专利名称：杀虫基质和其制备方法
鉴于某些化学杀昆虫剂的毒付作用或缺乏特异性问题，而导致了用杀昆虫细菌和病毒开发生物杀虫剂。总地说来，在所有微生物生物控制剂中，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是最为成功的。并按照如化学控制剂的同样方式使用苏云金芽孢杆菌菌株作为杀虫剂。天然存在的芽孢杆菌蛋白质毒素都是多肽晶体毒素。这些毒素可对抗包括鳞翅目昆虫(特别是苏云金芽孢杆菌柯斯塔克亚种(B.thuringiensis var.kurstaki)和(B.thuringiensis var.aizawai))、鞘翅目昆虫(特别是B.thuringiensis var.tenebrionis)和双翅目昆虫(特别是苏云金芽孢杆菌以色列亚种(B.thuringiensis var.israelensis))。此外，已在生物杀虫剂中使用了各种病毒，特别是杆状病毒(Baculoviruses)，例如抗棉铃虫有效的棉铃虫核多角体病毒(NPV)及抗紫苜蓿和粉纹夜蛾有效的苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(NPV)。
一般如配制化学杀虫剂一样配制生物杀虫剂，并通过已有的喷雾技术施用之。这些配制品可包含昆虫病原体(病毒如NPV，或细菌如苏云金芽孢杆菌)、孢子和/或结晶体δ内毒素。但在大田使用时，这些配制品存在许多缺点。当生物杀虫剂暴露于阳光和紫外光照射时，含有的内毒素多肽可能失活，并因暴露而损伤孢子的核酸，使杀虫剂效力降低(参见Ignoffo et al.，Environ.Entomol.，6411-415(1977))。由于所用配方的效力降低而必须对期望进行昆虫控制的敏感植被生长地多次反复施用之。这些生物杀虫剂，特别是芽孢杆菌生物杀虫剂的再一个缺点是，以低剂量使用时它们是抑制摄食，而不是致死性的。摄入亚致死摄食抑制剂量的昆虫将在持续最长达几天的时间里停止摄食。这一特性，即当因阳光照射使生物杀虫剂失活及昆虫不摄食的情况合并出现时，可导致对靶昆虫的控制效果不佳。
已试图提供将杀昆虫细菌和病毒包含在有阳光掩蔽剂之配方中的生物杀昆虫配制品来解决因阳光照射导致的不稳定性问题。这些配制品各自包括胶囊包被的和非胶囊包被的活性毒素，但它们都有许多缺点。这些缺点对每种配方是特异的。仅就胶囊包被的混合物而言，常见的缺点包括形成胶囊壁的聚合物并不总是能够将阳光掩蔽剂保留在胶囊内部；有时在胶囊制剂中使用高毒性材料；有些胶囊只能用那些不能产生足够大颗粒的方法制造，从而不能为阳光掩蔽剂提供任何实质性屏障(例如由两相液体乳剂形成的极小颗粒即可在其整个颗粒内部经受实质性阳光照射)；以及胶囊包被易于在环境受到破坏。
非胶囊包被的混合物的缺点包括在通过喷雾装置施用于作物或靶区域之后，大部分阳光掩蔽剂通常不能足以封闭应有效发挥作用的生物体或毒素；非胶囊包被的混合物也可能存在如上述的缺点，致使昆虫摄入亚致死摄食抑制剂量，但其后再恢复其正常摄食。
本发明克服了现有技术组合物和配制品的缺点。活性蛋白质毒素被胶囊包被或留存在聚合物基质中，其中颗粒大小足以包含使靶昆虫致死的剂量的毒素蛋白质。胶囊包被的方法可使大部分含有活性毒素或活性成分的孢子和/或晶体包裹在胶囊中，并且少部分孢子和晶体仍为非胶囊化的。组合物的成分和制备方法并不会使生物杀虫剂的活性成分失活，或者留下有毒理学问题的残留物。胶囊化的颗粒在向靶位点施用期间是稳定的，并且在环境中也是稳定的。当被昆虫摄入时，活性成分即释放到敏感昆虫的消化道内。该组合物含有实质上无毒的光阻断剂，并且在施用于靶位点期间和其后该阻断剂仍保留在组合物基质之内。
本发明提供了杀昆虫有效的生物杀虫组合物和制备所说组合物的方法，以保护靶部位免于遭受虫害。将杀昆虫的细菌或病毒活性成分如见于苏云金芽孢杆菌或杆状病毒中的芽孢或杀昆虫晶体蛋白质或其组合与一种聚合物和无机光阻断剂混合以制备生物杀虫剂，其中聚合物形成一种用于无机光阻断剂与活性成分结合的基质。
因此在第一个方面，本发明涉及杀昆虫有效的生物杀虫组合物，其包含(a)选自杀昆虫细菌和病毒的活性成分；(b)在中性至碱性条件下可溶于含水介质并且在弱酸性条件下不溶于含水介质的聚合物，其中聚合物形成基质；以及(c)无机光阻断剂，其中所说的光阻断剂不溶于水并与活性成分一起分散于由(b)的聚合物形成的基质内，并且其中光阻断剂保护活性成分免于遭受紫外光照射和阳光对其造成失活作用。
在一优选实施方案中，细菌是芽孢杆菌并且病毒是杆状病毒。
可进一步将如此制成的组合物配制成含水的、干燥的或不含水的终产品。
在第二个方面，本发明涉及制备杀昆虫有效的生物杀虫组合物的方法，其包括(a)制成聚合物溶液，其中所说的聚合物在中性至碱性条件下可溶于含水介质并且在弱酸性条件下不溶于含水介质；(b)制成无机光阻断剂的分散液；(c)制成选自细菌和杆状病毒之杀昆虫成分的悬浮培养物；(d)制备挥发碱的溶液并将所说溶液与步骤(c)的悬浮培养物合并；(e)将光阻断剂的分散液与聚合物的溶液混合以得到第二分散液，然后将第二分散液与活性成分的悬浮液和挥发碱的溶液合并；以及(f)喷雾干燥(e)的混合物。
其中活性成分和光阻断剂被分散于由聚合物形成的基质中。
本发明的另一个实施方案包括制备杀昆虫有效的生物杀虫组合物的方法，其包括(a)制得包括苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白质或孢子或其混合物或杆状病毒的活性成分的悬浮培养物，并将无机光阻断剂与此悬浮液混合；(b)制成聚合物溶液，其中所说的聚合物在中性至碱性条件下溶于含水介质并且在弱酸性条件下不溶于含水介质，其中聚合物是占组合物3-10％的羧基聚丙烯酸或苯乙烯-马来酸酐共聚物；(c)将(a)的混合物与(b)的溶液混合以得到悬浮液；以及(d)喷雾干燥悬浮液，其中活性成分和光阻断剂分散于由聚合物形成的基质中。
在另一个方面，本发明包括在希望进行控制部位控制害虫的方法，包括在所说的部位施用杀昆虫有效量的所公开的杀虫组合物。
本发明涉及上述方法和按该方法制成的组合物。
图1显示实施例3中所述组合物对对照样品的EC50活性比例。
本发明的生物杀虫组合物由三种主要成分组成，即活性杀虫成分；无机光阻断剂；及形成组合物之基质的聚合物成分。
在一优选实施方案中，活性成分是从杀昆虫的芽孢杆菌属如苏云金芽孢杆菌、日本甲虫、芽孢杆菌(B.popillae)和球形芽孢杆菌(B.sphaericus)，特别是苏云金芽杆菌中制得的。特别优选可从任何苏云金芽孢杆菌亚种中分离出的杀虫晶体蛋白质和孢子，所述苏云金芽孢杆菌亚种是天然存在的或以重组DNA技术构建的。
苏云金芽杆菌的分类是基于生物化学和血清学标准。这些区分相当于具有特异表型特征的亚种或变种。苏云金芽孢杆菌的亚种包括如H.de Barjac and E.Frachon，Classification of B.thuringiensis strains，Entomophaga，35233(1990)中公开的thuringiensis、kurstaki、sotto、dendrolimus、entomocidus、aizawai、morrisoni、tolworthi、israelensis及其它种。在孢子形成期间，苏云金芽孢杆菌合成一定量组织成晶体的一种或多种杀昆虫蛋白质。当芽孢形成时晶体蛋白质即释放到环境中。编码晶体蛋白质的基因是公知的并定名为cry基因。已分离了许多cry基因，并已确定由这些基因编码的蛋白质的不同在于其昆虫特异性。市场上最多见的苏云金芽孢杆菌菌株可表达四种或更多种晶体蛋白质，在这方面由苏云金芽孢杆菌中分离的晶体蛋白质可包括一种以上的晶体毒素蛋白质。
本发明可包括由T.Yamamoto and G.Powell，在AdvancedEngineered Pesticides(de.Leo Kim)(1993)(该文献并入本文作为参考)的表1中列示并公开的各种基因编码的任何苏云金芽孢杆菌晶体蛋白质。本发明还包括经基因工程改造的活性毒素。例如可将通常呈现高水平抗鳞翅目活性的苏云金芽孢杆菌柯斯塔克亚种菌株工程改造成表达抗鞘翅目活性cry IIIA基因。应明确的是，任何芽孢杆菌活性毒素均可用于本发明。优选的毒素蛋白质包括CryIA、CryIB、CryIC、CryID、CryIE、CryIF、CryIG、CryII、CryIII、CryIV、CryIH、CryV、CtyA、CytB及其变体、混合物或其部分，但本发明不只限于这些毒素蛋白质。特别优选的毒素包括CryIC、IryIA(a)、CryIA(b)、CryIA(c)、CryIE、CryIIA及其变体、混合物及其部分。
重组技术是本领域技术人员公知的并包括经接合和电穿孔以增加特定芽孢杆菌菌株产生的毒素蛋白质数量，以及使用蛋白质设计技术以产生表达融合或杂合蛋白质的基因。一种杂合基因的例子是包含不同的Cry蛋白质特别是CryIE和CryIC之片段的G27。在Boschet.al.，Biotechnology 12915-918(1994)(并入本文作为参考文献)中已详细描述了这种蛋白质。本领域技术人员会理解到，其他杂合基因及上述例子并不是以任何方式限制本发明。
除了由各种不同的苏云金芽孢杆菌菌株产生的杀虫晶体蛋白质外，由所说菌株产生的芽孢也可具有杀虫特性。例如已知某些芽孢可有效地对抗如Galleria mellonella的昆虫。
在另一个优选的实施方案中，活性成分是杆状病毒。杆状病毒是划分为下列三个亚类的一大类病毒核多角体病毒(NPV)；颗粒层增殖(granulosis)病毒(GV)和polydmavirdae。这些病毒可感染作为商业上重要的农作物之害虫的许多昆虫。
杆状病毒的一个优点在于它们的宿主特异性。性质上了解最清楚的杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(NPV)。该病毒的特征是在被感染之宿主细胞的核中形成病毒包涵体。包涵体的大小因特定的亚类而异。包涵体是一种其中包含有病毒粒子的晶体蛋白质结构。
在本发明中优选的杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒NPV，棉铃虫NPV，甜菜夜蛾NPV，和Anangrapha falcifera NPV。正如上文中指出的，苏云金芽孢杆菌与杆状病毒的重组菌株也包括在本发明范围内。参见The Biology of Baculoviruses，Vol I and II，Granadosand Federici eds.，CRC Press，Boca Raton，FL 1986有关对杆状病毒的综述。
杀虫活性成分约占组合物重量的10-90％，较好占组合物重量的约30-80％，最好占组合物重量约45-75％。
聚合物一般定义为以线性链或分支方式或两个组合方式，经化学结合单体分子的多个拷贝所形成的分子。一种聚合物可由单一类型的单体形成，也可使用两种或多种类型的单体形成的聚合物。本发明中优选的聚合物是聚乙酸乙烯酯、聚(丙烯酸)或其酯或羧基衍生物；紫胶和苯乙烯和马来酐的共聚物和其衍生物，以及这些聚合物的混合物。特别优选的是高分子量聚合物和共聚物，最优选的是苯乙烯/马来酐共聚物和羧基聚丙烯酸。
形成组合物基质的聚合物是由下述一般特征限定的。聚合物必须能够保留住光阻断剂。聚合物必须是不溶于被处理之植被所暴露的环境中的，并且必须是可溶于一般偏碱性的昆虫肠道环境中的。而且如果载体是一种液体，该聚合物必须不溶于该制剂的载体中。聚合物必须基本上不溶于作为其在喷雾罐和喷雾装置中之载体的水中。聚合物形成的基质必须有足够的不易粉碎性质，这样才能使组合物或终产物制剂抵抗住在加工和处理过程中所经受的磨耗和机械压力。
聚合物溶液的pH应在大约3.5至9.0范围内，较好在约5.0至8.0之间，更好在5.5至7.0范围内。
中性至碱性条件限定为大约pH6.0至11.5，较好是约pH6.5至11.0。弱酸性条件限定为大约pH6.0至4.0。较好是pH5.5至4.0。含水介质是其中以水为溶剂的介质。
一般说来，聚合物将占组合物重量的大约0.5-25％，较好占组合物重量的约1-15％，最好占组合物重量的约3-10％。
应用于本发明组合物中的无机光阻断剂是不仅能挡住紫外光照射，而且还能阻挡阳光的制剂，并可包括光吸收剂及光反射剂。光阻断剂必须是与聚合物材料和活性杀虫成分相容的、并且不溶于组合物在被敏感昆虫消化之前所遭遇到的任何环境中。
业已发现，生物杀虫剂对紫外光照射的总体稳定性并不是其阳光稳定性的良好的预测指征。某些光阻断剂在由汞灯产生的紫外光下可能有很好的效能，但不能阻挡阳光的照射。此外，为了能在实践中有效地应用，光阻断剂应以其被实际掺入到配制品之内时的量发挥其功能。一般必须以很大量使用那些不能强有力地吸收紫外光或阳光的材料，因为，为了达到从实质上抵抗阳光或紫外光照射的目的，任何基于这些材料制成的颗粒必须是足够大的。一般说来，可使用不溶于水的粘土、金属氧化物和无机矿物质及颜料作为本发明的光阻断剂。有两种特殊类型的光阻断剂特别适用于本发明，其包括作为光反射剂的二氧化钛，及作为光吸收剂的碳黑。另外可使用墨素和噬菌调理素作为光阻断剂。可以将这些制剂联合掺入本发明的组合物中。
光阻断剂约占组合物重量的5-90％，较好占组合物重量的约5-60％，最好占组合物重量的约10-50％。
特别优选的本发明的组合物约含有30-80％的活性成分，约1-15％的聚合物和约5-60％的无机光阻断剂。所说的百分比均为组合物的重量百分比。
本文中使用的术语“基质”是指由本发明的聚合物分子组成的，并含有空位、空隙或由组合物的其他成员占据之空间的连续固相。至少有大约60％并较好有60％的活性成分必须保留在聚合物基质内。本文中使用的术语“分散的”是指很充分混合的，从而使光阻断剂或活性成分的个别颗粒实质上得以均匀地分配。它们可以分配于水或如本文所述的聚合物溶液中。此外，悬浮液中的颗粒本身并不是由较小颗粒的大聚集体形成的，为此，大的聚集体被看作是直径大于约5-30微米，较好直径约为5-20微米的颗粒。
在一优选方案中，组合物含有选自苏云金芽孢杆菌之晶体蛋白质和芽孢的活性杀虫成分、羧基聚丙烯酸聚合物或苯乙烯-马来酐共聚物或其混合物，以及作为光阻断剂的碳墨。可从天然存在的苏云金芽孢杆菌菌株或表达编码外源晶体蛋白质之毒素基因的重组苏云金芽孢杆菌菌株中得到活性成分。另一个优选实施方案包括选自苏云金芽孢杆菌柯斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis var.kurstaki)的活性成分。再一种实施方案包括选自苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种(Bacillus thuringiensisvar.aizawai)的活性成分。再一个实施方案包括选自CryIC、CryIA(a)、CryIA(b)、CryIIA、CryIA(c)及其片段和其包括杂合蛋白质之混合物的活性毒素。
可用下述方法制备本发明的生物杀虫组合物。
可用本领域公知的方法制得苏云金芽孢杆菌的杀虫成分，但通常在发酵生产过程中产生将用于组合物中的蛋白质和芽孢。发酵方法是公知的、并已由Bernhard和Utz(参见Entwistle et al.，Bacillusthuringiensis，an Environmental Biopesticide，Wiley and Sons，(1993)；其列为本文参考文献)作了描述。通过在含有氮源、碳水化合物和矿物盐并调至大约pH7.0的适当营养培养基中发酵，来再生或增殖携带有被表达为活性毒素之有用基因的苏云金芽孢杆菌菌株。这种发酵过程通常在大约20℃至40℃的温度下进行24至72小时。可通过蒸发和/或离心发酵液至所需的浓度来制得苏云金芽孢杆菌菌株的悬浮液浓缩物。
苏云金芽孢杆菌悬浮液一般含有约2-10％重量的杀虫晶体蛋白质和类似用量的芽孢。苏云金芽孢杆菌悬浮液内可含有其他添加剂，例如氢氧化铵等挥发碱和硫酸等非挥发酸。在一优选实施方案中，制备硫酸铵的溶液并与活性成分悬浮液相混合。
可用本领域已知的技术，并参考Anderson et al.，Proc.IVIFSFerment Technol.Today，623-628，1972和Chakraborty，S.et al.，Australas Biotechnol.，5(2)，82-86，1995(在此并入本文作为参考文献)所述的方法增殖用于本发明的杆状病毒成分。
一般说来，一种方法包括繁殖对特定杆状病毒敏感的昆虫幼虫并用杆状病毒的接种物感染幼虫。在杆状病毒感染完成其感染过程后将昆虫幼虫的尸体制成匀浆。第二种通用方法包括在含有营养培养基的细胞培养物容器中增殖昆虫细胞。在容器内接种杆状病毒的接种物。当杆状病毒完成其感染过程时，收获容器的内容物并经离心或过滤回收杆状病毒。
将聚合物以大约0.5-20％重量的浓度加入水中，使温度升至大约60℃至80℃，较好约70℃，轻轻搅拌并在一定时间内加入碱的水溶液，较好是氢氧化铵或氢氧化钠水溶液以使终pH值达到大约5.5至8.0，较好达到大约7至8而制备聚合物溶液。然后将此混合物搅拌几小时或过夜以确保聚合物的充分溶解。较好使用高剪切强度的混合器制成所有的混合物和分散液。
可以用多种手段确立pH条件，其中包括将适当量的挥发碱例如氨水，及非挥发酸例如硫酸与聚合物溶液混合。对条件的选择是根据对在喷雾干燥前使聚合物保留在溶液中，和在喷雾干燥期间使足够的挥发碱被蒸发掉的需要而控制的。使适当量的非挥发酸和挥发碱在将被喷雾干燥的悬浮液中混合，使所得到的活性成分和光阻断剂在聚合物基质中制成的颗粒在重新被悬浮于水中对具有比喷雾前的悬浮液约低0.5至2.5个pH单位，较好低约1.0个pH单位的pH。所导致的pH值是易于聚合物溶解的过酸性pH，因此当颗粒被悬浮在水中时即可放之保留其物理稳定性。
可在悬浮液中加入其他添加剂；例如可加入减少聚合物发生交联和在二价阳离子如EDTA存在下发生沉淀反应之倾向的化合物。
向聚合物溶液中加入水并任选加入分散剂如木素硫酸盐，以制得无机光阻断剂在聚合物溶液中的分散液。分散剂是本领域中公知的。然后将光阻断剂加入上述混合物中，并较好用高剪切力混合器进行混合。
喷雾干燥所得混合物，使混合物中的大部分水和挥发碱蒸发掉。可以按常规方法控制喷雾干燥器以得到直径范围为1至50微米的颗粒，优选的颗粒(体积平均)大小为直径约10至40微米。颗粒大小分布较好是相对窄的，从而使至少60％的颗粒，更好80％的颗粒具有或接近平均直径的粒度。
应强调的是，本发明的组合物可包含其他一些常规试剂和添加剂，例如包括但不只限于如辛基苯酚乙氧基化物等表面活性剂、丙酸等稳定剂、脱脂大豆粉等充填剂、合成的沉淀二氧化硅等流动性增加剂或抗粘结剂；及缩合的萘磺酸的钠盐等分散剂。表面活性剂的量可在宽的范围内变化。为方便起见，这些添加剂可占组合物重量的大约0.1至50％，较好约占0.5％至40％，最好约占1％至20％。
可以进一步配制本发明的组合物，并且许多生产配制的生物杀虫产品的方法都是本领域技术人员已知的。在技术文献和专利文献中都描述了这些方法，其中包括制成颗粒、可湿粉末、水基和油基可流动制剂及浓缩物等的方法。下面给出的实施例是为了举例说明，而不是以任何方式限制本发明。
A.可湿粉剂配方63％活性杀虫成分、10％流动剂(沉淀的二氧化硅)、4％表示活性剂(萘磺酸盐)、13％分散剂(烷基芳基多氧基乙酸盐)、7％载体(活性白土)及3％螯合剂(EDTA)。
B.颗粒剂配方63％活性杀虫成分、20％流动剂(沉淀的二氧化硅)、3％表面活性剂(线性烷基苯磺酸盐)、5％分散剂(阴离子表面活性剂和木素磺化钠的掺合物)及9％载体(高岭土)。
可将含有活性杀虫成分和任何进一步的制剂的本发明组合物应用于在需要控制昆虫害虫的部位进行这种控制的方法中，该方法包括将杀虫有效量的组合物施用于某一所述部位，其中所说的部位包括但并不限于农作物植物或昆虫生境。可能是鳞翅目、双翅目和鞘翅目昆虫之生境的靶部位包括但不限于谷物如小麦、玉米、水稻和大麦；棉花；豆科植物；油料植物如向日葵；蔬菜作物；落叶和针叶树木；果木和蔓茎作物以及新鲜水体。杀虫有效量是指可导致被控制的昆虫达到相当死亡率的活性成分的量。
制剂可以是能够分散于水中的并且是可以在施用之前用水稀释的。适当的浓度、稀释度及适当的施用时间和方法均取决于待控制之病原体的性质和待处理之植被的类型，这些条件的选定对本领域技术来说是显而易见的。
下列实施例更充分地举例描述本发明的特定实施方案。如本领域技术人员将会理解到的，这些实施例是进一步阐述而不是限制本发明。此外，在实施例1A-D中使用所指出的成分或其稍有变化的成分制备至少十种同样的组合物。
实施例1生物杀虫组合物A.碳黑和羧基聚丙烯酸将89g水加热到70℃并在轻轻搅拌下加入10g羧基聚丙烯酸(Carboset 525，BF Goodrich)。在4小时期间内，以5个有相等间隔和份量的等份加入1g 30％氢氧化铵水溶液。将此溶液(I)搅拌过夜。
将10g碳黑(Printex P，Degussa)加到90g水中并用高剪切强度混合器混合3小时。用25％含水硫酸将此碳黑分散液(II)的pH调到2.0。
将16g分散液(II)加到4g溶液(I)中，并用高剪切强度混合器混合至少30分钟，以产生碳黑在聚合物溶液(III)中的pH为5.9至6.4之间的分散液。将8g苏云金芽孢杆菌柯斯塔克亚种SA 12菌株芽孢和晶体的含CryIA(c)和CryIA(b)的粉末制剂与72g水混合，并搅拌2小时。用25％硫酸水溶液将该悬浮液的pH调到4.2，然后用30％氢氧化铵水溶液调到pH5.0。将此pH调整过程重复2次以上。用30％氢氧化铵水溶液将苏云金芽孢杆菌悬浮液的pH调到比制剂(III)的pH高0.1单位，并用高剪切强度混合器将两者一起至少混合45分钟。用Buchi190 Mini Spray Dyer喷雾干燥所产生的混合物，其中入口空气温度约为180℃，降低的空气压约为52mbar，喷雾速度约为10ml/分，雾化空气压为4bar，并调整喷嘴使颗粒大小有一个平均直径约为10至20微米的窄的粒度分布。在阳光下此样品半寿期约为20mW-hrs/cm2(于360nm处检测的)，相比之下不含碳黑但其他成分完全相同的样品则约为10mW-hr/cm2。Fowler等人(Photo-Stability Preparation of B.thuringiensis and Use of Light-Absorbing Protectants，Eighth IUPACInternational Congress on Pesticide Chemistry，July 1994，Washington，DC，在此并入本文作为参考文献)已描述了检测半寿期的方法。
B.二氧化钛和羧基聚丙烯酸按实施例1A中所述方法制备聚合物溶液(I)。将4.2g苏云金芽孢杆菌柯斯塔克亚种SA 12菌株芽孢和晶体的粉末制剂与79.2g水混合，并搅拌2小时。用25％硫酸水溶液将该悬浮液的pH调到4.2，然后再用30％氢氧化铵水溶液调到pH6.2。在用30％氢氧化铵水溶液将pH调到6.5之前，将此pH调整过程重复2次以上。
向苏云金芽孢杆菌悬浮液中加入4.6g二氧化钛(Tronox，Kerr-McGee)并用高剪切强度混合器混合以产生分散液(IV)。将0.4g EDTA与3.6g水混合并加到分散液(IV)中。然后立即加入8g聚合物溶液(I)并用高剪切强度混合器混合至少45分钟。按实施例1A中所述方法喷雾干燥所制得的混合物。该样品在阳光下有大约20mW-hrs/cm2的半寿期，而不含二氧化钛但其他成分完全相同的样品则为10mW-hrs/cm2。
C.碳黑和苯乙烯/马来酐共聚物在轻轻搅拌下将10g苯乙烯/马来酐共聚物(Scripset 520，Monsanto)加到83.2g水中。在5小时内加入分10等份的6.8g 30％氢氧化铵水溶液。将此溶液(V)搅拌过夜。将10g碳黑加到90g水和0.2g 98％硫酸中并用高剪切强度混合器混合3小时，以形成分散液(VI)。向4g溶液(V)中加入16g分散液(VI)并用高剪切强度混合器至少混合30分钟，以产生pH约为5.9至6.4的碳黑在聚合物溶液(VII)中的分散液。
将8g苏云金芽孢杆菌柯斯塔克亚种SA12菌株芽孢和晶体蛋白的粉末制剂与72g水混合并搅拌2小时。用25％硫酸水溶液将该悬浮液的pH调到4.2，然后再用30％氢氧化铵水溶液调到6.3。用30％氢氧化铵水溶液调整苏云金芽孢杆菌制剂的pH使之比制剂(VII)的pH高0.1单位，用高剪切强度混合器将两者一起至少混合45分钟。
用常规喷雾干燥装置喷雾干燥所得到的混合物，控制喷雾干燥条件使所得颗粒有平均直径约为10-20微米的窄的粒度分布。在阳光下样品的半寿期约为20mW-hrs/cm2，相比之下不含碳黑但其他成分完全相同的样品半寿期则大约为10mW-hr/cm2。
D.碳墨和羧基聚丙烯酸将4g羧基聚丙烯酸(Carboset 525，B.F.Goodrich)加到22.7g水中，升温至大约70℃，轻轻搅拌并在大约1至8小时的时间里加入浓氢氧化钠溶液以使终pH为大约7至8，制得聚合物溶液(I)。然后将此混合物搅拌几小时或过夜以确保聚合物的充分溶解。将197.3g水加到聚合物溶液(I)中，加入0.66g木素磺酸盐或类似的分散剂(如Rohm &Haas，philadelphia，PA生产的Tamol SN或Westvaco，CharlestonHeights，SC生产的Polfon H)，再加入33g碳黑并用高剪切强度混合器混合以制得碳黑(Printex G，Degussa)在聚合物溶液中的分散液(II)。将4.2g硫酸铵溶解于30g水中制成该盐的溶液(III)。将63g苏云金芽孢杆菌柯斯塔克亚种SA 12菌株芽孢和晶体蛋白的粉末制剂与500g水混合并搅拌2小时。使该Bt悬浮液(IV)与硫酸铵溶液(III)混合，并根据需要用浓氢氧化钠或浓硫酸将pH调到6.3。将Bt悬浮液(IV)与加在聚合物溶液中的碳黑分散液(II)混合在一起以制得喷雾前浆液(V)。按上文实施例1A中所述方法喷雾干燥此喷雾前浆液。如阳光下该样品的半寿期约为100mW-hrs/cm2，而不含碳黑但其他成分完全相同的样品为10mW-hrs/cm2。
E.碳黑和苯乙烯/马来酐共聚物
制成作为5.4％总固体物之含水悬浮液的苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(NPV)制剂。经卵石研磨过夜使100g碳黑(Norit A)分散于含5g分散剂(Morwet，Witco Corp)的395g水中。然后将66.1g该分散液与66.1gNPV悬浮液混合并将pH调到8.6，以得到第二分散液。按实施例1C中所述方法制备苯乙烯/马来酐共聚物的溶液，但其中用200g水溶解共聚物。将聚合物溶液与第二分散液混合，并按实施例1A中所述方法喷雾干燥所得到的混合物。
实施例2杀虫活性按实施例1C中所述方法制备样品，但其中通过改变喷雾干燥条件制得平均直径范围为约4至45微米的不同大小的颗粒。使降低的空气压从大约52mbar改变为大约43mbar，喷雾速度从大约10mL/分改变为大约7ml/分，并调整喷嘴以得到有预期的窄粒度分布的颗粒。将样品悬浮在含0.2％表面活性剂(Sylard 309，Dow Corning)的水中并在6至10叶片阶段喷洒在宽叶甘蓝植物上。在沉积物干燥之后，收集甘蓝叶并用晚期第一龄粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)幼虫感染之。接种4天后，测死亡率并使用Finney，D.J.Probit Analysis，Cambridge University Press(1964)所述的概率值计数法确定EC 50值(参见
图1)。EC 50定义为引起50％死亡率的浓度。该图显示，与不包含用来阻止单个芽孢和晶体在叶子表面上分布的聚合物的对照样品相比，本发明的组合物提高了活性，从而给出亚致死摄食抑制剂量。
实施例3杀虫活性的效力和持久性按照已作了如下改动的上述实施例1A中所述的方法制备样品将4g溶液(I)与48g分散液(II)混合，并将4.8g苏云金芽孢杆菌粉末与43.2g水混合。将所得到的喷雾干燥的粉末(VIII)悬浮在水中并按照实施例2中所述的同样方法以相当于每英亩0.33lb苏云金芽孢杆菌的施用比率喷洒在甘蓝上。不含碳黑或聚合物的对照样品也以相当于每英亩0.85lb苏云金芽孢杆菌的施用比率喷洒在甘蓝上。使植物暴露于阳光下，收集叶子并感染粉纹夜蛾幼虫。表1中显示了作为阳光下暴露天数之函数的死亡率(相对于未处理的植物校正的)。
表1阳光下暴露天数 死亡率(％)胶囊化的 非胶囊化的0 100 1002 97 783 100 484 93 375 100 376 83 107 78 08 80 -实施例4持久性当将苏云金芽孢杆菌和碳黑的1∶1混合物(IX)以10％总固体物的浓度和相当于每英亩30g的喷洒比率喷洒在玻璃板上，其在阳光下的半寿期约为26mW-hrs/cm2。当浓度降低至1％总固体物时半寿期降低到大约15mw-hrs/cm2。这一低水平固体物在玻璃平板上没有足够量紧靠近苏云金芽孢杆菌制剂的碳黑，从而提供了抗阳光照射的有效保护作用—其余的光阻断剂层则没有足以吸收显著比例之入射照射的厚度。在典型的农业应用中，为了获得广泛的实用性，当将杀虫剂以不超过1％的总固体物浓度喷洒时，它必须是有效的。
然后按上文实施例1C中所述的制备样品，并将其以1％总固体物浓度和相当于每英亩30g的喷洒比率喷洒在玻璃平板上。在阳光下其半寿期大于130mW-hrs/cm2。这一结果证明聚合物基质在与无机光阻断剂的颗粒密切接触中保留苏云金芽孢杆菌制剂之芽孢和晶体的实用性，并证明该组合物如何提供阻止其遭受阳光失活的有效保护作用。
权利要求
1.一种杀虫有效的生物杀虫组合物，它包含下列成分(a)选自杀虫细菌和病毒的活性成分；(b)在中性至碱性条件下可溶于含水介质并且在弱酸性条件下不溶于含水介质的聚合物，其中聚合物形成基质；以及(c)无机光阻断剂，其中所说的光阻断剂是不溶于水的，并与活性成分分散于由(b)的聚合物形成的基质内，并且其中光阻断剂保护活性成分免于遭受由紫外光照射和阳光造成的失活作用。
2.根据权利要求1的组合物，其中活性成分是苏云金芽孢杆菌晶体蛋白质或芽孢或其组合成分。
3.根据要求1或2的组合物，其中活性成分占组合物重量的大约30％至80％，聚合物占组合物重量的大约1％至15％，无机光阻断剂占组合物重量的大约5％至60％。
4.根据权利要求1至3中任何一项的组合物，其中所说的活性成分衍生于苏云金芽孢杆菌柯斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis var.kurstaki)的菌株。
5.根据权利要求1至3中任何一项的组合物，其中所说的活性成分衍生于苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种(Bacillus thuringiensis var.aizawai)的菌株。
6.根据权利要求1的组合物，其中所说的活性成分衍生于芽孢杆菌的重组菌株。
7.根据权利要求1的组合物，其中所说的活性成分衍生于芽孢杆菌的天然存在的菌株。
8.根据要求2的组合物，其中活性成分选自CryIC、CryIA(a)、CryIA(b)、CryIA(c)、CryIIA和CryIE和其混合物或部分。
9.根据权利要求1至8中任何一项的组合物，其中聚合物是羧基聚丙烯酸或苯乙烯/马来酐共聚物。
10.根据要求1至9中任何一项的组合物，其中无机光阻断剂是碳黑、二氧化钛或其混合物。
11.根据权利要求1的组合物，其中病毒是包括Autographacalifornica NPV；Heliothis zea NPV、Spodoptera exigua NPV、Anagrapha falcifera NPV在内的杆状病毒。
12.根据权利要求1至11中任何一项的组合物，其中所说的组合物进一步被在制成颗粒剂、可湿性粉剂、水基可流动配制品或油基可流动配制品。
13.在期望进行控制的部位控制害虫的方法，其包括在所说的部位施用杀虫有效量的根据权利要求1-12中任一项的组合物。
14.根据权利要求13的方法，其中害虫是鳞翅目害虫。
15.根据权利要求13的方法，其中害虫是鞘翅目害虫。
16.制备杀虫有效的生物杀虫组合物的方法，其包括(a)制成聚合物溶液，其中所说的聚合物在中性至碱性条件下可溶于含水介质并且在弱酸性条件下不溶于含水介质；(b)制成无机光阻断剂的分散液；(c)制得选自细菌和病毒之活性杀虫成分的悬浮液培养物；(d)制备挥发碱的溶液并将所说的溶液与步骤(c)的悬浮液合并；(e)将光阻断剂的分散液与聚合物的溶液混合以得到第二分散液，然后将第二分散液与活性成分的悬浮液及挥发碱的溶液合并；以及(f)喷雾干燥(e)的混合物；其中将活性成分和光阻断剂分散于由聚合物形成的基质中。
17.根据权利要求16的方法，其中所说的细菌是包含杀虫蛋白质或芽孢或其混合物的苏云金芽孢杆菌。
18.根据权利要求16的方法，其中所说的光阻断剂是碳黑或二氧化钛或其混合物，并占组合物的大约5-60％。
19.根据权利要求18的方法，其中聚合物是羧基聚丙烯酸或苯乙烯/马来酐的共聚物，并占组合物的1-15％。
20.按权利要求16的方法生产的生物杀虫组合物。
21.制备杀虫有效的生物杀虫组合物的方法，其包括(a)制得作为活性成分的包含杀虫蛋白质或芽孢或其混合物之苏云金芽孢杆菌的或杆状病毒的悬浮液培养物，并将无机光阻断剂与此悬浮液混合；(b)制成聚合物溶液，其中所说的聚合物在中性至碱性条件下可溶于含水介质并且在弱酸性条件下不溶于含水介质，且其中聚合物是羧基聚丙烯酸或苯乙烯/马来酐的共聚物，并占组合物的大约3-10％；(c)将(a)的混合物与(b)的溶液混合以得到悬浮液；以及(d)喷雾干燥该悬浮液，其中活性成分和光阻断剂被分散于由聚合物形成的基质中。
22.按权利要求21的方法生产的生物杀虫组合物。
全文摘要
本发明涉及新的生物杀虫组合物，该组合物含有选自杀虫细菌和病毒的活性杀虫成分，如苏云金芽孢杆菌晶体蛋白质或芽孢或其混合物及杆状病毒如核多角体病毒、颗粒体病毒和非闭合病毒；聚合物；及无机光阻断剂，其中光阻断剂防止活性成分因遭受到紫外光和阳光的照射而失活，聚合物则形成其中分散有活性成分和光阻断剂的基质。生产生物杀虫组合物的方法和控制昆虫的方法也包括于本发明的范围之内。
文档编号A01N63/00GK1161144SQ9611994
公开日1997年10月8日 申请日期1996年8月23日 优先权日1996年8月23日
发明者B·E·费斯坦, J·D·福勒 申请人:山道士有限公司