微生物农业的制作方法
【专利说明】微生物农业 发明领域
[0001] 本发明设及新的组合物，其用于控制由真菌植物病原体介导的疾病。更特别地，所 述组合物包含产生那他霉素的细菌菌株。
[0002] 发巧背景
[0003] 众所周知，植物和农作物经常被多种有害生物侵害，所述有害生物可损害它们的 生长或者甚至完全摧毁它们。一些有害生物的形式是杂草，它们W类似于期望植物的方式 生长并竞争±壤提供的营养和水。另一些有害生物的形式是病原体例如真菌和细菌，它们 被发现与许多植物有关。
[0004] 为了避免或者减少由于真菌植物病原体攻击所造成的经济损失，传统上使用合成 的化学杀真菌剂来保持疾病的发生被控制。例如，为了减少归因于真菌腐败的产量损失，目 前利用一种或多种合成农用化学品处理大部分种子。然而，使用合成农用化学品控制种子 中的真菌病原体增加了农民的成本并已对生态系统造成了有害影响。不恰当使用的合成农 用化学品污染水、空气和±壤并对水生生物、鸟类、哺乳动物和益虫（例如蜜蜂）造成持续 的有害影响。
[0005] 对于合成农用化学品使用的公众态度和环境问题W及真菌对不同合成农用化学 品发生的抗性已减少了运些化学品的吸引力。此外，由于政府对杀虫剂使用的限制，所登记 的合成农用化学品的数目正在减少。
[0006] 此外，向种子施用农用化学品伴随问题例如农用化学品与±壤的结合、由于农用 化学品的施用而导致的种子结块W及昂贵和复杂化学施用设备的使用。另外，农用化学品 可对种子产生不利影响，因为运些化学品可对种子和由种子萌发的植物有毒性。运种毒性 限制了可安全施用至种子的运些农用化学品的量。所述毒性的一种不良后果是已被处理的 种子的萌发率降低，或者甚至不萌发。所有运些与合成农用化学品使用有关的限制已导致 寻找控制种子的真菌疾病的替代方法。
[0007] 使用生物控制剂（例如，活的微生物）作为控制种子的真菌疾病的替代方法获得 了认可。US2011/0257009公开了利用包含合成农用化学品和活的微生物的混合物处理种 子的方法。其缺点是：合成农用化学品仍然是处理的一部分，运是不期望的。
[0008] 单独使用生物控制剂保护种子免受真菌病原体也已被公开。例如，在US 6, 280, 722中已公开了使用Bacillusthuringiensis菌株来处理种子。在US5, 496, 547中 已公开了使用Pseudomonasfluorescens菌株来处理种子，而在US2011/0020286中，已使 用Trichodermaatroviride菌株来处理种子。
[0009] 已观察到：一些生物控制剂仅在实验室中有效，但在田间不显示其活性。运可能是 由于制剂生产的难度、制剂在施用前的胆存期间的稳定性差、制剂在田间迅速降解和/或 制剂在大范围的环境条件中性能不足。
[0010] 因此，非常需要新的生物控制剂，其不具有上述缺点并能够在田间控制真菌植物 病原体并从而为植物提供受保护的生长环境W增强其生长和提高作物产量。
[0011] 发巧概沐
[0012] 大部分由真菌植物病原体引起的作物植物损伤早在种子在胆存期间、种子被引入 到±壤中之后、种子萌发期间或紧随萌发的时候被攻击时就发生了。所述后面的阶段特别 关键，因为生长中的植物的根和芽（shoot)特别敏感，即使是轻微的损伤也能导致变形、生 长不良、作物产量低或者整株植物死亡。因此，降低种子、根、芽和幼苗被真菌感染的发病率 特别有意义。依照本发明，已发现：产生那他霉素的细菌菌株可被用于控制和抑制种子、根、 芽和幼苗的真菌疾病。产生那他霉素的细菌菌株对人类和环境二者都是安全的。 柳1引 发巧详沐
[0014] 本发明的一个方面设及用于增强植物生长、作物产量或二者的方法，所述方法包 括W下步骤：将至少一种产生那他霉素的细菌菌株施用至种子、将要种植种子的基质或二 者。通过将产生那他霉素的细菌菌株施用至种子、将要种植种子的基质或二者，可改善种子 的萌发。因此，本发明还设及用于改善种子萌发的方法，所述方法包括W下步骤：将至少一 种产生那他霉素的细菌菌株施用至种子、将要种植种子的基质或二者。例如，在20-3(TC下 解育种子14-16天之后，产生那他霉素的细菌菌株可将种子萌发提高1% -25%。测量种子 萌发的试验可在由瑞i的国际种子检验协会出版的Han化ookInternationalRules化r SeedTesting, 2011版本，第5章中找到。简而言之，在具有设定溫度和光照条件的专业 萌发室中解育种子。根据众所周知的ISTA(国际种子检验协会）程序（参见由瑞±的国际 种子检验协会出版的HanclbookInternationalRulesforSeedTesting, 2011 版本，第 5章）将种子种植在卷轴式纸（rollpaper)上。使种植的种子经受W下循环14-16天：在 20°C下12小时黑暗，接着在30°C下12小时光照；湿度在98% -100%之间。
[0015] 通过将产生那他霉素的细菌菌株施用至种子、将要种植种子的基质或二者，可在 由种子生长的植物中获得正面（positive)的产量响应。此外，通过将产生那他霉素的细菌 菌株施用至种子、将要种植种子的基质或二者，可改善收获的植物材料的质量，因为植物和 /或收获的植物材料中霉菌毒素的含量可被降低。
[0016] 本发明的另一方面设及控制植物中的真菌疾病的方法，所述方法包括W下步骤： 将至少一种产生那他霉素的细菌菌株施用至种子、将要种植种子的基质或二者。产生那他 霉素的细菌菌株在有效治疗由真菌植物病原体介导的植物疾病并抑制真菌植物病原体的 生长的条件下被施用。产生那他霉素的细菌菌株可被用于在施用菌株后的一定时段内控制 植物中的真菌疾病。所述时段通常跨越长达处理种子后300天。它W有效量被施用，有效 量表示：足W控制或者甚至完全杀灭真菌疾病且同时不展示出植物毒性症状的量。将要施 用的量可在宽范围内变化并依赖于许多因素，包括但不限于，待被控制的真菌疾病的类型、 待被处理的植物、和气候条件。
[0017] 优选地，被施用的菌株是活的。所述菌株可W在任何生理状态（例如活性的或休 眠的）下被施用。在一种实施方式中，所述菌株是抱子形成菌株。所述菌株可W是纯化的 或者未纯化的。所述菌株可W作为生物学上纯净的培养物或接种物被施用。当在本文中使 用时，术语"产生那他霉素的细菌菌株"还包括那他霉素产生细菌的抱子或类抱子结构。抱 子或类抱子结构自身可W能够产生那他霉素。或者，抱子或类抱子结构可不能产生那他霉 素，但一旦条件适宜，可发育成产生那他霉素的细菌菌株。
[0018] 在一种实施方式中，产生那他霉素的细菌菌株选自Streptomycesnatalensis 菌株、Streptomycesgilvosporeus菌株、Streptomyceschattanoogensis菌株和 Str巧tomyceslydicus菌株。生产产生那他霉素的细菌菌株的方法在本领域是已知的， 例如在W0 93/0317UW0 93/03169、W0 2004/087934、Martin和McDaniel(1977)、Chen 等人（2008)、Farid等人（2000)、El-Enshasy等人（2000b),He等人（2002)和Liang等 人（2008)中。Streptomycesnatalensis菌株包括但不限于W下菌株：ATCC27448、BCRC 15150、CBS668. 72、CBS700. 57、CCRC15150、CCTMLa2923、CECT3322、CGMCC100017、 CGMCC100019、DSM40357、FATCC27448、霍赫海德（Hoogerheide)菌株KNGSF、IF0 13367、 ISP5357、JCM4693、JCM4795、KCC693、KCCS-0693、KCCS-0795、KCCS-0693、KCCS-0795、 KNGS菌株F、NBRC13367、NCIB10038、NCIM2933、NCIM5058、NCIMB10038、NRRL2651、 NRRLB-265UNRRLB-5314、RIA1328、RIA976、VKMAc-1175、VKMAc-1175。此外，实施例 中所述的Streptomycesnatalensis菌株可被用在本发明中。在一个优选的实施方式中， Streptomycesnatalensis菌株被用在本发明中。在一个甚至更优选的实施方式中，具有 内部编码的DS73870和DS73871的Str巧tomycesnatalensis菌株被用在本发明中。根 据布达佩斯条约的条款，所述菌株于2014年5月20日被保藏在荷兰真菌培养物保藏中屯、 (Centr曰曰 1BureauvoorSchimmelcultures，CBS)，乌特勒克荷兰。S.η曰t曰lensis菌株 DS73870已被保藏为菌株CBS137965。S.natalensis菌株DS73871已被保藏为菌株CBS 137966。
[0019] Str巧tomycesgilvosporeus菌株包括但不限于下列菌株： A-5283,ATCC13326,NRRLB-5623。Streptomyceschattanoogensis菌株包括但不限于 下列菌株：AS4. 1415、ATCC13358、ATCC19739、BCRC13655、伯恩斯度urns)J-23、CBS 447. 68、CBS477. 68、CCRC13655、CCTMLa2922、CECT332UCGMCC100020、CGMCC4. 1415、 CUB136、DSM40002、DSMZ40002、霍特曼（Holtman)J-23、IF0 12754、ISP50002、ISP5002、 J-23、JCM4299、JCM4571、KCCS-0299、KCCS-0571、KCCS-0571、KCCS-0299、KCTC1087、 兰奥特化an〇〇t)R-8703、LMG19339、NBRC12754、NCIB9809、NCIMB9809、NRRLB-2255、 NRRL-ISP5002、R-8703、RIA1019、VKMAc-1775、VKMAc-1775。Str巧tomyceslydicus菌 株包括但不限于下列菌株：CGMCCNo. 1653。
[0020] 为了控制真菌植物病原体并因此增强植物生长和作物产量，可在产生那他霉素的 细菌菌株的有效区域内培养种子和植物。在一种实施方式中，可将产生那他霉素的细菌菌 株直接渗入到将要种植种子的基质（例如，±壤）中。直接渗入的形式可W是将产生那他 霉素的细菌菌株与将要种植种子的基质混合。细菌菌株可液体形式例如作为悬浮液 或乳液与基质混合，或者，它可干燥形式例如作为颗粒、小球或粉末与基质混合。可通 过例如喷雾（spra}dng)、注射、洒粉（dusting)、洒（sprinkling)、灌概（irrigating)或湿 透（化enching)将产生那他霉素的细菌菌株施用至将要种植种子的基质。产生那他霉素 的细菌菌株W有效控制真菌疾病的量被施用至将要种植种子的基质。所述菌株在W每克 1〇3- 1〇11个菌落形成单位（C化）的浓度递送时有效。对于施用在将要种植种子的基质中或 上，可使用 0. 1-10,OOOg/ha。
[0021] 当在本文中使用时，"将要种植种子的基质"表示：任何适合由种子生长植物和/ 或幼苗的生长环境，例如±壤和任何其它生长基质（天然的或人工的）。产生那他霉素的 细菌菌株可被施用至例如垄沟（in-furrow) ±壤、生长块（growingblocks)、沟（gutters) 或Τ型带。可在播散种子的同时将产生那他霉素的细菌菌株施用至将要种植种子的基质， 但也可w在播种之前或之后施用。将要种植种子的基质可存在于户外例如在田间、在溫室 中、在荫棚中、在生长室中或在容器中。
[0022] 在另一种实施方式中，产