一种stat1a基因缺失型斑马鱼的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因敲除技术领域，设及一种statia基因缺失型斑马鱼。
【背景技术】
[0002] STAT1(signal transducer and activator of transcription 1)基因位于人类 2q32.3,是编码750个氨基酸的转录因子。一般认为该基因介导干扰素信号通路，可直接调 控祀基因的转录，并参与细胞增殖与分化等过程。通过基因差异表达谱分析和基因组关联 分析等，发现STAT1基因与骨质疏松密切相关。
[0003] 斑马鱼与人类在骨骼发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且STAT1基因进 化上较为保守，人类STAT1基因的两个不同剪接体STATl-alpha和STATl-beta对应于斑马鱼 两个不同基因 statia和stat化，研究发现statia在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且，与 其他动物模型相比，斑马鱼个体小、幼鱼通体透明，利于骨骼发育的观察。
[0004] 通过CRISPR/化s9基因打祀技术，在斑马鱼statia基因上设计合适的打祀位点，将 体外合成的特异性sgRNA(终浓度20ngAiL)和化s9-mRNA(终浓度30化g/yL)显微共注射进斑 马鱼一细胞内，并通过活性检测证实了所选位点的有效性。
[000引基因打祀技术起源于20世纪80年代末，是一种通过对基因组进行定点修饰来研究 基因功能的重要的方法手段，也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺 失突变、基因灭活、染色体大片段删除W及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息，并 且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状，从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的 作用，所W运类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。传统的基因打祀技术是建立在 胚胎干细胞化SC)和同源重组技术的基础之上，故打祀技术效率极低。2013年初，一种全新 的人工核酉《内切酉每clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9,能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基 因，且制作简单、成本低，且可同时对祀基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基 因，但同时该技术存在一定的缺陷，其脱祀率相对较高。
[0006] 基于此提供一种statia基因缺失型斑马鱼，提高对statia基因的研究同时增加斑 马鱼的商业价值就显得尤为必要。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种statia基因缺失型斑马鱼。本发明方法中，S化tl基因设 及细胞的生长，分化、调亡和免疫的基因表达。研究发现statia基因和骨骼的发育相关，本 发明方法，可用于进行statia基因与骨骼发育的相关研究，也可进项其他方面探索研究，检 测statia基因的缺失与其他器官的发育是否具有相关性，例如屯、脏等，具有很好的医学研 究价值，同时敲除statia基因的斑马鱼其成长周期明显缩短，也具有很好的商业价值。
[0008] 为达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
[0009] 一种statia基因缺失型斑马鱼，所述斑马鱼statia基因缺失实验设计区敲除后序 列如SEQ ID No.l所示。
[0010] 进一步的，一种statla基因缺失型斑马鱼由如下步骤构成：
[0011] 步骤一、CRISPR/Cas9基因敲除祀位点设计：
[0012] 在NCBI上查询斑马鱼statla基因的基因组DNA序列及其功能结构域，根据CRISPR/ Cas敲除原理，设id对statla基因的祀位点，祀点的选择遵循此标准：5 ' -GG-(N) 18-NGG- 3'；其中5'端的GG二核巧酸是T7启动子的一部分，祀位点的3'端是NGG;
[001引步骤二、构建曲NA表达载体W及曲NA体外合成
[0014] 步骤Ξ、斑马鱼胚胎的显微注射
[0015] 在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养 皿中；
[0016] 在进行显微注射之前，将Cas9mRNA和曲NA配成混合液，充分混匀，使Cas9mRNA的终 浓度为30化g/化，gRNA的终浓度为20ngAi;注射1.8nL化s9mRNA和曲NA混合液于一细胞期 的受精卵内；注射过的受精卵放置于5mmol/L化Cl，0.33mmol/L CaC12,0.33mmol/L MgS04,0.17mmol/L KCl的E3水中，28°C解化;在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育 的胚胎用于祀位点突变分析；
[0017] 步骤四、T7E1法和Sanger测序检测祀位点的有效性
[0018] 对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其statla 基因是否存在突变，提前确认此次选择的祀位点是否有效果，显微注射操作是否规范；
[0019] 步骤五、注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤；
[0020] 步骤六、目的序列的TA克隆；
[0021 ] T7E1酶切初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序；若测序峰图有双 峰，并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列，接下来进行TA克隆之后挑取单克隆 作进一步检测；
[0022] 步骤屯、质粒的Sanger测序
[0023] 将双酶切检测结果显示条带大小符合预期结果的质粒送往测序，根据测序之后给 出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，根据比对结果，分析出每个单克隆的 突变类型；
[0024] 步骤八、获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代
[0025] 通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生 型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28°C培养，在初期观察F1代的存活率;受精两天后，每个 突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定;将每个胚胎单独提取基因组，然后PCR扩 增出7(K)bp的祀位点附近区域，再进行T7E1酶切分析并送部分去测序，确定此突变是否可W 遗传到F1代；
[0026] 如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月；再 分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，筛选F1代突变体；
[0027] 步骤九、获得斑马鱼突变体的F2代纯合子
[0028] 从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代，放置于28Γ培养，受 精四天后取部分胚胎进行鉴定。将每个胚胎单独提取基因组，PCR扩增出70化P祀位点附近 区域，通过Ball限制性酶切分析并测序，初步检验是否可W得到statla突变体纯合子。如检 验结果证明存在纯合子，则养大后再单条剪尾鉴定。
[0029] 步骤十、依据步骤九方法进行该基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到运种新 的斑马鱼品系。
[0030] 进一步的，所述步骤一中，引物序列为：
[0031 ] F1-祀位点a正向引物：
[0032] tgt曰曰t曰eg曰etc曰ct曰t曰gg曰g曰曰eg曰gtctctggcc曰gtttt曰g曰get曰g曰曰曰t曰gc
[0033] F2-祀位点b正向引物：
[0034] tgtaatacgactcactatagacctctgacattccagcaagttttagagctagaaatagc
[0035] R-共用的反向引物：
[0036] Aa邑cacc邑actc邑邑t邑ccact。
[0037] 进一步的，所述步骤二具体包括：
[0038] (1)首先将gRNA骨架克隆到P42250载体上，取1-化L质粒进行琼脂糖凝胶电泳检 测；
[0039] (2)特异性gRNA体外合成
[0040] 用Bsal限制性内切酶线性化此质粒;酶切反应总体积为20yL，体系如下：
[0041]
[0042] 离屯、混匀后于37°C水浴，酶切化W上；
[0043] (3)W线性化的P42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特 异性曲NA合成的双链DNA;
[0044] PCR引物上下游引物分别位于1号和3号内含子上：
[004引 F:5 '-CAGAAATCGGGGGAAAAATATAC-3 '
[0046] R:5 '-TGCTGTTGTACCATGGCTATACTT-3 '
[0047] 正向引物F:T7启动子_20bp祀序列_20bp gRNA上游骨架 [004引反向引物R:20bp gRNA下游骨架
[0049] PCR反应体系如下：
[0050]
[0051] 震荡混匀之后，4°C离屯、，于PCR仪上进行扩增反应;反应条件为:预变性95°C8min， 其中变性95°C30s，退火64°C30s，延伸72°C20s进行30个循环，再72°C8min;待反应结束后， 离屯、PCR产物，取化L样品点样于2.0 %琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果；
[0052] (4)检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物；