用于植物中的诱导型表达系统的制作方法

专利名称：用于植物中的诱导型表达系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于植物中的表达系统，特别是一种利用外源性化学药剂作为控制机制的表达系统，和某些化学品作为所述控制剂的用途。
基因表达是通过蛋白编码区域上游(5’)的区域控制的，通常称为“启动子”。启动子可以是组成型的，组织特异性的，发育编程型的或诱导型的。
为了提高性能(如生产率或质量)，农作物的操纵需要植物组织中的外源或外源性基因的表达。因此，这种基因的操纵依赖于方法的有效性，以按照需要控制基因表达；例如，依赖于在植物中有效的适宜启动子的有效性和用途。具有各种不同启动子的选择是有利的，以便对于特定的基因，构建体，细胞，组织，植物或环境可以选择最适宜的启动子。已知一系列启动子在植物中是有效的。
在某些情况中，特别有效的启动子是通过外源性化学诱导物的施用诱导的启动子。在有或没有施用于植物或种子的化学药剂的情况下，这允许将在植物生长和发育的特殊阶段控制特殊基因的表达，例如通过喷雾或使用已知的种子包被技术。有时，这被称为基因“开关”。
在诱导型启动子控制下的基因可能是引起其所期望的性能或表型的基因，或者诱导型启动子可以控制阻抑蛋白的表达，该阻抑蛋白抑制靶基因的表达，例如通过与靶基因的操纵序列上游相互作用以阻止基因的表达(例如在细菌中已知的tet和lac操纵基因/阻抑物系统)。在另一选择中，在诱导型启动子控制下的基因可以表达与另一个蛋白相互反应的蛋白，以抑制其活性，例如在芽孢杆菌RNA酶/芽孢杆菌RNA酶抑制剂系统中，在没有芽孢杆菌RNA酶抑制剂的情况下，芽孢杆菌RNA酶将抑制或杀死细胞。
这种类型的基因开关在若干广泛的应用中是已知的。这些包括可逆的雄性不育的产生，即WO90/08830中举例描述的，在杂交植物生产中高度期望的特征。这种启动子的其它应用包括在种质保护中，其中特殊农作物，特别是转基因植物的防范和自生自长植物的控制是必要的，及在WO94/03619描述的收获前出芽的预防中。
许多生物体具有让它们代谢化学制剂如醇或酮的机理，例如通过醇脱氢酶的生产。这些系统的启动子在基因开关中可能是有益的，因为启动子可以通过靶醇或酮的存在而被诱导。
这样的例子可以在真菌生物体构巢曲霉中找到，仅仅当它在有各种醇或酮的情况下生长时，构巢曲霉表达通过基因alcA编码的醇脱氢酶I(ADHI)。可以通过alcR基因编码的调节蛋白接替诱导并组成型地表达。在有诱导物(醇或酮)的情况下，调节蛋白激活alcA基因的表达。调节蛋白也在有诱导物的情况下刺激它自身的表达。这意味着ADHl酶的高水平是在诱导条件下(即当醇或酮存在时)产生的。相反地，alcA基因和其产物，ADHl，在没有诱导物的情况下是不表达的。alcA的表达和酶的生产在有葡萄糖的情况下是阻抑的。
因而，alcA基因启动子是一种诱导型启动子，是在有诱导物的情况下(即通过蛋白/醇或蛋白/酮的结合)通过alcR调节蛋白激活的。已经克隆和测序了alcR和alcA基因(包括各自的启动子)(Lockington RA et al，1985，Gene，33137-149；Felenbok B et al，1988，Gene，73385-396；Gwynne et al，1987，Gene，51205-216)。
已经在某些植物物种中研究了醇脱氢酶(adh)基因。在玉米或其它谷类中，它们是通过缺氧情况接通的。源自玉米的adh基因的启动子区域包含在缺氧情况下表达所必需的300bp的调节元件。然而，已经发现在任何植物中均没有alcR调节蛋白的等效物。因此，基因调节系统的alcR/alcA类型在植物中是未知的。植物细胞中alcR的组成表达没有导致内源性adh活性的激活。
WO93/21334描述了转基因植物的生产，该植物包括作为基因开关的系统。此文献特别描述了化学-诱导的植物基因表达盒，该盒包含有效连接到调节序列上的第一启动子，该调节序列编码调节蛋白，且诱导型启动子有效地连接到靶基因上，在有有效外源性诱导物的情况下，通过调节蛋白激活诱导型启动子，由此诱导物的施用引起靶基因的表达。特别是，在构建物中利用alcR/alcA系统。应用于这种情况中的外源性化学诱导物包括那些通过Creaser et al.，J.Biochem.(1984)225，449-454描述的，如丁-2-一(乙基甲基酮)，环己酮，丙酮，丁-2-醇，3-氧代丁酸，丙-2-醇和乙醇。
为了农业的目的，醇通常用作外源性化学诱导物。然而，这种化学药剂通常是挥发性的，并因此在农业环境下难以处理，因为大量化学剂可能在喷雾过程中丢失。
本发明提供农用可水解的酯在植物基因表达控制中的用途，所述的控制通过诱导型启动子作用，该诱导型启动子需要激活，即可包含醇的外源性化学药剂的存在，其中所述农用酯的水解导致所述醇的生产。
特别是，农用酯包含式(I)的化合物， 其中R1是低级烷基，低级链烯基或低级炔基，R2是有机基团，这样R2COOH是农用酸。式(I)化合物的水解产生式(II)的醇 此处使用的术语“农用”意为在不引起农作物中植物毒性或土壤损坏的不可接受的水平下，可以将化合物应用于特殊的土壤或农作物情况。
此处使用的表达方式“低级烷基”包括C1-6烷基，优选C1-4烷基，其可以是直链或支链。此处使用的表达方式“低级链烯基”和“低级炔基”分别包括C2-6链烯基和C2-6炔基，优选C2-4链烯基和C2-4炔基，其可以是直链或支链。
将用于本发明的农用酯，如式(I)的那些适宜地转移到靶植物中，其中基因控制系统位于适当的位置和/或在环境条件或有适宜催化部分，如酶或催化性抗体的情况下，在适于提供充足量活化醇的速率下，在所要求的时间内和在植物所需要的部分中水解。这些可以依据所处理植物物种的自然特性，所表达的基因和酯施用的时间而变化。
酯，如式(I)的化合物是有利的，在于它们比相应的醇易于处理。人们已经发现这些化合物可以依据基因激活产生所期望的效果。
应当在所需要的基因激活之前，在充足的时间内施用该化合物，以使水解发生，且依据合理的因素，如需要激活植物生长阶段。如果水解的速率相对较慢，应用的时间可以早一些，以确保在需要基因激活的植物生长阶段有充足的水解发生。有困难时，可以选择更快速水解的酯。
可选择地，可以在单独的处理中，应用具有不同水解速率的一个以上的酯。通过选择具有不同水解速率的酯的结合，可以得到活化醇的有效的“缓慢释放”，以便延长基因表达超过所期望的时期。这意味着可以避免化学药剂的重复应用且“单击(one-shot)”处理是可能的。
式(II)的醇的特殊实施例包括甲醇，乙醇，丙-1-醇，丙-2-醇，丁-2-醇或丁-3-烯-2-醇。
适宜地，式(II)的醇是低级烷醇，其中烷基含有1-4碳原子且可以是支链的，或线性的。R1的优选基团包括乙基，正-丙基和正-丁基。
式(II)化合物特别优选的例子是乙醇。
R2基团的准确特性是不重要的，只要在将其施用于特殊的靶植物时，在适宜的速率下，它产生农用酸即可。可以使用常规方法，例如像G.Mitchell et al.，Pestic.Sci(1995)4449-58描述的，确定水解速率，且优选地使用相对于整个植物系统的测试。在任何具体的例子中什么是适宜的将取决于各种因素，该因素包括受控制的基因表达的特性，基因在其中表达的具体植物和其他外部的条件。水解速率应当是充足的，以允许在化学诱导物应用之后，在适宜的时间看到所期望的效果，例如，可逆的雄性不育。
然而，可以选择R2，这样生成的式(III)的酸 具有某些有益的农用化学作用。特别是，它自身可以充当诱导型启动子的诱导物。例如，人们已经发现许多酸，包括3-羟丁酸，2-羟丁酸，丙酮酸和3-氧代丁酸可以充当alcR/alcA系统(Creaser etal.，supra.)的诱导物。
R2的特殊例子包括任意取代的烷基，任意取代的环烷基，任意取代的链烯基，任意取代的炔基，任意取代的芳基或任意取代的杂环基。
此处使用的术语“烷基”包括直链或支链的烷基链，适宜地，包含最多可达10个碳原子，优选1-6个碳原子。术语“链烯基”和“炔基”包括含有最多可达10个碳原子，优选2-6个碳原子的不饱和直链或支链。术语“芳基”包括苯基和萘基。术语“杂环基”包括含有最多可达10个，优选最多可达7个，最多可达3个的选自氧，硫或氮原子的环。这些环可以是单环或可以是稠环系统的形式，且这些在特性上可以是芳香的或非芳香的。术语“卤”或“卤素”包括氯，氟，溴和碘。术语“烷氧基”涉及与氧原子连接的上面定义的烷基。
适宜地，R2是任意取代的C1-10烷基，其可以是线性的或支链的。优选的烷基R2是线性的且含有3-8个碳原子，特别是5个碳原子。
烷基，链烯基和炔基R2的适宜任意取代包括一种或多种选自卤素，硝基，氰基，氧代，任意取代的芳基，任意取代的杂环基，OR3，C(O)pR3，S(O)mR3，OCOR3，-NR4C(O)pR3，＝NOH，NR5R6，C(O)NR5R6，C(O)NR3NR5R6，-CH＝NOR3，P(O)R7R8或P(O)OR7OR8，NR3CONR5R6，-N＝CR5R6，S(O)mNR5R6or-NR3S(O)mR4，-N＝NR3的基团，其中每个R3，R4，R5，R6，R7和R8单独地选自氢，烷基，链烯基，炔基，芳基或杂环基，其任何一种可以是由官能团任意取代的，且就芳基和杂环基基团来说，可以是由烷基，链烯基或炔基取代的；或R5和R6和与之相连的原子一起，可以另外形成一个环，该环可以是碳环或杂环基；p是1或2，且m是0，1，2或3。
此处使用的术语“官能团”指的是包括卤素，氰基，硝基，氧代，羟基，＝NOR11，C(O)pR11，OR11，s(O)mR11，NR12R13，C(O)NR12R13，OC(O)NR12R13，-CH＝NOR11，-NR12C(O)nR11，-NR11CONR12R13，-N＝CR12R13，S(O)mNR12R13或-NR12S(O)mR11其中R11，R12和R13单独选自氢或任意取代的烃基，或，R12和R13一起形成任意取代的环，该环任意地包含另外的杂原子，如氧和氮或S(O)R14，其中p是1或2的整数，m是0或1-3的整数，且R14是氢或烷基。
烃基R11，R12和R13的适宜任意取代基包括卤素，全卤化烷基如三氟甲基，巯基，羟基，烷氧基，氧代，杂芳氧基，链烯氧基，炔氧基，烷氧基烷氧基，芳氧基(其中芳基可以是由卤素，硝基或羟基取代的)，氰基，硝基，氨基，单-或二-烷氨基，烷酰胺基或S(O)pR14，其中m和R14如上面所定义。
烷基，链烯基或炔基R2上任意取代的例子是一个或多个选自氧代；烷氧基羰基特别是低级烷氧基羰基；氰基；卤素，如氯，氟或溴；用氨基或单-或二烷基氨基或烷基，如甲基任意取代的苯基；OR3，其中R3是用卤素或烷基任意取代的烷基或杂环基；S(O)mR11，其中m为0或2，R11是用烷基任意取代的烷基或苯基；NR5R6或C(O)NR5R6其中R5是氢，甲基或甲氧基乙基，R6是烷基如甲基，苯基或苄茎，其用卤素，如氟或氯，烷基如甲基或三氟甲基或烷氧基羰基任意取代，其中烷基部分可以带有另一烷氧基羰基，或R6是杂环基如用烷基和/或乙酰基任意取代的噻嗪基；-NR4C(O)pR3其中p是2，R3是烷基且R4是用烷氧基羰基如乙氧基羰基烷基任意取代的烷基；-NR3S(O)mR4，其中R3是氢，R4是用卤素，如氯任意取代的苯基，且m是2；C(O)NR3NR5R6，其中R3和R5是氢，且R6是用卤素或烷氧基，如甲氧基任意取代的苯基；S(O)mNR5R6，其中m是2，R5是氢且R6用一个或多个烷氧基羰基任意取代的烷基；杂环基如呋喃基，吡啶基，吡啶基或吡嗪基，三嗪基，其任何一种可以是用烷基，卤素，三卤甲基，苯基，卤苯基，氰基或氧代任意取代的。
烷基，链烯基或炔基R2的特别适宜的取代基包括烷氧基羰基，特另是其中烷氧基是低级烷基；烷氧基且特别是二烷基乙缩醛形式的两个烷氧基；氰基或任意取代的杂环基。优选的取代基包括，但不限制于低级烷氧基羰基和二烷基乙缩醛。当取代烷基与式(I)化合物中的R1相同时，烷氧基羰基和二烷基乙缩醛是特别令人感兴趣的，因为在水解的时候，这些产生更多的式(II)诱导物化学制剂。
R2的特殊芳基是苯基。
环烷基，芳基和杂环基R2和上述烷基，链烯基或炔基R2上的芳基或杂环基的合适的任意取代基包括卤素；卤烷基；氰基；硝基，氨基或单-或二-烷基氨基；羟基；烷氧基，硫代烷基，烷基或烷氧基羰基，其中这些任意的烷基部分可以是用，例如一个或多个选自卤素，烷氧基，氰基，烷氧基羰基，氨基，单-或二-烷基氨基，芳基或羧酸酯或其盐或酯；环烷基；或杂环基的基团任意取代的。
芳基或杂环基R2的特别合适的取代基包括烷氧基，特别是低级烷氧基，如甲氧基，烷基，特别是低级烷基，烷氧基羰基，特别是低级烷氧基羰基和卤素。
式(I)化合物的特殊亚基是式(IA)的化合物 其中R1按照上面相对于式(I)定义的，n是2-4的整数，且R10是烷基，链烯基或炔基，其任何一种可以任意地用杂原子，环烷基，杂环基或芳基插入，或R10是化合价为n的环烷基或芳基。
特别是，R10是化合价为n的烷基或芳基。
式(I)特别优选的化合物包括2-正-戊基-3-氧代丁酸乙酯(第49号化合物)；2-羧基庚-1，7-二酸(dioate)三乙酯(第53号化合物)；和2，4-二甲氧基苯甲酸乙酯(第60号化合物)。
式(I)化合物的例子是乙基酯，在表1中列出。
表1 式(I)化合物或者是已知的化合物，可以使用常规方法从已知化合物制备它们。
式(I)化合物可能在靶植物中化学水解，或者通过靶植物中天然存在的酶，或者通过基因工程技术引入，并在植物内表达的酶，或通过合适的催化抗体或通过基因工程技术引入植物中，并在植物内表达的酶促水解催化性抗体的催化活性部分。
适宜的酶包括，但不限制于，酯酶和脂酶。
使用标准技术，可以从四面体酯水解转变状态的类似物产生适宜的催化性抗体，例如，使用适宜的磷酸酯时，对于氯霉素前体-药物酯的水解Ole K et al.，1998，J.Mol.Biol.，281501-511，对于可卡因的解毒，使用甲基酯的水解，Mets B etal.，1998，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，9510176-10181。
人们已经进一步研究了本发明化合物的代谢作用，这些研究的结果在以下的实施例中公开。不限制于机制的理由，相信例如本发明的代表性化合物，化合物53，是根据下列的流程图代谢的 此代谢的产物是乙醇，其可以充当上面描述的化学诱导物。
在另一方面中，本发明提供一种控制植物中靶基因表达的方法，其中所述的植物是用化学-诱导的植物基因表达盒转化的，该盒包含有效连接到调节序列上的第一启动子，该调节序列编码调节蛋白，且诱导型启动子有效地连接到靶基因上，该诱导型启动子是在有醇，如上面定义的式(II)化合物的情况下，通过调节蛋白激活的，所述的方法包含将酯应用于所述植物，该酯水解，形成所述的醇，如上面定义的式(I)化合物，以引起靶基因的表达。
适宜地，如上面所描述的，调节序列编码alcR蛋白，且诱导型启动子是alcA启动子序列。
在需要或期望的地方，还可以转化植物，这样它表达或超表达酶或催化性抗体或它的催化活性片段，其水解式(I)的化合物以形成式(II)化合物。
在某些情况中，优选必须将那些在没有酶或其它部分的情况下为非活性的酶被工程化到植物中，因为它们仅仅在靶转化种子中有效力。
可以将编码水解酶，抗体或抗体片段的核酸序列包括在构建体中，该构建体包含有效连接到诱导型启动子上的调节蛋白和/或靶基因，或它们可能存在于用于共-转化植物的独立的构建体上。然而这种系统是新的。
因而，在另一个方面中，提供一种植物基因表达系统，包含(i)有效连接到调节序列上的第一启动子，该调节序列编码调节蛋白，(ii)有效连接到靶基因上的诱导型启动子，该诱导型启动子是在有前面定义的式(I)有效外源性诱导物的情况下，通过调节蛋白激活的，借此诱导物的施用引起靶基因的表达；和(iii)编码蛋白的序列，该蛋白在另一启动子的控制下影响酯，如式(I)化合物水解为相应的醇，该另一启动子允许其在植物组织中的表达。
靶基因可以包含任何需要引入植物中的基因，以便如上所述修饰它的特性。靶基因可以是外源性植物基因或外源基因，且可以是单一基因或一系列基因。靶基因序列编码至少部分功能蛋白或反义序列。
可以使用任何适宜于靶植物或植物细胞的转化方法，包括用含有重组Ti质粒的根瘤土壤杆菌感染，电穿孔，细胞和原生质体的微量注射，微粒转化和花粉管转化。然后，转化的细胞可以在适宜的情况中，再生到整个植物中，在整个植物中，新的细胞核材料稳定地结合到基因组中。可以用这种方法得到转化的单子叶和双子叶植物。
可以生产的基因修饰植物的实施例包括农作物，谷类，水果和蔬菜如canola，向日葵，烟草，甜菜，棉花，大豆，玉米，小麦，大麦，稻米，高粱，番茄，芒果，桃，苹果，梨，草莓，香蕉，甜瓜，马铃薯，胡萝卜，生菜，卷心菜，洋葱。
本发明进一步提供包含本发明基因表达系统的植物细胞。该基因表达系统可以通过转化稳定地结合到植物基因组中。本发明还提供包含这种细胞的植物组织或植物，和从其衍生的植物或种子。
此方法中所使用的式(I)化合物的优选实施例是上面描述的那些。
本发明农用酯，如式(I)化合物适宜以农用组合物，与稀释剂或载体组合的形式应用。这种组合物形成本发明的又一方面。
制剂中农用酯的浓度优选大约5％wt/wt或更少的浓度。在大约2％-5％wt/wt的浓度时是优选的。
适宜的载体或稀释剂对于技术人员来说是显而易见的，并将依据所使用式(I)化合物的特殊特性而变化。例如，如果式(I)化合物是油类，它可能需要乳化剂的存在以便使它雾化在水溶液中。在本领域中乳化剂是熟知的，特殊的例子是部分水解的聚乙酸乙烯酯(PVA)或吐温TM。
有机溶剂或稀释剂，如丙酮也可以存在。
因此，优选的组合物包含农用酯，如式(I)的化合物，乳化剂，如PVA和稀释剂，如水。组分的相对量在相当大的程度上取决于各种组分相互之间的混溶性。然而适宜地，在组合物中存在的乳化剂的量为1-5％w/w，优选大约2.5％w/w。
因而，本发明制剂的实施例包括下列制剂11.5％本发明化合物(例如化合物53)2.5％PVA余量的水制剂21.5％本发明化合物(例如化合物53)5％丙酮0.05％吐温-20TM余量的水制剂33.0％本发明化合物(例如化合物53)2.5％PVA余量的水制剂43.0％本发明化合物(例如化合物53)
5％丙酮/水0.05％吐温-20TM余量的水可能使用的可选择组合物与在我们的与此有关的英国专利申请第9902236.0中描述的那些相似。特别是，该组合物将包含组分(a)农用酯，如式(I)的化合物；(b)聚乙氧基化的C10-C20醇或三硅氧烷聚乙氧基化物和(c)稀释剂。
稀释剂(c)可以是，例如，水。
上述制剂的组分(b)优选，聚乙氧基化的油醇，月桂醇，硬脂醇或鲸蜡醇。
更优选含有0-35，更优选2-20的平均摩尔环氧乙烷含量的聚氧化乙烯-油醇。最优选聚氧化乙烯-(2)-油醇，氧化乙烯-(10)-油醇或氧化乙烯-(20)-油醇。组分(b)，然而，优选聚氧化乙烯-(20)-油醇(括号中的数字表示每分子的平均氧化乙烯含量)。商业上使用的这种产品为BRIJ92TM，BRIJ97TM和BRIJ98TM。
优选地，制剂中的组分(b)为大约0.5％wt/wt或更小的浓度。优选大约0.2％wt/wt-0.5％wt/wt的浓度。
在可选择实施方案中，制剂包括组分(b)，氢或甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物。特别是，组分(b)是甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物。该甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物每分子优选含有4-12，最优选8的平均摩尔氧化乙烯含量。商业上应用的这种产品是SILWET 77TM(SIL WET是Witco的商标)。
优选地，甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物为大约0.5％wt/wt或更小的浓度。优选大约0.2％wt/wt-0.5％wt/wt的浓度。
制剂中的组分(c)优选90％-98％wt/wt的浓度。
可以包括在本制剂中的其它添加剂包括分散剂，抗菌化合物，也可以加入润湿剂化合物和抗-蒸发剂。
现在，通过实施例特殊描述本发明。
实施例1在土壤生长植物上测试化学制剂在预筛选hydroponiv溶液之后，将化合物用于本测试中，该测试是在暖房的1 1/2”盆中，在4星期大的alccat烟草纯合系的30种植物上进行的。将叶子的样品从植物上摘下来作为“未诱导”的对照。在200μl250mM Tris pH8.0中粉碎叶片，离心并回收上清液，在4℃过夜贮存。化合物溶解在含0.05％吐温-20的50％丙酮，50％dH2O200mg/ml溶液，然后以1/10稀释以配制2％的溶液。除非有其它规定，将5ml溶液施用于作为根浸液一式两份处理的每2种植物的土壤中。22和44小时之后，除去叶子的样品，按照上述提取并在4℃贮存上清液。通过使用Boehringer Mannheim CAT ELISA试剂盒分析样品的cat蛋白定量，并通过Bradford测定确定总蛋白水平。结果在表2中列出，其中1CAT值等于0-5000ng/g的检出，2等于5001-10,000ng/g的检出，3等于10,001-15,000ng/g。
实施例2土壤生长植物的另一处理在这个实验中，化合物溶解在含0.05％吐温-20的50％丙酮，50％dH2O中形成200mg/ml溶液。将这些稀释成1.5％和0.1％的溶液。从幼苗上摘下叶子的样品作为“未诱导”的对照。在200μl 250mM TrispH8.0中粉碎叶片，离心，回收上清液并在4℃过夜贮存。将5ml溶液应用于作为根浸液一式两份处理的每2种植物的土壤中。22和65小时之后，从所处理的每两种植物中除去叶子的样品，按照实施例1中的描述提取，并在4℃贮存上清液。通过使用Boehringer MannheimCAT ELISA试剂盒分析样品的分解代谢蛋白定量，并通过Bradford测定确定总蛋白水平。所测试的化合物和结果在表3中列出，其中CAT值代表的值在表2中列出。
表3
实施例3诱导之后开关表达的时间进程的确定为了确定在酯诱导之后，alc开关表达的时间进程，将若干化合物施用于暖房1 1/2pots中的5星期大的alccat烟草纯合系30株植物的叶片或土壤上。将化合物溶解在含0.05％吐温-20的50％丙酮，50％dH2O中以形成150mg/ml或50mg/ml溶液。然后以1/10稀释形成1.5％或0.5％的溶液。从幼苗上摘下叶子的样品作为“未诱导”的对照。在干冰/乙醇中冷冻叶片，并在-70℃贮存。施用5ml溶液作为根浸液或叶喷雾剂，至8株植物。在各时间点除去叶的样品，并在干冰/乙醇中冷冻，在-70℃贮存。当收获和贮存所有的样品后，在200μl250mM Tris pH8.0中提取叶片，离心，回收上清液并在4℃过夜贮存。通过使用Boehringer Mannheim CAT ELISA试剂盒分析样品的cat蛋白定量，并通过Bradford测定确定总蛋白水平。所测试的化合物和结果在表4，5，6，7，8，9和10中列出。CAT单位在上面的实施例1中列出，每个连续的数字代表递增的5,000ng/g的范围。以阴影形式表示的结果是在不同批次，但是同样的试验中获得的。
表4
表5
表6
表7
表8
表9
表10
这些结果显示，与醇对照，可以通过使用本发明的酯改变诱导的时间进程。因此，酯的适宜选择将引起有利的诱导形式。
权利要求
1.农用可水解的酯在植物基因表达控制中的用途，所述的控制通过诱导型启动子完成，该诱导型启动子需要在可包含醇的外源性化学药剂的存在下激活，其中所述农用酯的水解导致所述醇的产生。
2.根据权利要求1的用途，其中农用可水解的酯是式(I)的化合物 其中R1是低级烷基，R2是有机基团，其可以在水解的时候，产生化学式为R2COOH的农用酸；且所述的启动子需要式(II)醇的存在以用于它的激活。
3.根据权利要求2的用途，其中的式(II)化合物是低级烷醇，其中的烷基R1含1-4个碳原子且可以是支链的，或线性的。
4.根据权利要求2或权利要求3的用途，其中R2是任意取代的烷基，任意取代的环烷基，任意取代的链烯基，任意取代的炔基，任意取代的芳基或任意取代的杂环基。
5.根据权利要求4的用途，其中R2是任意取代的C1-10烷基。
6.根据权利要求5的用途，其中R2是用烷氧基羰基或二烷基乙缩醛取代的。
7.根据前述任何一项权利要求的用途，其中式(I)化合物是2-正-戊基-3-氧代丁酸乙酯；2-羧基庚-1，7-二酸三乙酯；或2，4-二甲氧基苯甲酸乙酯。
8.一种控制植物中靶基因表达的方法，其中所述的植物是用化学-诱导的植物基因表达盒转化的，该盒包含有效连接到调节序列上的第一启动子，所述调节序列编码调节蛋白以及有效地连接到靶基因上的诱导型启动子，该诱导型启动子在有醇的情况下通过调节蛋白激活，所述的方法包含将农用可水解的酯施用于所述植物，该酯水解的时候产生所述的醇，以便引起靶基因的表达。
9.根据权利要求8的方法，其中的调节序列像前面描述的那样编码alcR蛋白，且诱导型启动子是alcA启动子序列。
10.根据权利要求8或权利要求9的方法，其中转化植物，以便它表达或超表达酶或催化性抗体或其催化活性片段，其可水解的酯以形成所述的醇。
11.一种植物基因表达系统，包含(i)有效连接到调节序列上的第一启动子，该调节序列编码调节蛋白，(ii)有效连接到靶基因上的诱导型启动子，在有前面定义的有效外源性诱导物醇的情况下，通过调节蛋白激活诱导型启动子，借此醇的施用引起靶基因的表达；和(iii)编码蛋白的序列，该蛋白在另一启动子的控制下，完成上述酯的水解，该另一启动子允许其在植物组织中的表达。
12.一种包含权利要求11的基因表达系统的植物细胞。
13.包含权利要求12的细胞的植物组织或植物，和从其衍生的植物或种子。
14.一种农业组合物，包含与稀释剂或载体组合的权利要求1定义的农用酯。
15.根据权利要求14的组合物，其中农用酯是权利要求2中定义的式(I)化合物。
16.根据权利要求14或权利要求15的组合物，其进一步包含乳化剂。
17.根据权利要求16的组合物，其中的乳化剂是PVA。
全文摘要
农用可水解的酯,如式(I)的化合物在植物基因表达控制中的用途,其中在申请中定义了式(I)化合物中的R
文档编号A01N37/02GK1338000SQ99815969
公开日2002年2月27日 申请日期1999年12月22日 优先权日1999年2月1日
发明者E·D·克拉克, E·J·T·克里斯塔, I·杰普森, J·A·M·派尼 申请人:辛甄塔有限公司