先被人工粉碎成40-60目的颗粒物，之后 将腐殖土、干苔藓和珍珠岩按比例混合后，在常温下放置5-7天，每天喷一次水同时进行一 次常规搅拌，喷水量为50-100ml/kg基质，之后成为培养完整试管苗的基质，其中，本发明 所述基质能为试管苗提供必要的营养，使通城虎试管苗生长良好，成活率高。
[0086] 野生的通城虎常生于山谷林下灌丛中和山地石隙中，生境要求较为严格，苔藓多 出现在通城虎的生长环境中，为通城虎的生长和攀爬提供一定的营养，并改善其生长的土 壤环境，本发明所提供的基质中添加一定的干苔藓并在使用前做一些前期处理，使干苔藓 中的营养成分更好的溶出在腐殖土中，为通城虎的试管苗的生长提供更接近于自然的生长 环境，使得通城虎的试管苗生长旺盛，提高成活率，以及更好的保持野生通城虎的营养组 成，保持它的药用价值。所述诱导培养基、所述分化培养基、所述壮苗培养基和所述生根培 养基中均含有4. 5g/L的琼脂和25g/L蔗糖，且pH值均为5. 8。
[0087] 在实际的大规模生产中，一般会在上述的实例1-3中，步骤四还可以包括以下步 骤：将所述试管苗接种于继代培养基中进行继代培养，其中，所述继代培养基中含有MS+KT 0? 1-0. 5mg/L+6-BA 0? 2-1. Omg/L+NAA 0? 2-1. 0mg/L、4. 5g/L 的琼脂和 25g/L 蔗糖，培养条 件为：温度24-26°C，光照强度20001ux，继代培养基的pH值为5. 8。
[0088] 在上述方案中，将试管苗接种于继代培养基中进行继代培养，在保证通城虎品质 的同时适应大规模生产的需要。
[0089] 下表1为上述的实例1-3的相关数据
[0090]
【主权项】
1. 一种应用通城虎叶片进行快速繁殖的方法，包括以下步骤： 步骤一、制备通城虎无菌外植体； 步骤二、愈伤组织诱导：将无菌外植体去掉叶脉并切块处理后接种到诱导培养基上 进行诱导培养，获得愈伤组织，其中，所述诱导培养基中含有MS+6-BAI.O-1. 5mg/L+2， 4-D2. 0-4. 0mg/L+NAA0. 5-1. 5mg/L； 步骤三、愈伤组织分化：将所述愈伤组织接种到分化培养基中获得丛生芽，其中，所述 分化培养基中含有MS+1. 0-2.Omg/L的TDZ; 步骤四、壮苗：将丛生芽接种到壮苗培养基中进行壮苗培养，获得试管苗，其中，所述壮 苗培养基中含有MS+6-BA0. 1-0. 5mg/L+IBA0. 1-0. 5mg/L和 0? 5-1. 5g/L的粉状活性炭； 步骤五、生根：将试管苗移植入生根培养基中获得带根的试管苗，其中，生根培养基中 含有 1/2MS+IBA0. 1-0. 5mg/L+NAA0. 5-1.Omg/L和 0? 1-0. 5g/L的粉状活性炭； 步骤六、炼苗和移栽：炼苗获得完整植株之后将其移栽至基质中培养。
2. 如权利要求1所述的应用通城虎叶片进行快速繁殖的方法，其特征在于， 所述诱导培养基中含有MS+6-BA1 ?Omg/L+2，4-D3.Omg/L+NAA1 ?Omg/L;所述分化培 养基中含有MS+2. 0mg/L的TDZ;所述壮苗培养基中含有MS+6-BA0.lmg/L+IBA0. 5mg/L和 I. 5g/L的粉状活性炭；所述生根培养基中含有1/2MS+IBA0. 5mg/L+NAA0. 5mg/L和0. 5g/L 的粉状活性炭。
3. 如权利要求1所述的应用通城虎叶片进行快速繁殖的方法，其特征在于，所述诱导 培养基中还含有5-10mL/L的通城虎叶片提取液；所述壮苗培养基中还含有15-20mL/L的通 城虎叶片提取液。
4. 如权利要求3所述的应用通城虎叶片进行快速繁殖的方法，其特征在于，所述通城 虎叶片提取液为将通城虎成熟叶片搅碎获得的汁液。
5. 如权利要求1所述的应用通城虎叶片进行快速繁殖的方法，其特征在于，所述步骤 六中所述基质由体积比为5~3 : 3~2 : 1的腐殖土、干苔藓和珍珠岩组成。
6. 如权利要求1所述的应用通城虎叶片进行快速繁殖的方法，其特征在于，所述步骤 六中所述基质由体积比为4 : 2 : 1的腐殖土、干苔藓和珍珠岩组成。
7. 如权利要求1所述的应用通城虎叶片进行快速繁殖的方法，其特征在于，所述步骤 一中应用通城虎茎尖顶端的幼嫩叶片制备所述通城虎无菌外植体。
8. 如权利要求1所述的应用通城虎叶片进行快速繁殖的方法，其特征在于，所述诱导 培养基、所述分化培养基、所述壮苗培养基和所述生根培养基中均含有4. 5g/L的琼脂和 25§/1蔗糖，且？11值均为5.8。
9. 如权利要求1所述的应用通城虎叶片进行快速繁殖的方法，其特征在于，所述步骤 四还包括以下步骤：将所述试管苗接种于继代培养基中进行继代培养，其中，所述继代培养 基中含有MS+KT0. 1-0. 5mg/L+6-BA0. 2-1. 0mg/L+NAA0. 2-1. 0mg/L、4. 5g/L的琼脂和 25g/L 蔗糖，培养条件为：温度24-26°C，光照强度20001ux，继代培养基的pH值为5. 8。
10. 如权利要求1所述的应用通城虎叶片进行快速繁殖的方法，其特征在于，所述步骤 一中还包括外植体选择和外植体的消毒，其中，外植体的选择的具体过程为：取靠近通城虎 茎尖顶端的幼嫩叶片，自来水中浸泡30min，然后用毛细刷在流水下轻轻刷洗叶片表面及背 面，然后摊开在吸水纸上，自然风干；外植体的消毒的具体过程为：将自然风干后的叶片用 I%洗洁精水溶液浸泡5-10min，线状自来水冲洗10-15min，在接种室超净台上用经高压灭 菌的无菌水润洗一次，然后用75%的酒精浸泡30-50s，再用添加了 2-3滴吐温-20的150ml 体积分数为〇. 1 %升汞消毒4-6min，无菌水冲洗3-5次，最后摊开在消毒滤纸上以除去表面 水分，得到无菌外植体； 所述步骤二中愈伤组织诱导的具体过程为：将无菌外植体去掉叶脉组织，切成I. 0-2.Ocm的正方形叶块，边缘用刀片划伤，然后接种到所述诱导培养基中，在培养温度为 24-26°C，在暗培养条件下培养7d，然后在光照强度15001ux，光照时间为10-12h/d的条件 下培养21d，获得嫩绿色的愈伤组织； 所述步骤三中愈伤组织分化的具体过程为：将所述愈伤组织，切成2.Ocm的正方形 叶块，接种到所述分化培养基中，在培养温度为24-26°C，光照强度15001UX，光照时间为 10-12h/d的条件下培养21d，获得丛生芽； 所述步骤四中壮苗培养具体过程为：将所述丛生芽置于所述壮苗培养基中，在培养温 度24-26°C，光照强度20001ux，光照时间为10-12h/d的条件下培养21d得到健壮试管苗； 所述步骤五中生根培养的具体过程为：将所述健壮试管苗置于所述生根培养基中，培 养温度24-26°C，光照强度20001ux，光照时间为10-12h/d的条件下培养21d得到带根的完 整试管苗； 所述步骤六中炼苗与移栽的具体过程为：待所述步骤五中获得的带2-4cm根长的完整 试管苗后，将已生根的完整试管苗连同培养瓶移出培养室，转入大棚，在温度为25-27°下， 放置7d，然后打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗3-4d，取出，洗净根部培养基，移栽到 基质中，移栽后7-10d用塑料薄膜保湿，上面再覆盖一层报纸，保持光照强度以遮光率为 60-70%最为适宜，空气湿度85-90%，每3d喷雾1次；其中，所述基质的具体制作方法为： 干苔藓在使用过程中首先被人工粉碎成40-60目的颗粒物，之后将腐殖土、干苔藓和珍珠 岩按比例混合后，在常温下避光放置5-7d，每天喷一次水同时进行一次常规搅拌，喷水量为 50_100ml/kg基质D
【专利摘要】本发明提供一种应用通城虎叶片进行快速繁殖的方法，包括以下步骤：制备通城虎无菌外植体；愈伤组织诱导：将无菌外植体去掉叶脉并切块处理后接种到诱导培养基上进行诱导培养，获得愈伤组织；愈伤组织分化：将所述愈伤组织接种到分化培养基中获得丛生芽；壮苗：将丛生芽接种到壮苗培养基中进行壮苗培养，获得试管苗；生根：将试管苗移植入生根培养基中获得带根的试管苗；炼苗和移栽：炼苗获得完整植株之后将其移栽至基质中培养。本发明采用叶片为外植体，不仅取材方便，而且节约了茎段避免了整株采集，有利于通城虎资源的保护，也能满足市场对通城虎药材的需求。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104770296
【申请号】CN201510157533
【发明人】陈乾平, 潘丽梅, 白隆华, 谷筱玉, 黄芩芬
【申请人】广西壮族自治区药用植物园
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月3日