专利名称：一种微生物菌剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物菌剂及其应用，属微生物农药技术领域。 技术背景植物寄生线虫是作物上普遍发生的病害之一，危害几乎所有作物。仅根结线虫 (Meloidogyne spp.)每年在全球造成的损失就高达数百亿美元。由于生产上缺乏抗性品 种，农作物复种指数高，化学杀线剂的使用受到限制，以及现代农业可持续发展的需要，生 物防治植物线虫日益受到重视。杀线虫微生物中包括细菌和真菌，利用细菌对线虫的诱导作用，把线虫吸引到真 菌周围，再利用真菌的独特刺细胞结构击倒线虫，辅以细菌的酶解作用，达到杀死线虫的目 的。这种多重作用的联合在线虫的生物防治中具有潜在和实际的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物菌剂及其应用。本发明从杀线虫微生物中筛选寻找具有工业化生产前景的菌株，为农业生产提供 一种具较好的防治线虫的生防制剂。本发明具体是这样实现的本发明人在前期研究中，筛选获得了具有良好杀线虫功能的担子菌球盖菇 2052(Stropharia sp. 2052)禾口芽孢杆菌 B16 (Bacillus nematocidus)。B16 菌株已于 2004年4月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 1128。2052菌株已于2009年11月5日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物 中心，保藏号CGMCC No. 3399。食线虫芽孢杆菌隶属于芽孢杆菌属(Bacillus)，为好氧菌，G+，细胞长 2. 0-3. 5 ii m，宽0. 8-1. 2 u m0在LB平板上生长速度较快，在LB培养基上培养72小时以上 可见极少数的内生孢子形成或释放到胞外的芽孢，5天后菌体几乎全生成芽孢。芽孢为长柱 形，亚端生。菌株的主要形态特征为长杆状，个体较大，两端钝圆，多以分散形式存在。在 LB平板上菌落呈圆形，表面粗糙无光泽，类似细小粉末状，菌苔白色。球盖菇(Stropharia)隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、球盖菇科。其主要形态 特征为有着紫褐色至烟褐色的孢子，常见于树林、草地、堆肥、动物粪便等场所。子实体中 等至较大，菌盖直径60 160 (200)mm,扁半球形、半球形至扁平，葡萄酒红褐色，逐渐转为 赭褐色或乳酪色，有时黄乳酪色并有酒红色细丝分布其间。菌盖幼时锥形至钟形，成熟时钟 形至平展，平滑或有纤毛状鳞片，湿润时稍粘，初期有菌幕残片，后变光滑，边缘锐，常向内 卷曲。菌褶初期略带烟色，后着色变深，灰蓝色至紫黑色，近生和贴生，密，较宽，不等长，边 缘略白。菌柄白色，有时略黄，较厚，70 150X15 30mm，圆柱形，基部略膨大，实心。菌 环较厚，白色。菌柄在菌环以下部位光滑、无鳞。菌肉白色，较厚。有青草香味。孢子印紫 褐色，孢子椭圆至卵形，厚壁，9. 5 12 X 7 9 ii m，有芽孔。单生或群生于树林和草地等生 境。几乎所有球盖菇属真菌的纯培养都能够产生附属结构刺细胞，该结构被认为是该属真
3菌分类的一个重要特征。芽孢杆菌(Bacillus)是从大量土壤细菌中筛选出来的具有杀线虫活性的菌株。 通过对菌株进行筛选和改良后，获得了稳定的菌株B16。该菌易于培养，性状稳定，适合于规 模化生产。球盖菇(Stropharia)原始菌株生长缓慢。我们从土壤中分离到不同菌株，其中大 部份不具备我们所需的“明显稳定的防治效果，综合性状好，易于规模化生产”的特性。通 过对菌株进行筛选和改良后，获得了稳定的菌株2052。它不但对根结线虫(Meloidogyne spp.)具有良好的防治效果，同时具备了工业化生产的基本性状。本发明将球盖菇2052通过固体培养，获得包括菌丝和菌丝附属结构的菌体培养 物，再复合细菌B16的液体培养物制作成固体粒剂，穴施使用。本发明的微生物菌剂经如下步骤得到a.选择微生物菌株球盖菇2052(Stropharia sp. 2052)和芽孢杆菌B16 (Bacillus nematocidus)，按常规方法制备成2052固体培养物和B16的菌悬液(CFU = 2X108)，按质 量比11的比例混合得到混合物；b.按质量比加入上述混合物质量的30-40%的硅藻土，硅藻土粒径为4. 5-5mm，按 常规方法制成固体菌剂。本发明的微生物菌剂作为用于防治植物线虫的应用。本方法制作的生防制剂能与其他的杀线虫农药、植物生长调节剂混合使用，但必 须保证所混合药剂对本发明采用的芽孢杆菌和球盖菇无副作用。本发明的线虫生防制剂一般在作物播种或移栽时施用。方法是播种时与种子共同 施入土壤中，移栽时将本制剂施入作物根际周围。对线虫发生严重地区可在作物生长过程 中追施一次，方法是将本制剂施入作物根际周围。本发明与现有的杀植物寄生线虫药相比，具有高效、低毒以及无残留的优点。
具体实施例方式本发明化合物的发酵生产方法(常规方法)1、将2052菌株的菌丝体接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为PDA培养 基，20-30°C下培养4-8天，获得试管种。2、将B16菌株接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为LB培养基，35_38°C下 培养1-2天，获得试管种。3、将培养好的2052固体种子接入固体培养基中，培养基的配方为70_80%小麦 粒、10-20%葡萄糖，5-10%碳酸钙，22-28°C培养25-35天。4、将培养好的B16固体种子接入液体LB培养基中，培35_38°C培养1_2天，配制成 CFU = 2X108的菌悬液。5、将培养好的2052固体培养物和B16的菌悬液(CFU = 2 X 108)，按1 1的比例 混合，加入4. 5-5mm的硅藻土 30-40%，制成固体菌剂使用。本发明制剂对根结线虫的防效试验1、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)的培养统计将温室培养的带有南方根结线虫的番茄根用无菌水洗净，解剖针挑取根结线虫的卵囊置于0. 4M的KC1溶液中，在5ml离心管中依次用4ml无菌水(三次)、lml无菌青-链 霉素双抗溶液、3ml 0. 1 %的NaCIO溶液洗涤和消毒，每一步骤均通过短暂离心(8000转30 秒)除去上清液。洗涤好的虫卵置于0.4M的ZnCl2溶液中孵化48小时，二龄幼虫用移液 器收集于1. 5ml离心管，通过短暂离心(5000转30秒)富集计数。2、防效试验方法(1)试验所用药剂及处理A、固体菌剂10-20%，在作物移栽时一次性施于作物根际；B、阳性对照，0. 5%阿维菌素按37. 5kg/hm2处理；C、空白对照，不加菌剂或药剂处理。(2)试验方法在直径为15cm的盆钵加入500g 土样(病土 沙土 腐殖土 = 1:1: 1)，做以 上几个处理。每个处理5盆且3次重复，置于25-28°C的温室中培养。移栽后每隔3天浇 水，使其正常生长。菌剂处理后30、60天分别调查各处理组作物根部的根结数、根际的虫卵 数，计算菌剂对根结线虫病的防治效果。实施例1 用菌剂防治番茄根结线虫病试验移栽1月龄番茄(4-6叶)，番茄品种为改良毛粉802，山东农业科技开发公司生 产。每盆施用50g菌剂，按上述试验方法进行防效试验。列表所示为防效数据。表1菌剂对番茄根结线虫病的防治效果(60d) 结果表明，该菌剂对番茄根结线虫病具有显著的防治作用。实施例2 :不同菌剂的防效比较实施例2方法同实施例1，不同之处为施用2052菌剂为每盆50g，施用B16菌剂 为每盆100mL。表2菌剂的增效作用 结果表明，本发明菌剂比单独施用2052菌剂防效提高10. 7%，比单独施用B16菌 剂防效提高7.3%。
权利要求
一种微生物菌剂，其特征在于微生物菌剂包括菌株球盖菇2052(Stropharia sp.2052)、芽孢杆菌B16(Bacillus nematocidus)和硅藻土三种物质。
2.权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于微生物菌剂经如下步骤得到a.选择微生物菌株球盖菇2052(Strophariasp. 2052)和芽孢杆菌B16 (Bacillus nematocidus)，按常规方法分别制备成2052固体培养物和B16的CFU = 2 X IO8的菌悬液， 再按质量比11的比例混合得到混合物；b.按质量比加入上述混合物质量的30-40%的硅藻土，硅藻土粒径为4.5-5mm，按常规 方法制成固体菌剂。
3.权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于该微生物菌剂作为用于防治植物线虫的应用。
全文摘要
本发明涉及一种微生物菌剂及其应用，属微生物农药技术领域。本发明的微生物菌剂包括菌株球盖菇2052(Stropharia sp.2052)、芽孢杆菌B16(Bacillus nematocidus)和硅藻土三种物质，经如下步骤得到a.选择微生物菌株球盖菇2052(Stropharia sp.2052)和芽孢杆菌B16(Bacillus nematocidus)，按常规方法分别制备成2052固体培养物和B16的菌悬液(CFU＝2×108)，再按质量比1∶1的比例混合得到混合物；b.按质量比加入上述混合物质量的30-40％的硅藻土，硅藻土粒径为4.5-5mm，按常规方法制成固体菌剂。本发明的微生物菌株作为制备用于防治植物线虫制剂的应用。本发明的微生物菌剂具有高效、低毒及无残留的优点，对番茄根结线虫病温室防效达到90％以上。
文档编号A01P5/00GK101861880SQ201010207968
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月24日 优先权日2010年6月24日
发明者刘亚君, 张克勤, 翟冲燕 申请人:云南大学