C下进行暗培养。约30天后，待形成肉眼可见的小愈伤组织时，移到愈伤组织增殖培养 基 Pell C(Pell C 培养基附加为 2.0mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA 和 O.lmg/L 2,4-D)上，进行 光照培养。继续培养7-10天后，挑选颜色鲜艳、大小合适的愈伤组织转入分化培养基Pell E(PellE培养基附加2·0mg/L6-BA、0·lmg/LNAA和0·02mg/L2,4-D)中进行分化培养，待 小芽长至lcm左右，切下转入生根培养基（附加0. lmg/L NAA的MS培养基）上形成完整植 株。
[0042] (4)体细胞杂种的鉴定
[0043] 本发明最终获得非对称融合植株13株，再生植株移栽到大田后，仅有5株存活，对 其进行形态、细胞学和花粉活性观察。经染色体计数和基因组原位杂交鉴定出的1株真杂 种（2n = 52 = 38+14)，（杜雪竹，2008)。
[0044] 实施例2甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的选育
[0045] 甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的选育的技术路线见图1所示。具体方法 为：鉴定过的真杂种（鉴定方法为常规方法）与甘蓝型油菜华双3号杂交获得回交一代 (BC1)，其4个长雄蕊两两融合为一个，2个短雄蕊上没有花药（图2)，有微粉，花粉可染性 差（〈10% )。BC1再与华双3号回交，后代植株发现雄蕊发育异常、雄蕊转变为心皮结构的 不育株，不育植株与甘蓝型油菜回交，每代选择不育植株继续与甘蓝型油菜回交，经过5代 连续回交获得稳定的不育系。不育系体细胞染色体数，经鉴定为2n = 38(图3)。该不育系 的四强雄蕊转变为心皮化结构，其顶端类似柱头、下部附着胚珠，两个短雄蕊仅有花丝，不 形成花药（图4)。新型不育系不育彻底（无花药），杂交和自由授粉均结实良好，且在湖北 省武汉市、甘肃省和政县和青海省西宁市各地种植时均表现稳定不育。
[0046] 线粒体基因 PCR扩增分析表明，融合植株中线粒体发生重组，并稳定遗传到不育 系中；进一步测序表明，不育系线粒体基因组中大部分基因来自菘蓝。该不育系的线粒体基 因组由菘蓝和甘蓝型油菜融合重组而来，而叶绿体来自甘蓝型油菜（具体见实施例4)。因 此，该不育系命名为甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系（英文简称为inap CMS)。
[0047] 甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的制种，参考傅廷栋主编的著作：《杂交油菜的 育种与利用》（傅廷栋，2000,湖北科学技术出版社报道的方法。
[0048] 实施例3甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系雄蕊发育观察
[0049] 取甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系和保持系华双3号的花蕾制作石蜡切片，石 蜡切片方法参考（李和平，2009)，李和平主编，《植物显微技术》，科学出版社，2009,北京； 第二章石蜡制片法。组织显微观察发现，甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系雄蕊不能正常 发育，雄蕊原基分化出来后开始同源转变为心皮（图5)。本发明获得的甘蓝型油菜菘油细 胞质雄性不育系与pol CMS和ogu CMS败育时期比较见表1。
[0050] 表1不同CMS败育时期
[0052] 实施例4甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系胞质组成分析
[0053] (1)甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系叶绿体来源
[0054] 甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的叶绿体来源鉴定，选用叶绿体基因引物 TrnD:5' -ACCAATTGAACTACAATCCC-3'，TrnT:5' -CTACCACTGAGTTAAAAGGG-3'（引物参考 Demesure等，1995)，对华双3号、菘蓝和不育系进行PCR扩增。PCR反应体系（10μ1)包含： 100ng基因组DNA，IX Taq buffer, 2mM MgC12，lU Taq DNA polymerase，5mM dNTPs，5 μ Μ正 向和反向引物。扩增程序为：94°C变性5min，然后32个循环（94°C 30s，57°C 30s，72°C 90s)， 最后72°C延伸lOmin。结果表明甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系中叶绿体来自华双3号 (图 6)。
[0055] (2)甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系线粒体基因组组成
[0056] 选用甘蓝型油菜华双3号、菘蓝和甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的黄化幼苗 提取线粒体DNA，参考Scotti等（2001)。以已测序的甘蓝型油菜品种Westar线粒体基因组 (GenBank:AP006444)序列作参考设计了 21对线粒体基因引物，引物序列见表2(除cox2-2 和 rrn26 外，引物参考 kang 等，2014)。PCR 反应体系（10μ1)包含：50ng mtDNA，lXTaq buffer, 2mM MgCl2，lU Taq DNA polymerase，5mM dNTPs，5 μΜ 正向和反向引物。PCR 扩增 程序为：94°C变性 5min，然后 30 个循环（94°C lmin，54°C lmin，72°C 2min)，最后 72°C延伸 10min。PCR产物回收后连接到pMD18-T载体，转化到大肠杆菌中，挑选阳性克隆测序。结果 表明，除cox3、rrn26、atp9和rps7在两亲本務蓝和油菜间无差异外，甘蓝型油菜務油细胞 质雄性不育系的线粒体基因大部分来自菘蓝（21个基因中有16个来自菘蓝），仅有C〇x2-2 来自甘蓝型油菜华双3号（表3)。这说明在原生质体融合过程中，菘蓝和甘蓝型油菜的线 粒体发生了重组，重组的胞质与核基因组不协调导致不育。
[0057] 表2线粒体基因引物序列
[0058]
[0059] 表3甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系（简称inap CMS)
[0062] 注：B表示甘蓝型油菜品种华双3号特异片段，I代表菘蓝特异片段，表示未扩 增出。
[0063] 实施例5甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系的遗传分类
[0064] (1)恢保关系测定：
[0065] 选取甘蓝型油菜杂交种生产中两个普遍CMS系统，pol和ogu CMS的恢复系（pol 和ogu CMS的恢复系种子由华中农业大学油菜研究室提供，为常用品种材料）与甘蓝型油 菜菘油细胞质雄性不育系进行测交，Fi均不育，仍表现出雄蕊心皮化（表4)。测交结果表 明，本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系与油菜pol和ogu CMS恢保关系不同。
[0066] 表4甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系（inap CMS)和其他油菜CMS的恢保关系 测定结果
[0068] 注：表1中的S表不不育，F表不可育。
[0069] 表1所列测交材料是检验本发明材料的恢复程度和保持程度的对比材料，不是依 赖该测交材料完成的发明创造（中国现有的育种资源只要具备上述材料的遗传特征均可 作为本发明表1的测交材料，本实施例不限于此）。〇gu CMS (参见，傅廷栋，杂交油菜的育种 与利用，湖北科学技术出版社，2000年版，湖北武汉。）是从引进的Ogu CMS商品种中通过 常规方法获得，由华中农业大学油菜研究室提供。Pol CMS(即波里马细胞质雄性不育系） 由华中农业大学油菜研究室提供，是华中农业大学中国工程院院士傅廷栋教授从甘蓝型油 菜品种波里马中发现的天然雄性不育株转育而成的甘蓝型油菜细胞质雄性不育系，已经公 开发表（傅廷栋，2000)。
[0070] ⑵分子生物学鉴定：
[0071] 利用ogu CMS不育相关基因 orfl38(GenBank:AB055443)设计引物，引物序列为 orfl38F :5' -ATTTGGCTAAGCTGGTTTTCT-3'，orfl38R :5' -CTCGGTCCATTTTCCACCTC-3'，进行 PCR扩增反应（PCR扩增体系和程序参考实施例4)，在甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系中 不能扩增出任何产物（见图7)。
[0072] 利用pol CMS不育相关基因 orf224(GenBank:EU254235)设计引物，引物序列为 orf224F :5' -ATGCAATGATGGAGATGGAGT-3'，orf224R :5' -CGATCAAGGTGCCGAAAGAT-3'，进行 PCR扩增反应，在甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系中不能扩增出任何产物（图8)。
[0073] 结果表明，本发明的甘蓝型油菜菘油细胞质雄性不育系在分子水平上与油菜pol