在这两种情形中，陷阱由菌丝环组成，其可通过菌丝联结作用而转变为多少有些缠绕的网络。由于利用RAPD技术进行基因组研究所揭示出的一种寡核苷酸，这6个菌株无疑可被区分。电泳凝胶的使用引出了图3中的结果，其中对各种带做了图解，而对照材料则用来确定DNA片段的大小。Arthrobotrysconoides的不同菌株在工业上可用于杀线虫，其方法如下所述。为了在良好条件下保存蘑菇菌，我们使用了以谷粒为基础的生长培养基。蘑菇菌躲在谷粒内部，因而对外部的侵袭不太敏感。另外，撒落在地面上的每一个谷粒都是新菌丝体菌落的起始点。在进行灭菌处理之前，用过量的水浸泡谷粒24小时。然后用蘑菇菌接种物来接种谷粒。用于支持的最佳物种可使得在最短时间内获得最大限度生长。第二个标准是在生长顶点达到的每克增殖单位数。增殖单位对应于最小菌丝体片段或甚至对应于单独的分生孢子。所使用的物种选自草类、豆类或油类植物。为此可以使用大麻、向日葵和稻，它们达到最大限度生长的时间为14天。也可以使用燕麦、高梁、大麦、小麦、小扁豆、玉米、梯收草、大豆、蚕豆、羽扇豆。在上述种类中，达到最大增殖单位数(约3.107/g)的有羽扇豆、小扁豆、玉米、蚕豆、梯收草、鹰嘴豆及稻。为便于蘑菇菌的较好分布，我们建议以等同的重量来撒布较小的谷粒。由于该原因及其它原因，可优选使用梯牧草、小扁豆和玉米。对玉米而方言，每升土壤2g的比率就可产生令人满意的掺混。由于达到生长顶点需要一些时间，无们建议在种植前约15天时掺混蘑菇菌及其支持物。不同的Arthrobotrysconoides菌株也可以冷冻-干燥产物的形式使用。这里所要提醒的是冷冻-干燥是一种干燥技术、是通过组织溶液式悬浮液(其子先已通过冷冻而固化了)中所含的冰的升华作用而进行的。该技术一般用于在国立菌类物保藏中心中保存微生物。其意味着对操作条件的严格遵守-低温以确保产品的冷冻-低压以确保冰的升华-在冰升华期间缺乏间质液体。为了达到这些条件，就要在产品冷冻-干燥的压力与温度之间建立一个非平衡态，方法是在排出蒸汽的同时提高温度。在菌丝体上不能冷冻-干燥蘑菇菌，因为其对温度及压力变化过于敏感。因此必须使蘑菇菌敏殖，以便得到如同能够经受冷冻-干燥的抗性器官一样的分生孢子。使用分生孢子的必要性排除了同时使用任何液体培养基。使蘑菇菌在琼脂-琼脂大豆粉类培养基中生长。为了消除因琼脂-琼脂的存在及由培养基(大豆粉)重量而带来的不良作用，把一个赛璐薄膜插在琼脂-琼脂培养基和蘑菇菌菌接种物之间。该薄膜把蘑菇菌与培养基分隔开并且其特征在于蘑菇菌可通过薄膜表面来营养自身。一旦菌丝体侵架了生长培养基的整个表面，撒去薄膜并浸入一种富含维生素及微量元素的液体中。菌丝体及分生孢子本身从赛璐玢薄膜中释放出来。而后对菌丝体、分生孢子、维生素及微量元素共同进行冻干处理。维生素及微量元素的存在将有助于土壤上的起始。该技术的独创性在于真菌部分已事先从用于其生长的营养培养基中分离出来。因此冷冻-干燥的蘑菇菌呈粉状、水溶性，因而农民易于使用。蘑菇菌可通过机械播撒而以这种形式用作任何化学药品。通过这种方法，播撒在土壤上的产品量会大为减少，而产品可得到更好及更长时间的保存。由于达到生长顶点所需时间的长短不同，蘑菇菌Arthrobotrysconoides优选在种植前大约15天掺混于待处理的土壤中。我们对Arthrobotrysconoides的不同菌株对付根结线虫属、异皮线虫属及双垫开属D.mycelisophagus线虫的效力首先在消化平板上进行体外试验。对于这些体外试验来说，使Arthrobotrysconoides的不同菌株在陪化平板上的琼脂-琼脂培养基(玉米粉琼脂1，琼脂-琼脂1)上生长。一旦蘑菇菌侵染了所有琼脂-琼脂，使200条线虫无菌地沉积在每一蘑菇菌平板上，包括沉积在仅含有琼脂-琼脂培养基的对照平板上。经过一段时间(1小时、2小时、8及24小时)之后，把平板倒置于100μm的网筛上方，其底部触及到下面另一个陪氏平板的水面。经过这样处理，未被蘑菇菌捕获和线虫会主动地穿过筛网而到达水中。而后捕捉线虫并在显微镜下计数。在根结线虫属及双垫刃属D.myceliophagus线虫的实例中，6个菌株分为两组菌株A、A和B在24小时后捕提了60％至100％的线虫，另外3个菌株不够奏效。在异皮线虫属H.carotae的实例中，6个菌株在24小时后捕捉了50％至70％的线虫。另外，我们还观察到，蘑菇菌的发育是迅速的(平均每24小时1.5cm)。因而可进行实际利用，作为耕作及花卉培养物的食线虫剂具有令人满意的结果，也可以用于树木菌圃的植物。在与食线虫蘑菇菌之新菌株的生态学有关的试验框架中，我们观察到，这些新菌株在盐份不超过3g/l的土壤中发育良好。另外，值得注意的是，当以高剂量进行掺混时，食线中蘑菇菌对培养基的侵染要强烈得多。而且，蘑菇菌将明显地定居在附着层上，甚至以10％的剂量(以土壤体积计)。通过许多实验可确定Arthrobotrysconoides42的不同菌株的捕食其他动物的活性，以下实验结果资料供参考。I.玻璃下抗根结线虫属线虫的试管测试将所研究的菌株据其捕捉能力分为2个类群A、A′及B每24小时平均捕促80％的线虫；Br、T及V1每24小时仅捕捉30％的根线线虫属线虫。为了实现本测试，选择出每一类群中最具代表性的菌株，即A及V1。在含30ml土壤的50ml试管中进行测试。将生长灭菌、煮熟及碾碎的玉米类培养基上的蘑菇菌菌株掺混入土壤中，比例为100g/m2。对试管进行如下处理在D天时，在每一试管中沉积30条根结线虫属幼虫。24小时之后，取出每一系列之试管，对其含量进行分析，以确定有多少线虫被捕捉到。每天均重复进行该实验直至所有线虫都被捕捉到。结果见下表，该表显示出对任何Arthrobotrysconoides菌株来说，当在种植前15天(因而也是线虫寄主植物引起的线虫活动之前)掺混入蘑菇菌时，前几天中捕获率变化甚大，但该差异迅速减小。</tables>II.玻璃下抗根结虫属M.hapla的小盆测试该测试旨在揭示蘑菇菌ArthrobotrysConoides对根结线虫属M，haple的作用以及确定产品每m2的使用量。将ArthrobotrysConoides的6个菌株与该线虫一起测试。实验在含有300g土壤的小盆中进行，所选择的植物为SainfPierre蕃茄，是一种对线虫很敏感的植物。对每一小盆用每100g土壤100个线虫进行感染，其相应于田间平均感染的高限。通过用曙红对根进行染色来实现结果读数。这种重要的染色处理有助于计数由穿过胚根系的感染幼虫产生的第一代卵的数量。ArthrobotrysConoides是一种捕食其他动物的蘑菇菌，它可以在无线虫的条件下通过消化有机化合物(食腐性。进料)而在土壤中存活。这就是为什么要把无菌的有机物富集剂(无微生物)加入生境无菌土壤中的原因。这有助于蘑菇菌在实验的头15天中更好地发育。对处理剂量的计算基础是相当于108繁殖单位/m2土壤的繁殖单位数。对于6个ArthrobotrysConoides菌株来说，这个数是用15g高压灭菌的、碾碎的玉米类制剂平均达到的。为了留有机动的余地，测试6个菌株的一般平均剂量为40g/m2。每一菌株及每一剂量重复进行5次，不要忘记无蘑菇菌的对照项目。结果对于6个菌株共同的平均剂量且对应于40g/m2，结果如下:菌株A得到最佳结果。对于加倍剂量80g/m2，结果如下对于40g/m2剂量而言，菌株A产生了最佳结果，而菌株V1在该剂量时也是有效的。为了得到迅速及可信的结果，当菌株A在煮熟及碾碎的玉米类培养基上生长时，用80g/m2的剂量是较好的。III.对胡萝卜培养物受异皮线虫属H.carofae侵袭时的盆栽测试使用菌株A、B、T及V1实现了该实验。为了准备该测试，使用不同的菌株生长在煮熟并碾碎的玉米类培养基中。使用蘑菇菌的产量严格适合应于每一个菌株，以便使每升土壤的繁殖单位数恒定(108繁殖单位/100l)。对菌株A和B来说，接种剂量为60g/100l土壤。对于菌株T，接种剂量为190g/100l土壤。最后，V1菌株的接种剂量则为80g/100l土壤。对胡萝卜培养物保持不做处理而作为对照项目。在该实验期间，计数由感染幼虫世代产生的异皮线虫属H.carotae的孢囊数目。应该注意的是，菌株A及V1如同对根结线虫属M.halpa一样，对异皮线虫属H.carotae产生了最佳结果。IV.玻璃下对翻茄培养物的测试该实验是利用Arthrobotrysconoides42A在耕作环境中于玻璃下进行的。其旨在确定撒布在地面上的捕食其他动物的蘑菇菌的所需剂量。对该测试来说，使蘑菇菌生长在碾碎的玉米类培养基上。该培养基的含量为每克107繁殖单位。供我们使用的同样为120m2。将其分为3个反域、每个40m2，为了更好的隔离，用木板用隔。第一块同样为对照项目，与之邻近的地块用50g/m2的菌株42A制剂进行处理，而后一块田样则用100g/m2制剂进行处理。在进行该测试之前，对从目前培养物(生菜)间采集的土壤进行5折。这项测试是通过在土壤中种植幼龄敏感性蕃茄植物(SaintPierre品种)以揭示线虫存在而完成的。种植一个月后，用甲基蓝乳酚将根染色(GUIRAN，1996)。这种染色可显示已穿过蕃茄根的幼龄根结线虫属线虫。我们发现，每10g根有620条根结线虫属幼虫，这与平均感染一致。这种平均侵染速率对于测试食线虫蘑菇菌是理想的。的确，蘑菇菌象所有的生物拮抗方式一样发挥作用很慢，在仅有的耕作活动中不能调控线虫的过高繁殖。在种植番茄之前的15天撒布ArthrobotrysConoides42A。这段15天的时间为捕食其他动物的蘑菇菌提供了在土中定居的机会，因此在种植时间能发挥作用。的确，蕃茄植物在地下生成一些根渗出液，其有助于把幼虫引向根部。番茄植物分布在4行上，在中间两行(以避免边缘效应)，种值10株敏感性番茄植物(SaintPierre品种)。这些植物将来都要技出进行分析。最后在培养结束时取样。拔出敏感性植物并对其根进行分析。这样，一旦对胚根系进行洗涤，就以12·氯一法将其1％的次氯酸钙溶液中碾碎。该混合物经过一系列的网以弃去植物组织的片段。在5μm的网筛上收集由根部产生的根结线虫属的卵，在显微镜下计数。其构成培养物渐趋成熟的侵染潜力</tables>需要特别提出几点-根气候条件不同，一条根结线虫属的雌虫可产300-500个卵。-当每10g根中的幼虫数在100至1000之间时的感染可被认为是平均感染。在对照地块与用100g/m2Arthrobotrysconoides42A处理的地块之间浸染潜力的下降(达到一半以上)是显著的。对于用土壤、花盆或容器运送的植物，将食线虫蘑菇菌直接掺入土壤、花盆或容器中。开始时，将捕食其它动物的蘑菇菌接种在用于以供应市场为目的的植物的成型土壤中。使用这种方法，在20-30天内使从土壤中采摘的植物生长在温暖、湿润环境的温室中，在此期间蘑菇菌生长并侵入整块土壤，并且一旦植入培养物中就如同接种物一样。本发明的这种为化可用于以土壤、花盆、容器之类运送的植物，其表现出下列确定的优点通常，为了制备土壤，要使用中性PH的富会腐殖质的土壤，其尤其有利于Arthrobotrysconoides42的发育。另外，我们观察到植物胚根系被完全包封在菌丝的毡状物中，而后者则根本不干扰其生长。因此胚根系对于线虫作好戎备，甚至当将土壤植入受到强烈侵染的土壤中时也是如此。这样，一旦营养体生长开始幼龄植物就得到保护，直到植物最易受线虫侵袭的时期。不同的实验证明，土壤变成了一个重要的接种物，从中蘑菇菌将非常容易地撒布到周围的土壤中。这种土壤、花盆、容器或类似之物的准备不会产生任何困难，既不令在使用上也不会在植物制备上造成困难。只需要把颗粒置于土壤混合物中，例如使用加料漏斗。使用这种方法制备的植物可像往常一样种植。总之，本发明的方法在用于任何以供应市场为目的的园艺、花卉作物或树木菌圃的植物，尽管其中一些对植结线虫属线虫并不敏感，它也可以用来处理胡萝卜培养物(其对异皮线虫属H.carotae敏感)，或者用来对付栽培的二孢蘑菇中的双垫刃属D.myceliophagus线虫。在后一种情况下，将食线虫蘑菇菌在巴氏灭菌之后加入堆肥中。权利要求1.旨在对付根结线虫属线虫的食线虫剂，其特征在于其选自一组ArthrobotrysConoidesDreschsler的6个菌株，包括菌株42A、42A′、42B、42Br、42T及42V1。2.依据权利要求1的食线虫剂，其特征在于所述6个菌株的组别包括保藏于国立微生物培养物保藏中心(巴斯德研究所)的菌株，保藏号分别为I-1425、I-1426、I-1427、I-1428、I-1429、I-1430。3.对付作物中根结线虫属。异皮线虫属及双垫开属D.myceliophagus线虫的方法，包括将根据权利要求1或2的食线虫剂掺入耕作的土壤中。4.依据权利要求3的方法，其中通过事先已用食线虫剂接种物接种的谷粒将所述食线虫剂掺入土壤中。5.依据权利要求4的方法，其中所述从谷粒选自梯牧草、小扁豆及玉米。6.依据权利要求5的方法，其中食线虫剂事先已接种在碾碎的玉米类培养基中，每克含有至少107繁殖单位的所述药剂。7.依据权利要求5或6的方法，其中食线虫剂已事先接种在碾碎、煮熟及灭菌的玉米类培养基中，所述接种培养基而后被掺入土壤中，比例为100g/m2。8.依据权利要求5或6的方法，其中食线虫剂事先已接种在碾碎、煮熟及灭菌的玉米类培养基中，而后将所述接种培养基掺入土壤中，比例为每升土壤2g。9.依据权利要求3的方法，其中食线虫剂已在以粉状掺入土壤之前进行过冷冻-干燥处理。10.依据权利要求4的方法，其中食线虫剂被置于-培养基上生长，使得分生孢子在冷冻-干燥处理之前得以发育。11.依据权利要求10的方法，其中将赛璐玢薄膜插在待生长的食线虫剂与培养基之间，使得含分生孢子的所述食线虫剂的部分可通过将所述赛璐玢薄膜浸入液体中来收集。12.依据权利3泊方法，其中食线虫剂被直接掺入用于把植物运至树木菌圃式以供应市场为目的的菜园的土壤、花盒或容器中。13.依据权利要求3-12位一项的方法，其中所述食线虫剂在种植前的约15天时被掺入土壤中。全文摘要食线虫剂拟对付根结线虫属、异皮线虫属以及双垫刃属D.myceliophagus的线虫，其特征在于其选自一群ArthrobotrysConoidesDrechsler的6个菌株(42A、42A′、42B、42Br、42T及42V1，保藏于国立微生物培养物保藏中心(巴斯德研究所)，保藏号为I-1425-I-1430，其使用方法包括通过事先已用食线虫剂接种物接种过的谷粒将食线虫剂掺入培养物生长的土壤中。文档编号A01N63/02GK1156954SQ95193630公开日1997年8月13日申请日期1995年6月14日优先权日1994年6月15日发明者E·潘朔德申请人:艾笛勒沃2000责任有限公司