rylFa核苷酸 序列（如序列表中SEQIDN0:4所示）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所述 Cry2Ab核苷酸序列（SEQIDN0:2)的5'端还连接有Ncol酶切位点，所述Cry2Ab核苷酸序 列（SEQIDNO: 2)的3'端还连接有Spel酶切位点；合成的所述CrylFa核苷酸序列（SEQ IDNO:4)的5'端还连接有AscI酶切位点，所述CrylFa核苷酸序列（SEQIDNO:4)的3' 端还连接有BamHI酶切位点。
[0091] 第二实施例、重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌
[0092] 1、构建含有Cry2Ab基因的重组克隆载体
[0093] 将合成的Cry2Ab核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T(Promega，Madison，USA，CAT: A3600)上，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T载体说明书进行，得到重组克隆载体 DBN01-T，其构建流程如图1所示（其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；fl表示噬菌体fl 的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；17为I7RNA聚合酶启 动子；Cry2Ab为Cry2Ab核苷酸序列（SEQIDN0:2) ;MCS为多克隆位点）。
[0094]然后将重组克隆载体DBN01-T用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞 (Transgen，Beijing，China，CAT:CD501)，其热激条件为：50y1 大肠杆菌T1 感受态 细胞、10yl质粒DNA(重组克隆载体DBN01-T)，42°C水浴30秒；37。。振荡培养1小 时（lOOrprn转速下摇床摇动），在表面涂有IPTG(异丙基硫代-0-D-半乳糖苷）和 X-gal(5-溴-4-氯-3-H引噪-13 -D-半乳糖苷）的氨节青霉素（100晕克/升）的LB平板 (胰蛋白胨l〇g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7. 5)上生长 过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，氨 苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7. 5)中于温度37°C条件下培养过夜。碱法提取其质粒： 将菌液在12000rpm转速下离心lmin，去上清液，沉淀菌体用100y1冰预冷的溶液I(25mM Tris-HCl，10mMEDTA(乙二胺四乙酸），50mM葡萄糖，pH8. 0)悬浮；加入200y1新配制的溶 液II(0. 2MNaOH，1 %SDS(十二烷基硫酸钠）），将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min;加 入150y1冰冷的溶液III(3M醋酸钾，5M醋酸），立即充分混勾，冰上放置5-10min;于温度 4°C、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置 5111；[11;于温度4 <€、转速12000印1]1条件下离心5111；[11，弃上清液，沉淀用浓度（￥/'\0为70%的 乙醇洗涤后晾干；加入 30y1 含RNase(20yg/ml)的TE(10mMTris-HCl，ImMEDTA，pH8. 0) 溶解沉淀；于温度37°C下水浴30min，消化RNA;于温度-20°C保存备用。
[0095] 提取的质粒经EcoRI和Xhol酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重 组克隆载体DBN01-T中插入的所述Cry2Ab核苷酸序列为序列表中SEQIDN0:2所示的核 苷酸序列，即Cry2Ab核苷酸序列正确插入。
[0096] 按照上述构建重组克隆载体DBN01-T的方法，将合成的所述CrylFa核苷酸序列 连入克隆载体pGEM-T上，得到重组克隆载体DBN02-T，其中，CrylFa为CrylFa核苷酸序列 (SEQIDN0:4)。酶切和测序验证重组克隆载体DBN02-T中所述CrylFa核苷酸序列正确插 入。
[0097] 2、构建含有Cry2Ab基因的重组表达载体
[0098] 用限制性内切酶Ncol和Spel分别酶切重组克隆载体DBN01-T和表达载体 DBNBC-01 (载体骨架：pCAMBIA2301 (CAMBIA机构可以提供）），将切下的Cry2Ab核苷酸序列 片段插到表达载体DBNBC-01的Ncol和Spel位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是 本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN100033,其构建流程如图2所示（Kan: 卡那霉素基因；RB:右边界；CaMV35S:花椰菜花叶病毒35S基因启动子（SEQIDN0:5); Cry2Ab:Cry2Ab核苷酸序列（SEQIDN0:2);N〇S:胭脂碱合成酶基因的终止子（SEQID N0:6) ;Hpt:潮霉素磷酸转移酶基因（SEQIDN0:7) ;LB:左边界）。
[0099] 将重组表达载体DBN100033用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激条 件为：50y 1大肠杆菌T1感受态细胞、10y 1质粒DNA(重组表达载体DBN100033)，42°C 水浴30秒；37°C振荡培养1小时（lOOrprn转速下摇床摇动）；然后在含50mg/L卡那霉素 (Kanamycin)的LB固体平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L， 用NaOH调pH至7. 5)上于温度37°C条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基 (胰蛋白胨l〇g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7. 5) 中于温度37°C条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶Ncol和 Spel酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN100033在Ncol 和Spel位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:2所示核苷酸序列，即Cry2Ab核苷酸 序列。
[0100] 按照上述构建重组表达载体DBN100033的方法，将Ncol和SpeI、AscI和BamHI分 别酶切重组克隆载体DBN01-T和DBN02-T切下的所述Cry2Ab核苷酸序列和CrylFa核苷酸 序列插入表达载体DBNBC-01，得到重组表达载体DBN100076。酶切和测序验证重组表达载 体08附00076中的核苷酸序列含有为序列表中5￡〇10勵 :2和5￡〇10勵:4所示核苷酸序 列，即Cry2Ab核苷酸序列和CrylFa核苷酸序列，所述Cry2Ab核苷酸序列和所述CrylFa核 苷酸序列可以连接所述CaMV35S启动子和Nos终止子。
[0101] 3、重组表达载体转化农杆菌
[0102] 对己经构建正确的重组表达载体DBN100033和DBN100076用液氮法转化到农杆 菌LBA4404(Invitrgen，Chicago,USA，CAT: 18313-015)中，其转化条件为：100yL农杆菌 LBA4404、3yL质粒DNA(重组表达载体）；置于液氮中10分钟，37°C温水浴10分钟；将转化 后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28°C、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于 含50mg/L的利福平（Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素（Kanamycin)的LB平板上直至 长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶Ahdl和Xhol对重组表达 载体DBN100033和DBN100076酶切后进行酶切验证，结果表明重组表达载体DBN100033和 DBN100076结构完全正确。
[0103] 第三实施例、转基因植株的获得
[0104] 1、获得转基因玉米植株
[0105] 按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的玉米品种综31 (Z31)的幼胚与第二 实施例中3所述的农杆菌共培养，以将第二实施例中2构建的重组表达载体DBN100033和 DBN100076中的T-DNA(包括CaMV35S基因的启动子序列、Cry2Ab核苷酸序列、CrylFa核苷 酸序列、Hpt基因和Nos终止子序列）转入到玉米染色体组中，获得了转入Cry2Ab核苷酸 序列的玉米植株和转入Cry2Ab-CrylFa核苷酸序列的玉米植株；同时以野生型玉米植株作 为对照。
[0106] 对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚，用农杆菌悬浮 液接触幼胚，其中农杆菌能够将Cry2Ab核苷酸序列和/或Cry2Ab-CrylFa核苷酸序列传递 至幼胚之一的至少一个细胞（步骤1 :侵染步骤），在此步骤中，幼胚优选地浸入农杆菌悬浮 液（0D66Q= 0? 4-0. 6,侵染培养基（MS盐4. 3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖68. 5g/L、 葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮（AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D)lmg/L，pH5. 3))中以启 动接种。幼胚与农杆菌共培养一段时期（3天）（步骤2 :共培养步骤）。优选地，幼胚在侵 染步骤后在固体培养基（MS盐4. 3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/ L、乙酰丁香酮（AS)100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D)lmg/L、琼脂 8g/L，pH5.8)上培养。 在此共培养阶段后，可以有一个选择性的"恢复"步骤。在"恢复"步骤中，恢复培养基（MS 盐4. 3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2, 4-二氯苯氧乙酸（2, 4-D)lmg/L、植物 凝胶3g/L，pH5. 8)中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素（头孢霉素），不添加植 物转化体的选择剂（步骤3 :恢复步骤）。优选地，幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培 养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的幼胚在含选择剂（潮霉 素）的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织（步骤4:选择步骤）。优选地，幼胚在 有选择剂的筛选固体培养基（MS盐4. 3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、潮霉素 50mg/L、2, 4-二氯苯氧乙酸（2, 4-D)lmg/L、植物凝胶3g/L，pH5. 8)上培养，导致转化的细胞 选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物（步骤5:再生步骤），优选地，在含选择剂的培养 基上生长的愈伤组织在固体培养基（MS分化培养基和MS生根培养基）上培养以再生植物。
[0107] 筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基（MS盐4. 3g/L、MS维他命、 干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、潮霉素50mg/L、植物凝胶3g/L，pH5. 8) 上，25°C下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基（MS盐2. 15g/L、MS维他 命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸lmg/L、植物凝胶3g/L，pH5. 8)上，25°C下培 养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于28°C下培养16小时，再于20°C下 培养8小时。
[0108] 2、获得转基因大豆植株
[0109] 按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的大豆品种中黄13的子叶节组织与 第二实施例中3所述的农杆菌共培养，以将第二实施例中2构建的重组表达载体DBN100033 和DBN100076中的T-DNA(包括CaMV35S启动子序列、Cry2Ab核苷酸序列、CrylFa核苷酸序 列、Hpt基因和Nos终止子序