基于放线菌的农作物种子浸种剂及其制备方法和浸种方法
【专利摘要】本发明具体公开了一种基于放线菌的农作物种子浸种剂及其制备方法和浸种方法，该农作物种子浸种剂的有效成分是放线菌的次级代谢产物；其中，所述放线菌为娄彻氏链霉菌D74或/和密旋链霉菌SG712100。其制备方法为：挑取活化好的娄彻氏链霉菌或/和密旋链霉菌斜面培养物，接种到高氏1号液体培养基中，摇床振荡培养，抽滤，过滤除菌，得放线菌无细胞发酵滤液，即所述放线菌的次级代谢产物。其浸种方法为：将农作物种子放入稀释后的无细胞发酵滤液中，浸泡，弃去浸液，阴凉处干燥后播种。本发明可显著促进农作物种子萌发及幼苗生长，提升农作物的抗病性，进而提高农作物产量，同时不会对人畜和环境产生危害和污染。CCTCC NO: M 20906620090407CCTCC NO: M 201612320160314
【专利说明】
基于放线菌的农作物种子浸种剂及其制备方法和浸种方法
技术领域
[0001] 本发明涉及植物生长调理剂领域，具体涉及一种基于放线菌的农作物种子浸种剂 及其制备方法和浸种方法。
【背景技术】
[0002] 种子处理是应用物理、化学及生物学方法为农作物种子提供防虫防病保护，促进 作物出苗及健康生长的技术。种子处理技术主要包括种子包衣、种子丸粒化、浸种及拌种 等。种子处理方法简单，成本低，防病促生效果好。我国从50年代就开始利用药剂浸种、拌种 来防治农作物地下害虫和苗期病害。但是常用浸种剂大多为化学制品，主要用于防虫防病， 尚无以放线菌发酵产物为有效成分的促生浸种剂。
【发明内容】
[0003] 针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于放线菌的农作物种 子浸种剂及其制备方法和浸种方法。该基于放线菌的农作物种子浸种剂可显著促进农作物 种子萌发及幼苗生长，提高农作物抗病性，进而提高农作物产量，同时不会对人畜和环境产 生危害和污染。
[0004] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。
[0005] ( - ) 一种基于放线菌的农作物种子浸种剂，其特征在于，有效成分是放线菌的次 级代谢产物;其中，所述放线菌为娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)D74或/和密旋链霉 菌（Streptomyces pactum)SG712100〇
[0006] 所述娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei)D74,于2016年3月14日保藏在中国典 型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2016123,保藏单位地址为中国湖北省武汉市武昌珞 珈山，邮编430072;其16S rDNA序列如SEQ ID No. 1所示，具体如下： tcgccagtcc caccttcgac agctccctcc cacaaggggt tgggccaccg gcttcgggtg 60 ttaccgactt tcgtgacgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgca 1.2:0 gcaatgctga tctgcgatta ctagegactc cgacttcatg gggtcgagtt gcagacccca 180
[0007] atccgaactg agaccggctt tttgagattc gctccacctc gcggtatcgc agctcattgt 240 accggccatt gtagcacgtg tgcagcccaa gacataaggg gcatgatgac ttgacgtcgt 3DQ CCGcaccttc Gtccgagttg acGccggcgg tctcccgtga gtccecagcja ccacaagggG 360 Gtgctggcaa caccgggaac aagggttgcg cttcgttgcg ggactta,a,cc aacatctcac 420 gacacgagct gacgacagcc atgcaccacc tgtacaccga ccacaagggg gaccctgtct 480 ccagggtttt ccggtgtatg tcaagccttg gtaaggttct tcgcgttgcg tcgaattaag 540 ccacatgctc cgccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttta gccttgcggc 600 cgtactcccc aggcggggoa cttaatgcgt tagctgcggc acggacaacg tggaatgUg 66:0 CGcacaccta gtgCGcaccg tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct 720 ccccacgctt tcgctcctca gcgtcagtat cggcccagag atccgccttc gccaccggtg 780 ttcctcctga tatctgcgca tttcaccgct acaccaggaa ttccgatctc ccctaccgaa 840 ctctagcctg cccgtatcga ctgcagaccc ggggttaagc cccgggcttt cacaaccgac 900
[0008] gtgacaagcc gcctacgagc tctttacgcc caataattcc ggacaacgct tgcgccctac 960 gtattacGgc ggctgetggc acgtagttag ccggcgcttc ttctgcaggt accgteactt 1020 tcgcttcttc cctgctgaaa gaggtttaca acccgaaggc cgtcatccct cacgcggcgt 1080 cgctgcatca ggctttcgcc cattgtgcaa tattccccac tgctgcctcc cgtaggagtc 1140 tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggccgg tcgccctctc aggccggcta cccgtcgtcg 1200 ccttggtgag ccgttacctc aceaactagc tgataggccg cgggcteatc ctgcaccgcc 126:0 ggagctttcg aacctcgcag atgcctgcga ggatcagtat ccggtattag accccgtttc 1320 cagggcttgt cccagagtgc agggcagatt gcccacgtgt tactcacccg ttcgccacta 1380 atccccaceg aagtggttca 1409；
[0009] 所述密旋链霉菌（Streptomyces pactum)SG712100，于2009年4月7日保藏在中国 典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 209066,保藏单位地址为中国湖北省武汉市武昌 珞珈山，邮编430072;其16S rf)NA序列如SEQ ID No.2所示，具体如下： AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG GACGAACGCT QGCGGCffTQC TTAACACATe CAGGTCGAAC 60 GATGAACCAC TTCGGTGGGG ATTAGTGGCG AACGGGTGAG TAACACGTGG GCAATCTGCC 120 CTGCACTCTG GGGCAAGCCC TGGAAACGGG GTCTAATACC GGATACTGAT CCTCACGGGC 180 ATCTGTGAGG GTCGAAAGCT CCGGCGGTGC AGGATGAGCC CGCGGCCTAT CAGCTAGTTG 240
[0010] GTGAGGTAAT GGCTCACCAA GGCGACGACG GGTAGCCGGC CTGAGAGGGC GACCGGCCAC 300 ACTGGGACTG AGACACGGCC CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTGGGGAA TATTGCACAA 360 TGGGCGAAAG CCTGATGCAG CGACGCCGCG TGAGGGATGA CGGCCTTCGG GTTGTAAACC 420 TCTTTCAGCA GGGAAGAAGC GAAAGTGACG GTACCTGCAG AAGAAGCGCC GGCTAACTAC 480 GTGCCAGCAG CCGCGGTMT ACGTAGGGCG CAAGCGTTGT CCGGAATTAT TGGGCGTAAA 540 GAGCTCGTAG GCfiGCTTGTC ACGTCGGTTG TCxAAAGCCCG G€GCTTAACC CCGGGTCTGC 60Q AGTCGATACG GGCAGGCTAG AGTTCGGTAG GGGAGATCGG AATTCCTGGT GTAGCGGTGA 660 AATGCGCAGA TATCAGGAGG AACACCGGTG GCGAARGCGG ATCTCTGGGC CGATACTGAC 720 GCTGAGGAGC GAAAGCGTGG GGAGCGAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA 780 AACGGTGGGC ACrAGGTCTG CGCAACATTC CACGTTGTCC GTGCCGCAGC TAACGCATTA 840 AGTGCCCCGC CTGGGGAGTA CGGCCGCAAG GCTAAAACTC AAAGGAATTG ACGGGGGCCC 900 GCACAAGCGG CGGAGCATGT GGCTTAATTC GACGCAACGC GAAGAACCTT ACCAAGGCTT 960 GACATACACC GGAAACGGCC AGAGATGGTC GCCCCCTTGT GGTCGGTGTA CAGGTGGTGC 1020
[0011] ATGGCTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC 1080 TTGTCCCGTG TTGCCAGCAA GCCCTTCGGG GTGTTGGGGA CTCACGGGAG ACCGCCGGGG 1140 TCAACTCGGA GGAAGGTGGG GACGACGTCA AGTCATCATG CCCCTTATGT CTTG^CTOC 1200 ACACGTGCTA CAATGGCCGG CACMTGAGC 丁GCGATACCG CGAGGTGGAG CGAATCTCAA 1260 AAAGCCGGTC TCAGTTCGGA TTGGGGTCTG CAACTCGACC CCATGAAGTC GGAGTCGCTA 1320 GTAATCGCAG ATCAGCATTG CTGCGGTGAA TACGTTCCCG GGCCTTGTAC ACACCGCCCG 1380 TCACGTCACG AAAGTCGGTA ACACCCGCAG CCGGTGGCCC AACCCCTTGT GGGAGGGAGC 1440 TGTCGAAGGT GGGACTGGCG ATTGGGACGA AGTCGTMCA AGGTAGCCGT A 1491。
[0012] (二)所述基于放线菌的农作物种子浸种剂的制备方法，其特征在于，挑取活化好 的娄彻氏链霉菌或/和密旋链霉菌斜面培养物，接种到高氏1号液体培养基中，28°C、150r/ min摇床振荡培养8d，然后用真空栗抽滤，再在无菌条件下用灭菌微孔滤膜过滤除菌，得放 线菌无细胞发酵滤液，即所述放线菌的次级代谢产物。
[0013] 优选地，所述灭菌微孔滤膜的孔径为〇. 45μπι。
[0014] (三)所述基于放线菌的农作物种子浸种剂的浸种方法，其特征在于，按照以下步 骤进行:挑选饱满的农作物种子，放入稀释后的无细胞发酵滤液中，浸泡12~30h，弃去残留 浸液，阴凉处干燥后播种。
[0015] 优选地，所述无细胞发酵滤液的稀释倍数为100~1000倍。
[0016] 优选地，所述农作物种子与所述稀释后的无细胞发酵滤液的质量比为1:1~1:2。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0018] 本发明引入新的生物技术，以放线菌无细胞发酵滤液为种子浸种剂的原料成份， 未添加其它农药成分，基于放线菌的农作物种子浸种剂可显著促进农作物种子萌发及幼苗 生长，提高农作物的抗病性，进而提高农作物产量，同时不会对人畜和环境产生危害和污 染，对玉米、小麦等农作物的增产效果尤为明显。
【附图说明】
[0019] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
[0020] 图1为基于放线菌的农作物种子浸种剂处理后玉米胚轴和胚根的生长状况图；其 中，CK为对照组玉米胚轴和胚根的生长状况图，D74为娄彻氏链霉菌无细胞发酵滤液处理后 玉米胚轴和胚根的生长状况图，SG为密旋链霉菌无细胞发酵滤液处理后玉米胚轴和胚根的 生长状况图；
[0021]图2为基于放线菌的农作物种子浸种剂处理后玉米幼苗根系的生长状况图；其中， CK为对照组玉米幼苗根系的生长状况图，D74为娄彻氏链霉菌无细胞发酵滤液处理后玉米 幼苗根系生长状况图，SG为密旋链霉菌无细胞发酵滤液处理后玉米幼苗根系的生长状况 图。
【具体实施方式】
[0022]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将 会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
[0023]试验方案：
[0024] -种基于放线菌的农作物种子浸种剂，其成分是放线菌的次级代谢产物，所述放 线菌为娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei )D74或密旋链霉菌（Streptomyces pactum) SG712100。其中，放线菌的次级代谢产物为放线菌无细胞发酵滤液，其制备方法为:挑取活 化好的娄彻氏链霉菌或密旋链霉菌斜面培养物，分别接种到高氏1号液体培养基中，28°C、 150r/min摇床振荡培养8d，用真空栗抽滤放线菌发酵液，然后在无菌条件下用0.45μηι灭菌 微孔滤膜过滤除菌，得无细胞发酵滤液。
[0025] 基于放线菌的农作物种子浸种剂的浸种方法，按照以下步骤进行:挑选饱满的农 作物种子，放入稀释倍数为100~1000倍的无细胞发酵滤液中，种子与稀释无细胞发酵滤液 的质量比为1:1.5，浸泡24h;弃去残留浸液，阴凉处干燥后播种。
[0026] 浸种结果：
[0027] (1)胚根胚轴生长：由图1及表1看出，用娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei)D74 或密旋链霉菌（Streptomyces pactum)SG712100(以下简称SG)的无细胞发酵滤液处理玉米 种子，其胚根长度、胚根数、须根数及胚轴长度均有增加。其中，D74无细胞发酵滤液稀释 1000倍处理可使玉米胚根长度、胚轴长度及须根数较对照分别增加43.4%、26.4%及 100.7% (P<0.05); SG发酵液稀释100倍处理可使玉米胚根长度、胚轴长度和须根数较对照 分别增加 36.3%、36.3%及117.5%(卩<0.05)。
[0028] 表1基于放线菌的农作物种子浸种剂浸种后玉米胚根和胚轴的长度和数量
[0029] (CK，对照;D74，娄彻氏链霉菌;SG，密旋链霉菌；Δ CK%，放线菌处理较对照CK的增 率）
L0031J 注：问列数据小问小与芋母表不差弁达到M者水平（P<0.05)。
[0032] (2)幼苗生长：由图2及表2沙培试验结果看出，用娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei )D74或密旋链霉菌（Streptomyces pactum)SG的无细胞发酵滤液浸泡玉米种子，可 促进玉米幼苗生长。其中，稀释倍数为100的SG无细胞发酵滤液处理后可使玉米幼苗总鲜 重、根系鲜重及地径分别较对照增加31.1 %、36.6%及20.3% (P<0.05)。稀释倍数为1000 的D74无细胞发酵滤液处理后可使玉米幼苗总鲜重、根系鲜重及地径较对照分别增加 20.1%、19.3%及13.9%，但差异除地径外均未达到显著水平(P>0.05)。
[0033]表2农作物种子浸种剂处理后沙培玉米幼苗的生物学特性
[0034] (CK，对照;D74，娄彻氏链霉菌;SG，密旋链霉菌；Δ CK%，放线菌处理较对照CK的增 率）
[0036] 注：同一处理下同列数据及对照后不同小写字母表示处理之间及与对照的差异达 到显著水平(P<〇.〇5)。
[0037] (3)生化特性：由表3看出，用不同稀释度的娄彻氏链霉菌（Streptomyces rochei) D74或密旋链霉菌（Streptomyces pactum)SG的无细胞发酵滤液处理玉米种子，可使玉米叶 片多酚氧化酶(PPO)活性显著增加(P<〇.05)，部分低稀释度处理叶片苯丙氨酸解酶(PAL) 及过氧化物酶(POD)活性与对照的差异也达到显著水平(P<0.05)，其中，D74原液（即稀释 倍数为〇)处理玉米种子可使玉米叶片的苯丙氨酸解酶(PAL)酶活较对照增加15.1% ;D74原 液（即稀释倍数为〇)、SG稀释10倍及1000倍处理玉米种子可使玉米叶片的多酚氧化酶(PPO) 酶活分别较对照增加40 · 2%、38 · 1 %及39 · 5% (P<0 · 05)。
[0038]表3农作物种子浸种剂处理后沙培玉米幼苗的叶片诱导酶活性
[0039] (CK，对照;D74，娄彻氏链霉菌;SG，密旋链霉菌；Δ CK%，放线菌处理较对照CK的增 率）
[0041] 注：同一处理下同列数据及对照后不同小写字母表示处理之间及与对照的差异达 到显著水平(P<〇.〇5)。
[0042] 本实施例是本发明基于放线菌的农作物种子浸种剂对玉米的促生情况，其对小麦 等其它农作物同样具有以上的作用效果。另外，本实施例的基于放线菌的农作物种子浸种 剂的有效成分为娄彻氏链霉菌D74或密旋链霉菌SG712100液体发酵时产生的次级代谢产 物，当基于放线菌的农作物种子浸种剂的有效成分成分中含有娄彻氏链霉菌D74和密旋链 霉菌SG712100的活性孢子时，其对促进农作物种子萌发和幼苗生长以及增产抗病的效果更 好。
[0043] 虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范 围。
【主权项】
1. 一种基于放线菌的农作物种子浸种剂，其特征在于，该农作物种子浸种剂的有效成 分是放线菌的次级代谢产物；其中，所述放线菌为类彻氏链霉菌（S化eptomyces rochei) D74或/和密旋链霉菌（Str巧tomyces pactum)SG712100。2. 根据权利要求1所述的基于放线菌的农作物种子浸种剂，其特征在于，所述类彻氏链 霉菌（Str巧tomyces rochei)D74的保藏号是CCTCC Μ 2016123,其 16S rDNA序列为：3. 根据权利要求1所述的基于放线菌的农作物种子浸种剂，其特征在于，所述密旋链 霉菌（Str巧tomyces pactum)SG712100的保藏号是CCTCCM 209066,其 16S rDNA序列为：4. 根据权利要求1所述的基于放线菌的农作物种子浸种剂的制备方法，其特征在于，挑 取活化好的类彻氏链霉菌或/和密旋链霉菌斜面培养物，接种到高氏1号液体培养基中，28 °C、150r/min摇床振荡培养8d，然后用真空累抽滤，再在无菌条件下用灭菌微孔滤膜过滤 除菌，得放线菌无细胞发酵滤液，即所述放线菌的次级代谢产物。5. 根据权利要求4所述的基于放线菌的农作物种子浸种剂，其特征在于，所述灭菌微孔 滤膜的孔径为0.45WI1。6. 根据权利要求4所述的基于放线菌的农作物种子浸种剂的浸种方法，其特征在于，按 照W下步骤进行:挑选饱满的农作物种子，放入稀释后的放线菌无细胞发酵滤液中，浸泡12 ~30h，弃去残留浸液，阴凉处干燥后播种。7. 根据权利要求6所述的基于放线菌的农作物种子浸种剂的浸种方法，其特征在于，所 述无细胞发酵滤液的稀释倍数为100~1000倍。8. 根据权利要求6所述的基于放线菌的农作物种子浸种剂的浸种方法，其特征在于，所 述农作物种子与所述稀释后的无细胞发酵滤液的质量比为1:1~1: 2。
【文档编号】A01N63/02GK105961439SQ201610356307
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】薛泉宏, 马军妮, 李玉龙, 来航线
【申请人】陕西博秦生物工程有限公司, 西北农林科技大学