专利名称：一种口蹄疫dna疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药生物技术领域，是一种口蹄疫DNA疫苗。
背景技术：
口蹄疫是一种分布广、严重危害偶蹄兽，威胁人类健康，对畜牧业生产及畜产品贸易影响极大的疾病，被列为A类烈性传染病。口蹄疫疫苗是预防口蹄疫的重要手段，目前应用的口蹄疫灭活疫苗虽然具有很好的预防同型口蹄疫感染的效果，但不能有效地预防多种不同血清型口蹄疫的感染，而且免疫持续时间短，导致保护效果不甚理想。DNA疫苗，是近年兴起的新型疫苗，具有抗体效价维持时间长和交叉保护效果好等优点。此外DNA疫苗还具有以下突出优点(1)能诱发体液及细胞全方位免疫应答，起到预防作用；(2)能将免疫佐剂CpG序列整合入DNA疫苗内，提高机体的免疫应答水平而无需另加佐剂；(3)生产工艺简单、成本低廉、稳定性好且贮运方便。
DNA疫苗的作用机理为将合成的口蹄疫抗原基因重组入真核表达质粒载体，注射于肌肉组织，使其在肌细胞中表达口蹄疫抗原表位，经过抗原提呈过程，可激活体内的体液免疫系统和细胞免疫系统。激活的体液免疫系统可产生特异的抗体，消除游离在血液中的病毒，预防口蹄疫的入侵；而激活的细胞免疫系统可产生细胞毒淋巴细胞(CTL)，攻击已被感染的细胞，消除隐藏的口蹄疫病毒。
发明内容
本发明采用O型口蹄疫病毒中和抗原表位基因构建口蹄疫DNA疫苗。
口蹄疫病毒的中和抗原表位是刺激机体产生中和抗体的重要保护性抗原成分，位于口蹄疫病毒衣壳。本发明所采用的是猪特有的O型口蹄疫病毒，将中和表位基因进行设计并合成，再将其插入真核表达载体pVAX1，构建成口蹄疫DNA疫苗pVAX-SG。
本发明用以构建真核表达载体的基本骨架为pVAX1(购自Invitrogen公司，序列和物理图谱见该公司的产品目录)；构建过程以及制备过程中，质粒扩增所用的宿主菌为DH5α(购自GIBCO公司)；插入的外源基因为猪特有的O型口蹄疫病毒衣壳蛋白中和抗原表位基因，其结构描述如下(1)O型口蹄疫的中和抗原表位基因a)序列特征长度501bp类型核酸链数双链几何结构线性b)分子类型DNAc)来源基因合成。
d)序列描述SGATGGTCACCA GTGACTCATT CGGACGTTGC GGTGGAGGTG GCTCTATCCA AAAGGGCGGT GGAGGATCCCGCTTCGAGGG TGGCGGTGGA TCCGGCGAAA CACAGATCCA GAGGCGCCAA CACACGGACG TCTCGTTCATCATGGACAGA TTTGTGAAGG TGACACCGCA AAACCAAATT AACATTTTGG ACCTCATGCA GATTCCATCACACACTGGGG GTGGAGGCTC GAGTAAGTAC TCCGCAGGTG GTATGGGCAG ACGGGGCGAC CTAGAGCCTCTCGCGGCGAG GGTCGCCGCT CAGCTTCCTA CTTCTTTCAA CTTTGGTGCA ATTGGTGGCG GAGGCTCGAGTAGACACAAA CAGAAAATTG TGGCACCGGT GAAACAGACT TTGGGAGGCG GTGGGAGCTC CAGGTACAACAGAAATGCTG TGCCCAACTT GAGAGGTGAC CTTCAGGTGT TGGCTCAAAA GGTGGCACGG ACGCTGCCTGGGAGCTCCTA A口蹄疫的表位基因采用PCR全基因合成的方式进行，该方法的大致流程为根据设计的基因序列合成单链并设计相应PCR引物，然后以单链DNA为模板，PCR扩增相应的基因片段，再将扩增产物克隆测序即可。具体方法及其反应体系参见《分子克隆》(科学出版社，1992年出版)相关章节。
图1含SG抗原基因的质粒图谱图2DNA疫苗pVAX-SG的构建流程3DNA疫苗pVAX-SG在BALB/c小鼠体内的表达量曲线图4DNA疫苗pVAX-SG诱发小鼠血清抗体效价的时间曲线
具体实施例方式下面结合附图，对本发明的制备方法及作用进行详细描述。
一、DNA疫苗pVAX-SG的结构、构建及制备本DNA疫苗的结构是以真核表达载体——PVAX1为骨架的重组质粒DNA分子，大体结构见图1。全长3.5kb(千碱基对)，除含有pMB1 ori质粒复制起始位点、卡那霉素抗性基因Kanamycin等元件外，还包含了一个完整的真核转录翻译单元。真核转录翻译单元含有真核转录翻译所必需的元件真核巨细胞病毒启动子Pcmv、相应的编码基因SG及3′端的多聚腺苷酸BGH pA。总体上说，本疫苗是一个可在真核细胞中表达SG抗原并可激活淋巴细胞的重组质粒DNA。
1、构建工程菌DH5α(pVAX-SG)(见图2)对O型口蹄疫合成基因SG用EcoR I/Xba I双酶切，电泳回收519bp的目的片段(含酶切位点)。同时以EcoR I/Xba I双酶切载体pVAX1，电泳回收载体大片段，将以上两片段连接成pVAX-SG质粒。用CaCl2法转化大肠杆菌DH5α，筛选获得阳性重组子，即获含有重组质粒pVAX-SG的工程菌DH5α(pVAX-SG)。(具体反应体系及实验方案参见前述《分子克隆》相关内容)2、制备DNA疫苗pVAX-SG本发明DNA疫苗用上述工程菌株DH5α(pVAX-SG)制备。培养扩增及精制可通过常规的细菌培养、质粒扩增和纯化方法进行(详见前述《分子克隆》相关内容)。
培养方式一般为液体培养。少量扩增时可用空气摇床振荡培养；工业性生产时需用细菌发酵罐行高密度悬浮通气培养。对培养基中的培养源无特殊的要求，一般用LB液体培养基，如需高密度培养，则可选用2×YT(含1.6％胰蛋白胨、1％酵母提取物和0.5％氯化钠，pH7.0)或SOC液体培养基(含2％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.05％氯化钠、20mmol/L葡萄糖、2.5mmol/L KCl、10mmol/L MgCl2、pH7.0)。必要时也可添加动、植、矿物油等作为消泡剂。培养温度一般为37℃，培养时间及收集细菌的时机决定于培养基、培养方式以及通气量条件的设置。
从扩增后的工程菌中分离纯化质粒DNA，可采用一些常规的方法。例如可用去垢剂SDS裂解菌体，利用质粒DNA和染色体DNA变复性特征的差异，通过对DNA的变性和复性的处理，将质粒DNA和染色体DNA分开；再利用质粒DNA与杂质在溶解度、离子结合力、吸附亲和力等方面的区别进行进一步的纯化，并去除内毒素。具体地说，存在于复性液中的质粒DNA经过脱盐处理后，可用阴离子交换树脂(如DEAESepharose)进行交换，然后用TE(含10mmol/L Tris和1mmol/L EDTA、pH8.0)缓冲液洗脱，即可制得高纯度的质粒DNA(具体见实施例)。经PBS稀释分装，即可获得透明澄清的本发明DNA疫苗纯品。本品理化性质十分稳定，可于常温下保存与运输，使用前，用注射用水溶解即可。
二、DNA疫苗pVAX-SG的功能检测1、本DNA疫苗的体外表达及检测，是将所构建的DNA疫苗通过电穿孔法转染COS7细胞，72小时后收获细胞，以间接ELISA法检测培养上清及细胞破碎液中SG抗原的表达水平，结果表明有表达，说明本发明DNA疫苗确可在哺乳动物细胞中表达。(详见后面的实验1)2、本DNA疫苗的体内表达及检测，是将获得的DNA疫苗纯品免疫小鼠后，用ELISA法检测血清中的抗原水平(见图3)。结果表明本DNA疫苗免疫动物后，可表达SG抗原。(详见后面的实验2)3、本DNA疫苗诱发机体产生体液免疫应答水平的检测，是将获得的DNA疫苗纯品免疫小鼠后，以ELISA法检测血清中抗口蹄疫抗体的水平。结果DNA疫苗组可以在很长时间内维持较高水平的抗体效价，而作为对照组的灭活疫苗(购自中国农业科学院兰州兽医研究所)抗体效价自3月起则下降，亚单位疫苗组抗体效价比DNA疫苗高，但是抗体效价从3月起即开始下降(见图4)。(详见后面的实验3)本发明能有效地诱发小鼠的免疫应答反应，说明其对动物的口蹄疫病毒感染有一定免疫保护作用；且生产工艺简单，成本低廉，理化性质稳定、便于储存和运输。
使用本发明的工程菌制备口蹄疫DNA疫苗的实施例从-80℃冰箱中取出冻存的工程菌株——DH5α(pVAX-SG)，于室温融化后，用接种环蘸取少量菌液划线接种于1.5％的LB琼脂平板(含卡那霉素50μg/ml)上，37℃培养过夜后，取单克隆接种于50ml LB液体培养基(含1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％氯化钠，卡那霉素50μg/ml，pH7.0)中，37℃振荡培养40小时，作为种子液。按1∶20的比例将种子液接种于1升SOC液体培养基中(在前述成分的基础上，另含卡那霉素50μg/ml)，于37℃剧烈振摇培养25小时；加氯霉素至终浓度为170μg/ml，于37℃剧烈振摇继续培养16小时。将菌液于4℃以6000rpm离心10分钟；去上清，将菌体重悬于30ml的碱裂解法的溶液I(含50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris.Cl、10mmol/L EDTA pH8.0)中加溶菌酶40mg，加60ml溶液II(0.2mol/L NaOH和I％SDS)，缓慢颠倒5次混匀，室温放置5分钟。加45ml冰预冷的溶液III(含钾离子3mol/L、乙酸根5mol/L)，缓慢颠倒数次混匀，冰浴10分钟；于4℃以10000r/m离心10分钟，取上清，过500ml G25柱除盐后，上20ml DEAE Sepharose阴离子交换柱，待结合吸附完毕后，按盐离子(Cl-)浓度从低到高(0～1mol/L)渐进的梯度洗脱法，用10个柱体积的PBS(pH8.0)和氯化钠溶液缓慢清洗阴离子交换柱，收集260nm处吸收峰的洗脱液，得到DNA疫苗的粗品。然后进一步纯化，加2倍体积的无水乙醇沉淀，12000rpm 4℃离心10分钟，去上清，用70％的乙醇漂洗凉干后，溶于PBS(pH8.0)溶液中，即得本发明DNA疫苗的纯品；用紫外分光光度法定量后，再按每份200μg/ml分装制成成品。
本发明的预防接种方案是用成品1ml肌肉注射即可，剂量为每头仔猪200μg。10天后追加免疫一次，即可获得较强免疫应答反应。如与亚单位疫苗联合治疗则效果更佳。
实验1 DNA疫苗的体外表达及检测用电穿孔的方法将质粒转入COS7细胞，穿孔条件为电容960μF，电压为250V，质粒40μg，COS7细胞浓度为1×107/ml，时间为16.7 同时设空载体pVAX1的对照，72小时后收获细胞。以间接ELISA法检测SG抗原在COS7细胞上清和细胞裂解液中的表达情况，将细胞培养上清和细胞裂解液分别包被96孔酶联板，一抗为小鼠抗口蹄疫血清(以购自中国农业科学院兰州兽医研究所的口蹄疫疫苗按照常规方法免疫小鼠制得)，二抗为羊抗鼠-HRP(购自华美生物工程有限公司)。显色后，以P/N比值大于1.8为阳性，结果SG抗原在COS7细胞中得到了表达，培养上清和细胞裂解液均为阳性。说明本DNA疫苗在COS7细胞中可以表达。
实验2 免疫接种后体内的抗原水平检测试验4～6周龄的雌性BALB/c小鼠40只，随机分成4组，每组10只，第1组免疫本发明DNA疫苗(每只接种200μg)，第2、3组为PBS或pVAX1阴性对照。将DNA 200μg经胫前肌注射给1组小鼠，2组小鼠则接种等体积PBS或pVAX1。于注射当日注射前和注射后第2、4、6、8、10天经眼眶取血，分离血清后一并检测DNA在血清中的表达情况。
以间接ELISA法检测血清中SG的水平，将小鼠血清1∶10稀释后包被96孔酶联板，一抗为猪抗口蹄疫血清(购自中国农业科学院兰州兽医研究所)，二抗为兔抗猪-HRP(购自华美生物工程有限公司)。阴性对照为未注射疫苗的空白小鼠血清。显色后，以l、2、3组检测孔分别与空白小鼠检测孔的OD450比值P/N＞1.5为阳性。结果见图3。
从图中可以看出，疫苗在小鼠体内所检测到的抗原水平在第2天最高，以后逐渐下降，到第10天时，为弱阳性。
实验3 DNA疫苗诱发机体产生体液免疫应答水平的检测为比较DNA疫苗pVAX-SG体液免疫应答的维持时间，将BALB/c小鼠随机分为5组，每组10只，第1组为DNA疫苗组，每只小鼠注射pVAX-SG疫苗200μg，第2组为灭活疫苗组(购自中国农业科学院兰州兽医研究所)，每只小鼠皮下注射灭活苗10μl，第3组为亚单位疫苗组，每只小鼠注射蛋白10μg(亚单位疫苗制备方法含融合表达质粒GST-SG的菌种，经IPTG诱导后超声破碎，用GST纯化融合蛋白，溶于PBS。)，第4组为PBS对照组。在注射的当天和注射后的两个月内每2周取血1次，2个月以后每月取血一次，眼眶取血。观察至1年。以间接ELISA法检测血清中抗口蹄疫的抗体水平，以纯化的GST-SG包被酶联板，加入待检的血清后，再加入HRP标记的兔抗小鼠IgG二抗(购自华美生物工程有限公司)，显色反应后在450nm波长下测定光密度值，以P/N大于2为阳性。
结果DNA疫苗组可以在很长时间内维持较高水平的抗体效价，灭活疫苗抗体效价自3月起则明显下降；亚单位疫苗组抗体效价比DNA疫苗高，但是抗体效价从3月起即开始下降。(见图4)以上实验结果可以证明，本发明DNA疫苗pVAX-SG能有效地诱发小鼠的免疫应答反应，说明其对动物的口蹄疫病毒感染有一定免疫保护作用；且生产工艺简单，成本低廉，理化性质稳定、便于储存和运输。
口蹄疫DNA疫苗pVAX-SG的抗原基因SG核苷酸序列如下ATGGTCACCA GTGACTCATT CGGACGTTGC GGTGGAGGTG GCTCTATCCA AAAGGGCGGT GGAGGATCCCGCTTCGAGGG TGGCGGTGGA TCCGGCGAAA CACAGATCCA GAGGCGCCAA CACACGGACG TCTCGTTCATCATGGACAGA TTTGTGAAGG TGACACCGCA AAACCAAATT AACATTTTGG ACCTCATGCA GATTCCATCACACACTGGGG GTGGAGGCTC GAGTAAGTAC TCCGCAGGTG GTATGGGCAG ACGGGGCGAC CTAGAGCCTCTCGCGGCGAG GGTCGCCGCT CAGCTTCCTA CTTCTTTCAA CTTTGGTGCA ATTGGTGGCG GAGGCTCGAGTAGACACAAA CAGAAAATTG TGGCACCGGT GAAACAGACT TTGGGAGGCG GTGGGAGCTC CAGGTACAACAGAAATGCTG TGCCCAACTT GAGAGGTGAC CTTCAGGTGT TGGCTCAAAA GGTGGCACGG ACGCTGCCTGGGAGCTCCTA A
权利要求
1.一种口蹄疫DNA疫苗，包括真核表达载体和抗原基因SG，其特征在于所用的抗原基因SG来源于猪特有的O型口蹄疫病毒，其核苷酸序列如下ATGGTCACCA GTGACTCATT CGGACGTTGC GGTGGAGGTG GCTCTATCCA AAAGGGCGGTGGAGGATCCC GCTTCGAGGG TGGCGGTGGA TCCGGCGAAA CACAGATCCA GAGGCGCCAACACACGGACG TCTCGTTCAT CATGGACAGA TTTGTGAAGG TGACACCGCA AAACCAAATTAACATTTTGG ACCTCATGCA GATTCCATCA CACACTGGGG GTGGAGGCTC GAGTAAGTACTCCGCAGGTG GTATGGGCAG ACGGGGCGAC CTAGAGCCTC TCGCGGCGAG GGTCGCCGCTCAGCTTCCTA CTTCTTTCAA CTTTGGTGCA ATTGGTGGCG GAGGCTCGAG TAGACACAAACAGAAAATTG TGGCACCGGT GAAACAGACT TTGGGAGGCG GTGGGAGCTC CAGGTACAACAGAAATGCTG TGCCCAACTT GAGAGGTGAC CTTCAGGTGT TGGCTCAAAA GGTGGCACGGACGCTGCCTG GGAGCTCCTA A
2.按权利要求1所述的口蹄疫DNA疫苗，其特征在于所说的真核表达载体为pVAX1。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域,是一种口蹄疫DNA疫苗。它是采用猪特有的O型口蹄疫的合成表位基因SG为抗原基因,以pVAX1为表达载体构建的。SG序列为:ATGGTCACCA GTGACTCATT CGGACGTTGCGGTGGAGGTG GCTCTATCCA AAAGGGCGGTGGAGGATCCC GCTTCGAGGG TGGCGGTGGA TCCGGCGAAACACAGATCCA GAGGCGCCAA CACACGGACG TCTCGTTCATCATGGACAGA TTTGTGAAGG TGACACCGCA AAACCAAATTAACATTTTGG ACCTCATGCA GATTCCATCA CACACTGGGGGTGGAGGCTC GAGTAAGTAC TCCGCAGGTG GTATGGGCAGACGGGGCGAC CTAGAGCCTC TCGCGGCGAG GGTCGCCGCTCAGCTTCCTA CTTCTTTCAA CTTTGGTGCA ATTGGTGGCGGAGGCTCGAG TAGACACAAA CAGAAAATTG TGGCACCGGTGAAACAGACT TTGGGAGGCG GTGGGAGCTC CAGGTACAACAGAAATGCTG TGCCCAACTT GAGAGGTGAC CTTCAGGTGTTGGCTCAAAA GGTGGCACGG ACGCTGCCTG GGAGCTCCTAA
文档编号C12N15/79GK1367021SQ01132249
公开日2002年9月4日 申请日期2001年11月20日 优先权日2001年11月20日
发明者孙树汉, 张洪英, 郭瀛军, 陈祖欢 申请人:中国人民解放军第二军医大学