B所描述的），其均可以实 现本发明的方法和/或用途，即通过斜纹夜蛾害虫至少与Cry2Ab蛋白接触以实现控制斜纹 夜蛾害虫的方法和/或用途。本领域技术人员所理解的，使上述转基因事件中的Cry2Ab蛋 白在不同植物中表达亦能实现本发明的方法和/或用途。更具体地，所述Cry2Ab蛋白存在 于至少产生所述Cry2Ab蛋白的转基因植物中，所述斜纹夜蛾害虫通过摄食所述转基因植 物的组织至少与所述Cry2Ab蛋白接触，接触后所述斜纹夜蛾害虫生长受到抑制和/或导致 死亡，以实现对斜纹夜蛾危害植物的控制。
[0056] 本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子、增强子、前导序列、 内含子以及其它可操作地连接到所述Cry2Ab蛋白的调节序列。
[0057] 所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的"植物中可表达的启动子"是指确保 与其连接的编码序列在植物细胞内进行表达的启动子。植物中可表达的启动子可为组成型 启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于，来源于花椰菜花叶病毒的 35S启动子、玉米Ubi启动子、水稻GOS2基因的启动子等。备选地，植物中可表达的启动子 可为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的 表达水平高于植物的其他组织（可通过常规RNA试验进行测定），如PEP羧化酶启动子。备 选地，植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表 达模式的启动子是指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时，启动子调控下的编码序 列的表达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于，马铃薯和 西红柿的蛋白酶抑制基因（pinI和pinII)和玉米蛋白酶抑制基因（MPI)的启动子。
[0058] 所述转运肽（又称分泌信号序列或导向序列）是指导转基因产物到特定的细胞器 或细胞区室，对受体蛋白质来说，所述转运肽可以是异源的，例如，利用编码叶绿体转运肽 序列靶向叶绿体，或者利用'KDEL'保留序列靶向内质网，或者利用大麦植物凝集素基因的 CTPP靶向液泡。
[0059] 所述前导序列包含但不限于，小RNA病毒前导序列，如EMCV前导序列（脑心肌炎 病毒5'非编码区）；马铃薯Y病毒组前导序列，如MDMV(玉米矮缩花叶病毒）前导序列；人 类免疫球蛋白质重链结合蛋白质（BiP);苜蓿花叶病毒的外壳蛋白质mRNA的不翻译前导序 列（AMVRNA4);烟草花叶病毒（TMV)前导序列。
[0060] 所述增强子包含但不限于，花椰菜花叶病毒（CaMV)增强子、玄参花叶病毒（FMV) 增强子、康乃馨风化环病毒（CERV)增强子、木薯脉花叶病毒（CsVMV)增强子、紫茉莉花叶病 毒（MMV)增强子、夜香树黄化曲叶病毒（CmYLCV)增强子、木尔坦棉花曲叶病毒（CLCuMV)、鸭 跖草黄斑驳病毒（CoYMV)和花生褪绿线条花叶病毒（PCLSV)增强子。
[0061] 对于单子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，玉米hsp70内含子、玉米泛 素内含子、Adh内含子1、蔗糖合酶内含子或水稻Actl内含子。对于双子叶植物应用而言， 所述内含子包含但不限于，CAT-1内含子、pKANNIBAL内含子、PIV2内含子和"超级泛素"内 含子。
[0062] 所述终止子可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，包括但不限 于，来源于农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)胭脂碱合成酶（N0S)基因的多聚腺苷酸 化信号序列、来源于蛋白酶抑制剂II(pinII)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于豌豆 ssRUBISCOE9基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于a-微管蛋白（a-tubulin)基因的 多聚腺苷酸化信号序列。
[0063] 本发明中所述"有效连接"表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对 相连序列来说需要的功能。在本发明中所述"有效连接"可以为将启动子与感兴趣的序列 相连，使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并 且想要获得该蛋白的表达时"有效连接"表示：启动子与所述序列相连，相连的方式使得得 到的转录物高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋 白的表达时，制造这样的连接，使得得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起 始密码子。备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的 表达时，制造这样的连接，使得5'非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连 结，并且连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合 读码框的。可以"有效连接"的核酸序列包括但不限于：提供基因表达功能的序列（即基因 表达元件，例如启动子、5'非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3'非翻译区域、聚腺苷化位 点和/或转录终止子）、提供DNA转移和/或整合功能的序列（即T-DNA边界序列、位点特 异性重组酶识别位点、整合酶识别位点）、提供选择性功能的序列（即抗生素抗性标记物、 生物合成基因）、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列（即多接 头序列、位点特异性重组序列）和提供复制功能的序列（即细菌的复制起点、自主复制序 列、着丝粒序列）。
[0064] 本发明中所述的"杀虫"或"抗虫"是指对农作物害虫是有毒的，从而实现"控制" 和/或"防治"农作物害虫。优选地，所述"杀虫"或"抗虫"是指杀死农作物害虫。更具体 地，目标昆虫是斜纹夜蛾害虫。
[0065] 本发明中Cry2Ab蛋白对斜纹夜蛾害虫具有毒性。本发明中的植物，特别是玉米和 大豆，在其基因组中含有外源DNA，所述外源DNA包含编码Cry2Ab蛋白的核苷酸序列，斜纹 夜蛾害虫通过摄食植物组织与该蛋白接触，接触后斜纹夜蛾害虫生长受到抑制和/或导致 死亡。抑制是指致死或亚致死。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以 用于产物的消耗和/或生成。此外，该植物可基本消除对化学或生物杀虫剂的需要（所述 化学或生物杀虫剂为针对Cry2Ab蛋白所靶向的斜纹夜蛾害虫的杀虫剂）。
[0066] 植物材料中杀虫晶体蛋白（ICP)的表达水平可通过本领域内所描述的多种方法 进行检测，例如通过应用特异引物对组织内产生的编码杀虫蛋白质的mRNA进行定量，或直 接特异性检测产生的杀虫蛋白质的量。
[0067]可以应用不同的试验测定植物中ICP的杀虫效果。本发明中目标昆虫主要为斜纹 夜蛾。
[0068]本发明中，所述Cry2Ab蛋白可以具有序列表中SEQIDNO:l所示的氨基酸序列。 除了包含Cry2Ab蛋白的编码区外，也可包含其他元件，例如编码选择性标记的蛋白质。
[0069]此外，包含编码本发明Cry2Ab蛋白的核苷酸序列的表达盒在植物中还可以与至 少一种编码除草剂抗性基因的蛋白质一起表达，所述除草剂抗性基因包括但不限于，草胺 膦抗性基因（如bar基因、pat基因）、苯敌草抗性基因（如pmph基因）、草甘膦抗性基因 (如EPSPS基因）、溴苯腈（bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、对除草剂茅草枯的抗 性基因、对氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制剂（如PPT)的抗性基因，从而获得既具 有高杀虫活性、又具有除草剂抗性的转基因植物。
[0070]本发明中，将外源DNA导入植物，如将编码所述Cry2Ab蛋白的基因或表达盒或重 组载体导入植物细胞，常规的转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、 直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。
[0071]本发明提供了一种杀虫蛋白的用途，具有以下优点：
[0072] 1、内因防治。现有技术主要是通过外部作用即外因来控制斜纹夜蛾害虫的危害， 如农业防治、化学防治和物理防治；而本发明是通过植物体内产生能够杀死斜纹夜蛾的 Cry2Ab蛋白来控制斜纹夜蛾害虫的，即通过内因来防治。
[0073]2、无污染、无残留。现有技术使用的化学防治方法虽然对控制斜纹夜蛾害虫的危 害起到了一定作用，但同时也对人、畜和农田生态系统带来了污染、破坏和残留；使用本发 明控制斜纹夜蛾害虫的方法，可以消除上述不良后果。
[0074]3、全生育期防治。现有技术使用的控制斜纹夜蛾害虫的方法都是阶段性的，而本 发明是对植物进行全生育期的保护，转基因植物（Cry2Ab蛋白）从发芽、生长，一直到开花、 结果，都可以避免遭受斜纹夜蛾的侵害。
[0075] 4、全植株防治。现有技术使用的控制斜纹夜蛾害虫的方法大多是局部性的，如叶 面喷施；而本发明是对整个植株进行保护，如转基因植物（Cry2Ab蛋白）的叶片、茎杆、果 实、雄穗、雌穗、花蕾、花药或花丝等都是可以抵抗斜纹夜蛾侵害的。
[0076]5、效果稳定。现有技术使用的无论是农业防治方法还是物理防治方法都需要利用 环境条件对害虫进行防治，可变因素较多；本发明是使所述Cry2Ab蛋白在植物体内进行表 达，有效地避免了环境条件不稳定的缺陷，且本发明转基因植物（Cry2Ab蛋白）的防治效果 在不同地点、不同时间、不同遗传背景也都是稳定一致的。
[0077]6、简单、方便、经济。现有技术使用的物理防治方法在农业生产操作上具有一定的 难度；本发明只需种植能够表达Cry2Ab蛋白的转基因植物即可，而不需要采用其它措施， 从而节省了大量人力、物力和财力。
[0078]7、效果彻底。现有技术使用的控制斜纹夜蛾害虫的方法，其效果是不彻底的，只起 到减轻作用；而本发明转基因植物（Cry2Ab蛋白）可以造成初孵斜纹夜蛾幼虫的大量死亡， 且对小部分存活幼虫发育进度造成极大的抑制，3天后幼虫基本仍处于初孵状态或介于初 孵-阴性对照状态之间，这种被严重抑制发育的害虫在自然条件下是无法继续存活并危害 的，而转基因植物大体上只受到轻微损伤。
[0079]下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
【附图说明】
[0080] 图1为本发明杀虫蛋白的用途的含有Cry2Ab核苷酸序列的重组克隆载体DBN01-T 构建流程图；
[0081] 图2为本发明杀虫蛋白的用途的含有Cry2Ab核苷酸序列的重组表达载体 DBN100033构建流程图；
[0082]图3为本发明杀虫蛋白的用途的转基因玉米植株接种斜纹夜蛾的叶片损伤图；
[0083]图4为本发明杀虫蛋白的用途的转基因大豆植株接种斜纹夜蛾的叶片损伤图。
【具体实施方式】
[0084] 下面通过具体实施例进一步说明本发明杀虫蛋白的用途的技术方案。
[0085] 第一实施例、基因的获得和合成
[0086] 1、获得核苷酸序列
[0087] Cry2Ab杀虫蛋白质的氨基酸序列（634个氨基酸），如序列表中SEQIDNO:l所 示；编码相应于所述Cry2Ab杀虫蛋白质的氨基酸序列的Cry2Ab核苷酸序列（1905个核苷 酸），如序列表中SEQIDNO:2所示。
[0088]CrylFa杀虫蛋白质的氨基酸序列（605个氨基酸），如序列表中SEQIDNO:3所 示；编码相应于所述CrylFa杀虫蛋白质的氨基酸序列的CrylFa核苷酸序列（1818个核苷 酸），如序列表中SEQIDN0:4所示。
[0089] 2、合成上述核苷酸序列
[0090] 所述Cry2Ab核苷酸序列（如序列表中SEQIDNO: 2所示）和所述C