耐高温β－葡萄糖苷酸酶基因及其获得方法

专利名称：耐高温β－葡萄糖苷酸酶基因及其获得方法
技术领域：
本发明涉及植物转基因中转化体筛选时用的报告基因，尤其是关于耐高温GUS基因序列及其获得方法。
在植物转基因中为了对转化材料进行筛选，标记基因和报告基因被逐渐选用。常用的报告基因是β-葡萄糖苷酸酶(bata-Glucuronidase，GUS)基因，绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因和冠瘿碱合成酶基因。1987年，Jefferson首次将GUS基因作为报告基因用于植物的遗传转化(JeffersonR A.，Mol Biol Rpt，1987，5387-405)。GUS的底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖苷酸脂(X-Gluc)使表达GUS基因的细胞显示蓝色。Hü等(余叔文，汤章城，植物生理学与分子生物学，科学出版社，198856-58)测定了包括被子植物和裸子植物在内的52种植物的内源GUS活性，发现对于所测的多种植物在营养阶段并不存在GUS活性，但是在大多数植物的果实、种皮、胚乳和胚中却有明显的GUS活性，随着种子的萌发，GUS基因的活性逐渐消失，因此在利用GUS基因作为报告基因时可有针对性地排除来自植物的假阳性。但是由农杆菌介导的遗传转化，其必不可少的一步是对转化材料进行除菌，否则GUS能够在农杆菌中进行表达，而除菌不彻底时，GUS假阳性就不可避免。为了克服GUS基因的假阳性，Vancanneyt等(Vancanneyt G et al.，Mol Gen Genet，1990，220(2)245-250)根据真核生物具有原核生物不具有的内含子剪切特性的原理，向GUS基因中引入了一段植物内含子，在农杆菌中没有检测到明显的GUS活性。含有内含子的GUS基因就成为更加有效报告基因。但它还存在缺点因为大多数植物的果实、种皮、胚乳和胚中有明显的GUS活性，这就成为植物转基因检测的障碍，又因为在农杆菌侵染转化的过程中，由于农杆菌的除菌不彻底，GUS假阳性很严重。从而极大地限制了植物转基因研究的发展。另外，底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡糖苷酸脂(X-Gluc)的价格一直居高不下，因为假阳性和本底的存在，必须加大底物的用量，从而又导致了转化成本的上升。
DNA突变(Shuffling)的含义为在与基因相关的DNA片段群体中，由于大量的随机片段相互参入而导致的重组或突变。随着PCR技术的发展和成熟，DNA Shuffling技术越来越成熟，应用越来越广泛，Stemmer在“DNAShuffling通过随机片段的重组，在体外导致分子进化”一文中具体阐述了DNA Shuffling的成熟技术路线，(Stemmer W P.，Proc natl Acad Sci，1994，91(22)10747-10751)，一基因经过DNA酶处理变成10到50bp的DNA随机短片段，然后经过两步PCR过程重新得到原来大小和有功能的基因，在重新获得基因过程中，产生大量的突变。从而称之为分子进化(Molecularevolution)。他还采用DNA Shuffling方法在很小的一个基因库中获得了β-内酰胺酶(β-lactamase)的一个突变基因，该基因的表达产量达640μg/ml，是当时任何报道最高水平的32000倍。Patel等(Patel R S.et al.，EMBO J，1987，6(9)2565-2572)在鼠纤连蛋白基因(rat fibronectin gene)编码的两个亚单元的纤连蛋白研究中，通过Shuffling的方法获得了一些新性状基因，其突变在基因中，甚至在启动子区域中也有较大的突变。
GUS组织化学染色法由于其严重的假阳性，又因为底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄苷酸脂(X-Gluc)的价格居高不下，从而严重地限制了植物转基因的发展，寻找和发掘新的更好、更快、更准确、更价廉物美的报告基因及其获得的方法愈显迫切。在获得新的报告基因工作的探索中，将上述基因突变技术应用于GUS基因的突变是一个很有意义的工作。
为此，本发明目的是提供一个新的报告基因——耐高温GUS基因，本发明另一目的是提供通过DNA突变及耐高温性筛选获得耐高温GUS基因的方法。
本发明提供一种耐高温GUS基因，该基因获得方法包括下列步骤(1)、通过DNA突变过程，包括GUS基因PCR扩增；GUS基因PCR产物用DNA酶降解得小片段；小片段进行无引物PCR扩增及取无引物PCR产物加入引物PCR扩增四步，获得GUS基因突变体。
(2)、将GUS突变基因构建成表达载体，经过耐高温性筛选，获得一个耐高温达85℃的耐高温GUS基因，并对耐高温GUS基因进行基因测序得到基因序列。
本

发明内容
详细叙述如下1、GUS基因的扩增与DNA突变过程根据(Clontech Laboratories，Inc.，GUS Gene Fusion System，PT1270-1Catalog#k1050-1)公布的GUS基因序列(见图1)，合成二个寡核苷酸引物，以质粒pBI121(从Clontech公司购得)——含有GUS基因的DNA为模板，扩增出PCR产物1.86kb的GUS基因片段，电泳结果见图2。回收的GUS基因片段以DNA酶进行降解，回收得小片段，电泳结果见图3，图3显示原来1.86kb条带降解为一片弥散的片段，透吸袋回收10-50bp的小片段，进行无引物PCR，扩增后产物电泳显示扩增片段为200-500bp的弥散条带，结果见图4。取无引物PCR产物加入引物进行PCR扩增，扩增后产物电泳显示扩增出单一的1.86kb基因片段，即为DNA突变后的GUS突变基因，电泳结果见图5。
2、GUS突变基因的原核表达载体的构建与耐高温性筛选回收的GUS突变基因片段经BamHI和SacI双酶切后，与原核表达质粒pYP200P(上海农科院生物中心植物基因工程研究室构建)构建成表达载体pYP200hGUS(构建过程见图6)。电击法转化入大肠杆菌菌株DH5α中，进行耐高温性的筛选。DH5α空菌株和含GUS基因的菌株在70℃处理15分钟后X-gluc染色，检测不到蓝色。而对突变后GUS基因转化子进行大规模的耐高温性筛选，首先得到了一个耐80℃高温30分钟的阳性克隆。以此为材料进行第二轮的DNA突变，从大量的转化子(约108)中再次筛选到一些耐高温达85℃的阳性克隆。将这些阳性克隆化学法转入大肠杆菌菌株DH5α中，进行再次鉴定，得到一些性状稳定的耐高温GUS基因克隆。
3、耐高温GUS基因的测序分析及蛋白质比较将性状稳定的耐高温GUS阳性克隆抽提质粒，进行GUS基因的全序列测定。共合成四条测序引物，经四次测序反应得到耐高温GUS基因的全长序列(序列见图8)。PC-GENE分析软件分析结果发现耐高温GUS基因序列同GUS基因相比同源性为99.2％，即1812个核苷酸中有11个位点发生了变化(见图9)。蛋白质分析发现，因为存在DNA遗传密码的简并性，其氨基酸序列的变化共有4个位点(见图10)，由于上述4个氨基酸的差异导致了耐高温GUS基因耐高温性的获得。
将耐高温GUS基因构建成表达载体，利用根癌农杆菌将外源基因与耐高温GUS基因一起对植物进行耐高温基因转化，获得在高温下染色显示阳性的转基因植株，这样耐高温GUS基因就可简便地应用于转基因植物转化体的筛选。
本发明优点由于耐高温的GUS基因的获得，使得利用耐高温GUS基因作为报告基因的转基因检测具有更准确、更精确、底物用量更少等优点。可以将被检测植株经过一段时间的高温(85℃，20分钟～1小时)处理，使得植株中内源GUS消失到几乎没有，极大地提高了转基因材料的检测效果。并且，将底物用量减少到原来的1/4，亦可以检测出明显的GUS活性，从而使得底物的用量大幅减少，大规模提高转基因的检测效率。
本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述。


图1是GUS基因序列。
图2是GUS基因PCR扩增产物的电泳图，图中1标准分子量2-6GUS基因PCR产物。
图3是GUS基因用DNA酶降解得小片段的电泳图，图中1标准分子量2-3小片段产物。
图4是小片段的无引物PCR扩增产物的电泳图，图中1标准分子量2-3小片段无引物PCR产物。
图5是GUS突变基因电泳图，图中1标准分子量2-5DNA突变后的GUS基因PCR产物。
图6是GUS突变基因的表达载体构建图。
图7是GUS基因扩增和测序引物。
图8是耐高温GUS基因的序列图。
图9是GUS基因和耐高温GUS基因的DNA核苷酸序列对照图。
图10是GUS蛋白和耐高温GUS蛋白的氨基酸序列对照图。
实施例1GUS基因的扩增和测序1.寡核苷酸引物合成及PCR扩增反应根据GUS基因序列(见图1)，合成2个PCR引物编号为GUSZ1、GUSF1，该寡核苷酸引物用于GUS基因的扩增。
GUSZ15’GAA，GAG，GAT，CCC，CGG，GTG，GTC，AG-3’GUSF15’-ACA，GAG，CTC，GAT，GGT，，GCG，CCA，GGA，GAG，TTG-3’另外，为了得到全长的GUS基因序列，合成了4个测序引物，它们分别位于载体、GUS基因的500、1000、1500bp处(参见图7)。
PUT15’-GAG，ACG，GTC，ACA，GCT，TGT，CTG-3’GUS188Z15’-ATT，CAG，GAA，GTG，ATG，GAG，CAT，C-3’GUS188Z25’-GCA，TCC，GGT，CAG，TGG，CAG，TG-3’GUS188Z35’-TCG，ACC，CGA，CGC，GTC，CGA，TCA，CC-3’在GUSZ1和GUSF1引物的5’端分别引入BamHI和SacI酶切位点，以利于克隆和构建。利用BECKMAN Oligo 1000M合成仪合成，并以PAGE纯化。
2、DNA序列测定采用双脱氧核苷酸终止法，用ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA测序试剂盒，在ABI 377型DNA自动化荧光测序仪上进行双链DNA序列测定，结果与图1相同。
实施例2 GUS基因的DNA突变(a)DNA突变过程1.GUS基因PCR扩增以pBI121质粒(从Clontech公司购得)为模板，GUSZ1、GUSF1为引物扩增，反应条件为(1)94℃10min预变性(2)94℃30s变性(3)72℃3.0min退火和延伸(2-3共30个循环)(4)72℃10min延伸PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶(Agrose)电泳，电泳检测图见图2。透吸袋法回收1.86kp的基因片段。
2.DNaseI降解GUS DNA得小片段回收GUS基因片段以100μl(50mmol/l Tris(PH7.4)＋1mmol/l MgCl2)溶解；加入0.1U DNase I，25℃，300rpm处理15分钟，70℃处理10分钟(失活DNA酶)。
经过10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(结果见图3)，透吸袋法回收10-50bp的小片段。沉淀用10ul 10×无引物PCR缓冲液(50m mol/l KCl＋10mmol/lTris.HCl PH9.0＋1％Triton)溶解。
3.小片段无引物PCR扩增进行无引物PCR扩增。反应体系为5μl小片段DNA＋4μl 2.5mmol/ldNTP＋4.5μl 25mmol/l MgCl2＋Taq plus 2U＋ddH2O至50μl；反应程序为(1)94℃40s预变性(2)94℃30s变性(3)41℃30s退火(4)72℃30s延伸(2-4共45个循环)(5)72℃5min延伸PCR扩增产物用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(见图4)，电泳显示扩增片段为200-500bp的弥散条带。
4.加入引物PCR扩增取无引物PCR产物加入引物进行PCR扩增反应。反应体系10μl无引物PCR产物＋GUSZ1 0.2ng＋GUSF1 0.2ng＋10×PCR缓冲液5μl＋2.5mmol/LdNTPs 4μl＋Taq Plus1U＋ddH2O至50μl。反应程序为(1)94℃40s预变性(2)94℃30s变性(3)70℃30s退火(4)72℃2.30min延伸(2-4共35个循环)(5)72℃10min延伸PCR扩增产物用1％Agrose电泳检测，显示得单一的1.86kp基因片段，即为DNA突变后获得的GUS突变基因，电泳结果见图5。完成一轮循环后，以所得PCR产物可以继续进行下一轮DNA突变。
实施例3 GUS突变基因的表达载体构建及高温耐性筛选按Sambrook分子生物学基本操作将GUS突变基因片段经BamHI和SacI双酶切后，构建入原核表达质粒pYP200P(由上海农科院生物中心植物基因工程研究室构建利用PCR扩增方法在tac启动子(Squartini A.，Gene1994，144(1)17-24)和T1-T2终止子(Ghosh B.，J Mol Biol.1991，222(1)59-66)两端加入相应的酶切位点，如引物所示。tac启动子两端的引物为Tac1(5’-ACGAATTCATATGAGCTGTTGACAATTAATC-3’)，Tac2(5’-AACTCGAGCCATGGCGGCCGCATATATCTCCTTCTTATATAGTTA-3’)，PCR扩增条件为94℃30S，58℃30S，72℃30S。
T1-T2终止子两端的引物为T1T2Z2(5’-ACCAAGATCTGGTACCGAGCTCGCTGTTTTGGCGGATGAG-3’)，T1T2F2(5’-GAGACCGCGGTCACCAAAAAGGCCATCCGTCAG-3’)，PCR扩增条件为94℃30S，56℃30S，72℃30S。
在pUT56载体(Leiting B.，Biochem Biophys Res Commun 1991，14；180(3)1403-1407)的NdeI-NcoI和BglII-SacII位点分别插入tac启动子和T1-T2终止子，即构建成pYP200P)中，得pYP200hGUS表达载体，(见图6)。再电击法转化大肠杆菌菌株DH5a，置于37℃ 2YT培养基上培养。待长出克隆后，影印至硝酸纤维素膜上，置于密封容器中高温(85℃，30分钟)处理。在将纤维素膜置于X-Gluc染色液中37℃染色，出现蓝色阳性克隆，即筛选得耐高温GUS克隆。
实施例4耐高温GUS基因的序列测定将得到的耐高温GUS阳性克隆从纤维素膜上小心剪下，放入eppendorf管中，加入10μldd H2O，96℃变性10分钟后，电击转化大肠杆菌菌株DH5a后，抽提转化子的质粒。经过酶切、PCR鉴定、序列测定得到耐高温GUS基因的序列，见图8。
权利要求
1.一种耐高温GUS基因，其特征在于具有如下的DNA核苷酸序列及所编码的氨基酸序列10 20 3040ATG TTA CGT CCT GTA GAA ACC CCA ACC CGT GAA ATC AAA AAA CTCMET Leu Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Arg Glu Ile Lys Lys Leu50 6070 80 90GAC GGC CTG TGG GCA TTC AGT CTG GAT CGC GAA AAC TGT GGA ATTAsp Gly Leu Trp Ala Phe Ser Leu Asp Arg Glu Asn Cys Gly Ile100 110 120 130GAT CAG CGT TGG TGG GAA AGC GCG TTA CAA GAA AGC CGG GCA ATTAsp Gln Arg Trp Trp Glu Ser Ala Leu Gln Glu Ser Arg Ala Ile140 150 160 170 180GCT GTG CCA GGC AGT TTT AAT GAT CAG TTC GCC GAT GCA GAT ATTAla Val Pro Gly Ser Phe Asn Asp Gln Phe Ala Asp Ala Asp Ile190 200 210 220CGT AAT TAT GCG GGC AAC GTC TGG TAT CAG CGC GAA GTC TTC ATAArg Asn Tyr Ala Gly Asn Val Trp Tyr Gln Arg Glu Val Phe Ile230 240 250 260 270CCG AAA GGT TGG GCA GGC CAG CGT ATC GTG CTG CGT TTC GAT GCGPro Lys Gly Trp Ala Gly Gln Arg Ile Val Leu Arg Phe Asp Ala280 290 300310GTC ACT CAT TAC GGC AAA GTG TGG GTC AAT AAC CAG GAA GTG ATGVal Thr His Tyr Gly Lys Val Trp Val Asn Asn Gln Glu Val MET320 330 340 350 360GAG CAT CAG GGC GGC TAT ACG CCA TTT GAA GCC GAT GTC ACG CCGGlu His Gln Gly Gly Tyr Thr Pro Phe Glu Ala Asp Val Thr Pro370 380 390 400TAC GTT ATT GCC GGG AAA AGT GTA CGT ATC ACC GTT TGT GTG AACTyr Val Ile Ala Gly Lys Ser Val Arg Ile Thr Val Cys Val Asn410 420 430 440 450AAC GAA CTG AAC TGG CAG ACT ATC CCG CCG GGA ATG GTG ATT ACCAsn Glu Leu Asn Trp Gln Thr Ile Pro Pro Gly MET Val Ile Thr460 470 480 490GAC GAA AAC GGC AAG AAA AAG CAG TCT TAC TTC CAT GAT TTC TTTAsp Glu Asn Gly Lys Lys Lys Gln Ser Tyr Phe His Asp Phe Phe500 510 520 530 540AAC TAT GCC GGA ATC CAT CGC AGC GTA ATG CTC TAC ACC ACG CCGAsn Tyr Ala Gly Ile His Arg Ser Val MET Leu Tyr Thr Thr Pro550 560 570 580AAC ACC TGG GTG GAC GAT ATC ACC GTG GTG ACG CAT GTC GCG CAAAsn Thr Trp Val Asp Asp Ile Thr Val Val Thr His Val Ala Gln590 600 610 620 630GAC TGT AAC CAC GCG TCT GTT GAC TGG CAG GTG GTG GCC AAT GGTAsp Cys Asn His Ala Ser Val Asp Trp Gln Val Val Ala Asn Gly640 650 660 670GAT GTC AGC GTT GAA CTG CGT GAT GCG GAT CAA CAG GTG GTT GCAAsp 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His1000 1010 1020 1030TAC CCT TAC GCT GAA GAG ATG CTC AAC TGG GCA GAT GAA CAT GCCTyr Pro Tyr Ala Glu Glu MET Leu Asn Trp Ala Asp Glu His Gly1040 1050 1060 1070 1080ATC GTG GTG ATT GAC GAA ACT GCT GCT GTC GGC TTT AAC CTC TCTIle Val Val Ile Asp Glu Thr Ala Ala Val Gly Phe Asn Leu Ser1090 1100 1110 1120TTA GGC ATT GGT TTC GAA GCG GGC AAC AAG CCG AAA GAA CTG TACLeu Gly Ile Gly Phe Glu Ala Gly Asn Lys Pro Lys Glu Leu Tyr1130 1140 1150 1160 1170AGC GAA GAG GCA GTC AAC GGG GAA ACT CAG CAA GCG CAC TTA CAGSer Glu Glu Ala Val Asn Gly Glu Thr Gln Gln Ala His Leu Gln1180 1190 1200 1210GCG ATT AAA GAG CTG ATA GCG CGT GAC AAA AAC CAC CCA AGC GTGAla Ile Lys Glu Leu Ile Ala Arg Asp Lys Asn His Pro Ser Val1220 1230 1240 1250 1260GTG ATG TGG AGT ATT GCC AAC GAA CCG GAT ACC CGT CCG CAA GGTVal MET Trp Ser Ile Ala Asn Glu Pro Asp Thr Arg Pro Gln Gly1270 1280 1290 1300GCA CGG GAA TAT TTC GCG CCA CTG GCG GAA GCA ACG CGT AAA CTCAla Arg Glu Tyr Phe Ala Pro Leu Ala Glu Ala Thr Arg Lys Leu1310 1320 1330 1340 1350GAC CCG ACG CGT CCG ATC ACC TGC GTC AAT GTA ATG TTC TGC GACAsp Pro Thr Arg Pro Ile Thr Cys Val Asn Val MET Phe Cys Asp1360 1370 1380 1390GCT CAC ACC GAT ACC ATC AGC GAC CTC TTT GAT GTG CTG TGC CTGAla His Thr Asp Thr Ile Ser Asp Leu Phe Asp Val Leu Cys Leu1400 1410 1420 1430 1440AAC CGT TAT TAC GGA TGG TAT GTC CAA AGC GGC GAT TTG GAA ACGAsn Arg Tyr Tyr Gly Trp Tyr Val Gln Ser Gly Asp Leu Glu Thr1450 1460 1470 1480CCA GAG AAG GTA CTG GAA AAA GAA CTT CTG GCC TGG CAG GAG AAAAla Glu Lys Val Leu Glu Lys Glu Leu Leu Ala Trp Gln Glu Lys1490 1500 1510 1520 1530CTG CAT CAG CCG ATT ATC ATC ACC GAA TAC GCC GTG GAT ACG TTALeu His Gln Pro Ile Ile Ile Thr Glu Tyr Gly Val Asp Thr Leu1540 1550 1560 1570GCC GGG CTG CAC TCA ATG TAC ACC GAC ATG TGG AGT GAA GAG TATAla Gly Leu His Ser MET Tyr Thr Asp MET Trp Ser Glu Glu Tyr1580 1590 1600 1610 1620CAG TGT GCA TGG CTG GAT ATG TAT CAC CCC GCC TTT GAT CGC GTCGln Cys Ala Trp Leu Asp MET Tyr His Arg Ala Phe Asp Arg Val1630 1640 1650 1660AGC CCC GTC GTC GGT 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2.权利要求1所述耐高温GUS基因的获得方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)通过DNA突变过程包括GUS基因PCR扩增；GUS基因PCR产物用DNA酶降解得小片段；小片段进行无引物PCR扩增；取无引物PCR产物加入引物；GUSZ15’-GAA，GAG，GAT，CCC，CGG，GTG，GTC，AG-3’GUSF15’-ACA，GAG，CTC，GAT，GGT，，GCG，CCA，GGA，GAG，TTG-3’进行PCR扩增，得长度为1.86kp的GUS突变基因；(2)、将GUS突变基因与表达质粒pYP200P构建成表达载体pYP200hGUS，转入大肠杆菌中进行耐高温性筛选，获得耐85℃的耐高温GUS基因克隆。
全文摘要
一种耐高温GUS基因,是通过DNA突变过程获得GUS突变基因,再构建成表达载体,转化入大肠杆菌中,进行耐高温性筛选获得的耐85℃的耐高温GUS基因克隆,并对耐高温GUS基因进行了序列测定,结果表明该耐高温GUS基因具有1812个核苷酸。耐高温GUS基因可简便地应用于转基因植物转化体的筛选,极大地提高转基因植株的检测效率,促进植物转基因研究的发展。
文档编号C12N15/70GK1338515SQ0011963
公开日2002年3月6日 申请日期2000年8月18日 优先权日2000年8月18日
发明者姚泉洪, 熊爱生, 彭日荷 申请人:上海市农业科学院生物技术研究中心