专利名称：与阴道感染有关的微生物的快速诊断的制作方法
技术领域：
本发明涉及往往引起妇女阴道感染的微生物的医学诊断。
据报导(美国家庭医生，1966，ACOG Releases Tech.Bull[on]Vaginitis，56(6)1-2)，由念珠菌(Candida spp.)引起的阴道炎，细菌性阴道炎以及毛滴虫属引起的阴道感染与阴道生态体系和阴道评价有关，明显的阴道炎是专科医师为妇女作基本的妇科治疗时遇到的最普遍问题，然而事实上由于一些因素，诊断是困难的。因为现有的许多药物是个人处方并由妇女个人使用，其影响诊断的准确性，所以疾病的治疗很复杂。传统的阴道炎诊断包括临床症状的分析和阴道液的试验室显微分析。当以显微技术检测念珠菌病和毛滴虫病时，显示出敏感度的下降，对于细菌性阴道炎来说解决这个问题较重要的是可能涉及不同的原因(Ferris，D.G.；Hendrich，J.；Payne，P.M.；Getts，A.；Rassekh，R.；Mathis，D.；Litaker，M.S.，1995.J.Fam.Pract，41(6)575-81)。
总之，用于阴道炎的诊断方法的报导分别对可能性原因的确定进行详细的描述。并且一般来讲，所报导的检测念珠菌病(欧洲专利申请EP094077，1996和EP556725，1993)、毛滴虫病(欧洲专利申请EP556685，1993)和加德纳菌属(欧洲专利申请EP400086，1990)的酶技术的可行性不强，所需要的试剂和设备价格昂贵并且对所述病种不能提供直接和快速的诊断。
只报导了一个更为完整的诊断方法，该方法采用核酸的夹心杂交技术来同步鉴定加德纳菌属，毛滴虫属和念珠菌属(PCT专利申请WO 9207096，1992)；其不方便之处表现在不能提供快速的诊断，需要设备和昂贵的材料，并且对获得的样品需要进行复杂的处理。
在所建议的解决办法中，将特异性抗体与抗上述病原体的乳胶微粒结合，以便进行用于快速诊断这三种微生物的同步和简单的凝集反应分析，这三种微生物的存在基本上决定了妇女患有阴道炎。这种诊断方法可用于自我医疗会诊，其对选择最合适的治疗起着重要的作用。
总之，本发明的一个方面是，发明的要点在于获得用于同步、快速和经济地诊断引发妇女阴道炎的三种基本病因的试剂盒和提供容易操作和保存的可行性标准。作为补充，还描述了有效使用的方法。
总体上来说，按照如下步骤获得所述试剂盒·制备用于获得免疫血清和阳性对照的抗原·免疫接种兔或公绵羊(rams)·纯化免疫球蛋白·获得结合的乳胶-球蛋白·制备阴性对照用于诊断的方法描述如下·用带有无菌棉的涂药器取阴道化验样品，放入装有0.5ml含盐的甘氨酸缓冲液的试管中，该缓冲液的pH值为8.4·剧烈摇动装有样品的试管·将20ml样品沉积在透明载玻片上·添加20ml的试剂乳胶-球蛋白·用塑料搅拌器搅匀·旋转载玻片3分钟·在黑背景上进行目测计数实施例实施例1对获得用于诊断盒的试剂的详细描述a.制备用于获得免疫血清和阳性对照的抗原在所有情况下，适当洗涤获得的细胞并进行药物裂解，测定蛋白浓度。
b.免疫接种兔或公绵羊通过在肢背侧区域和外侧区域进行皮内或肌内注射来免疫接种2-3kg重的新西兰白兔。在第21天进行记忆注射并在第28天抽取血液来滴定血清，滴度应高于1∶32。对于公绵羊，通过采用弗氏完全佐剂在体重接近45kg的6-9月大小的Pelibuey绵羊的背部进行皮内接种。在第21天肌内记忆注射不完全佐剂。在第42、63和75天以交替进行的皮内和肌内的方式重复进行记忆注射。滴定血清，结果应高于1∶64。
c.免疫球蛋白的纯化从具有适当滴度的血清开始，采用硫酸铵(35-40％)进行盐分级沉淀来进行纯化。
d.结合乳胶-球蛋白的获得对经盐沉淀纯化的G型-免疫球蛋白进行稀释，然后进一步与0.1ml的10％(每ml)的乳白色乳胶微粒结合，该乳胶微粒的直径为0.8μm。将结合作用在pH值为8.4、温度为35-38℃的甘氨酸缓冲液中进行。用牛白蛋白(0.5-2％)、酪蛋白(0.03-1％)或尿素(0.05-1.5M)进行封闭反应，加入稳定剂和0.1％的叠氮化钠作为保存剂。最后，结合物中的乳胶浓度为1％。选择较高的结合物稀释度，即在该稀释度下在少于3分钟的时间内检测到106或低于106个细胞/ml。
阴性对照由pH值为8.4的含盐甘氨酸缓冲液组成。
实施例2诊断方法的详细描述●用带有无菌棉的涂药器取阴道化验样品，放入装有0.5ml含盐的甘氨酸缓冲液的试管中，该缓冲液的pH值为8.4●剧烈摇动装有样品的试管●将20μl样品沉积在透明载玻片上●添加20μl的试剂乳胶-球蛋白●用塑料搅拌器搅匀●轻轻旋转载玻片3分钟●在黑背景上进行目测计数。
阳性试验与样品混合后3分钟，观察到有类似于阳性对照的细小乳胶凝集出现。
阴性试验与样品混合后3分钟，没有与阴性对照类似的凝集出现。
实施例3评估通过抗-白色念珠菌、抗-阴道毛滴虫和抗-阴道加德纳菌的免疫球蛋白致敏的乳胶的质量指标。
下列列联表提供了通过采用快速诊断和使用相应的参考技术从检测盒获得的质量指标。
表1.基于2×2列联表的用于抗阴道毛滴虫的快速乳胶-球蛋白技术的质量指标培养物阳性阴性 总值阳性 a(vp) b(fp) a+b乳71 7 78阴性 c(fn) d(vn) c+d胶3 863866总值 a+c b+da+b+c+d＝N74 87071+7+3+863＝944 列联表说明真阳性(vp)假阳性(fp)假阴性(fn)真阴性(vn)表2.基于2×2列联表的用于诊断阴道毛滴虫的直接显微镜观察方法的质量指标培养物阳性 阴性 总值阳性 a(vp)b(fp)a+b直 62 264阴性 c(fn)d(vn)c+d接 13 867 880总值 a+c b+d a+b+c+d＝N75 869 62+2+13+867＝944 表3.基于2×2列联表的用于抗白色念珠菌的快速乳胶-球蛋白技术的质量指标培养物阳性 阴性 总值阳性a(vp) b(fp)a+b乳 12718 145阴性c(fn) d(vn)c+d胶 10 445 445总值a+cb+d a+b+c+d＝N137463 127+18+10+445＝600 表4.基于2×2列联表的用于诊断白色念珠菌的直接显微镜观察法的质量指标培养物阳性 阴性 总值阳性 a(vp)b(fp) a+c直 84 111195阴性 c(fn)d(vn) c+d接 53 352405总值 a+c b+da+b+c+d＝N137 46384+111+53+352＝600 表5.基于2×2列联表的用于抗阴道加德纳菌的快速乳胶-球蛋白技术的质量指标培养物阳性阴性 总值阳性a(vp) b(fp) a+b乳 27 26 53阴性c(fn) d(vn) c+d胶 2 150152总值a+c b+da+b+c+d＝N29 17627+26+2+150＝205 表6.基于2×2列联表的用于诊断阴道加德纳菌的直接显微镜观察方法的质量指标培养物阳性 阴性总值阳性 a(vp) b(fp) a+c直 21 16 37阴性 c(fn) d(vn) c+d接 9 148 160总值 a+cb+d a+b+c+d＝N33 164 21+16+9+148＝205
权利要求
1.用于妇女阴道炎诊断的方法，其中采用试剂盒通过凝集技术同时进行念珠菌、阴道毛滴虫和阴道加德纳菌的检测，并且其中将样品和相应的对照与乳胶-球蛋白特异性结合物进行接触。
2.如权利要求1所述的方法，其中抗念珠菌、阴道毛滴虫和阴道加德纳菌的结合物乳胶-球蛋白通过以下方法获得将水溶液中的0.8μm的聚苯乙烯乳胶与经盐沉淀纯化的公绵羊G型-免疫球蛋白在温度为35-38℃、pH值为8.4的甘氨酸缓冲液中结合；以0.5-％的牛白蛋白、0.03-1％的酪蛋白或0.05-1.5M尿素作为封闭剂，保持结合物中的乳胶浓度为1％，其提供了一个106UFC/ml的检测极限值。
3.如权利要求1所述的方法，其中用于诊断妇女阴道炎的试剂盒是一种抗念珠菌的乳胶-lgG特异性结合物、抗阴道毛滴虫的乳胶-lgG和抗阴道加德纳菌的乳胶-lgG的试剂复合物；以公绵羊自身lgG乳胶结合物作为阴性对照；念珠菌、阴道毛滴虫和阴道加德纳菌的失活细胞经超声处理并将浓度分别调到106个细胞来作为阳性对照；pH7的甘氨酸缓冲液作为阴性对照的补充。
4.用于妇女阴道炎诊断的试剂盒，其为一种抗念珠菌的乳胶-lgG特异性结合物、抗阴道毛滴虫的乳胶-lgG和抗阴道加德纳菌的乳胶-lgG的试剂复合物；以公绵羊自身lgG乳胶结合物作为阴性对照；念珠菌、阴道毛滴虫和阴道加德纳菌的失活细胞经超声处理并将浓度分别调到106个细胞来作为阳性对照；pH7的甘氨酸缓冲液作为阴性对照的补充。
全文摘要
本发明涉及一种用于快速和同步测定阴道化验样品中的念珠菌、阴道毛滴虫和阴道加德纳菌的方法和试剂盒,其起始于与乳胶微粒发生凝集反应的分析。基于抗原－抗体反应的免疫学原理的该方法包括相应抗体的获得,它们的纯化和进一步与乳胶微粒的结合。作为简易试剂盒,操作简单使得在个人诊断过程中,三分钟内便可得到非常可靠结果。
文档编号C12Q1/04GK1355320SQ0013104
公开日2002年6月26日 申请日期2000年11月24日 优先权日2000年11月24日
发明者E·A·罗德里格兹, M·B·A·卡斯特拉诺斯, I·E·卡斯塔诺, I·M·罗德里格兹, M·G·皮尔兹 申请人:国家动植物保健中心