专利名称：植物细胞培养基及使用培养基培养植物细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种植物细胞的培养基，尤其是植物模式细胞的培养基；以及使用该培养基制备植物细胞、特别是植物模式细胞的方法。
传统的培养方法有两种，一种是土壤培养，一种是水培。
土壤培养能使植物形成根毛，但长度一般不足0.3mm，并且作为培养基质的土壤通常难以与根毛细胞分离，就基质与根细胞的分离来说，水培是最为方便的方法。
水培方法是植物科学研究中最基本的培养技术之一。是继李比西的矿质营养学说诞生之后，于1860年由德国学者Sachs和Knop用其发明的营养配方用水培方法培养植物获得成功，并相继证明N、P、K、Ca、Mg、S等为植物的必需营养元素后发展起来的一种方法。后来，随着技术的进步，化学试剂纯度的提高，至1954年科学家先后证明Fe、Mn、Cu、B、Zn、Mo和Cl也是植物的必需营养元素，加上光合作用证明C、H、O是植物的必需元素，至此，植物共需16种必需营养元素。1987年美国科学家进一步证明Ni是植物所必需的超微量元素。以上这些都是运用水培方法的实践基础。尽管水培技发明于140多年前，但因营养配方设计的出发点就是为所培养植物提供全部有效养分，确保“大水大肥”，这与植物生长的自然条件——土壤溶液有着本质的区别水培营养液养分的有效浓度高，但没有缓冲性，而土壤溶液虽然养分的有效浓度低，但有很强的缓冲性。所以Weatherley和Pitman(Weatherley，P.E.，Encyclopediaof Plant Physiology 12 APhysiological Plant Ecology II，Lange，O.L.，Nobel，P.S.，Osmomd，C.B.And Ziegler，H.，P103～105，Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York，1982。Pitman，M.G.，Anderson，W.P.AND Luttge，U.，Encyclopediaof Plant Physiology 2 BTransport in Plants II，Luttge，U.And M.G.Pitman.，P57～69，Springer-Verlag Berlin HeidelbergNew York，1976)等人认为植物在水培条件下几乎不形成根毛，Ridge和Hofer(Ridge，Robert W.，Plant RootsThe Hidden Half，eds Waisel，Y.，Eshel，A.，Kafkafi，U.，P 127～147，MarcelDekker，Inc.，New York，1996。Rose-Marie Hofer.，Plant RootsThe Hidden Half，eds Waisel，Y.，Eshel，A.，Kafkafi，U.，P111～126，Marcel Dekker，Inc.，New York，1996)等人甚至断言，在水培条件下，玉米等作物100％不能形成根毛，即完全不能形成模式细胞，而在土壤条件下则能形成根毛。
因此，目前这两种方法常常难以获得理想的模式细胞。而在水培技术中，要像土培一样使水培溶液中的养分具有缓冲性以培养出理想的模式细胞是植物科学家一直在追求解决而未能解决的问题。
本发明还提供一种使用上述培养基制备植物细胞特别是植物模式细胞的有效方法。
本发明描述了一种植物细胞培养基，含有1.0nM～6.0mM钙盐，1.0nM～6.0mM硝酸盐，两者的浓度分别按钙离子和硝酸根计，和1.0ng～5.0g/L水难溶性磷酸盐。优选地，钙盐为CaCl2·2H2O，硝酸盐为NaNO3，磷酸盐为Ca3(PO4)2或FePO4。
本发明所述的培养基还可含有1.0nl～10.0ml 3％H2O2/L或相应量浓度的其他过氧化物，如过氧化钠或过氧化钾等。
任选地，本发明所述的培养基还可含有1.0nM～8.0mM MgSO4·7H2O，1.0nM～200.0μM FeSO4·7H2O，1.0nM～200.0μM EDTA(乙二胺四乙酸)，1.0nM～40.0μM MnCl2·4H2O，1.0nM～12.0μM(NH4)6Mo7O24·4H2O，1.0nM～20.0μM ZnSO4·7H2O，1.0nM～40.0μM H3BO3，1.0nM～20.0μM CuSO4·4H2O，1.0nM～6.0mM(NH4)2SO4，，1.0nM～3.0mM Na2SiO3，1.0nM～5.0mM K2SO4。
本发明制备植物细胞特别是植物模式细胞的方法是使用本发明的培养基进行培养。优选地，在培养过程中间隔地，例如每日向培养基中加入上述配方中的过氧化物如过氧化氢、过氧化钾或过氧化钠，或者对水培液进行通气或用其他方法使培养基溶氧量增加。
本发明培养基的营养配方，能极好地模拟土壤溶液中磷等养分低浓度、高缓冲性的特点，不仅小麦、小黑麦等植物能形成长达3mm的根毛，而且已被断言100％不能形成根毛的玉米也能形成又长又密的根毛。这在科学上取得了新的突破，尤其是证明了控制玉米根毛发生的基因在传统水培方法下完全不能表达，但用本发明的技术进行培养，则玉米的根毛基因能100％地超常表达。这为分子生物学研究，以及转基因研究中，新基因的表达检测提供了新的思路和技术方法。根据实验，在水培条件下，本发明的技术能使小麦、小黑麦、玉米、拟南芥、白三叶草和百脉根等植物的根系形成从头到脚长达1-3mm的又长又密根毛，形同刺猬一般，故称为“刺猬根”。
此外，本发明培养基的营养配方还具有如下优点1.能形成持续而稳定的低水溶性磷营养缓冲环境2.培养液的pH基本接近中性
3.能使植物形成长寿命的超长致密根毛4.营养配方组成简单5.无需经常更换培养液6.营养液无需进行通气处理7.操作便利。
为了更进一步地说明本发明，下面给出实施本发明的具体方式和实施例，但这不得解释为对本发明的限制。
1、培养基的制备将化学试剂按实施例的配方溶于水中，即可制得本发明的培养基。
实施例中的试剂都是分析纯以上级别，可从化学试剂商店买到。水为纯净水或蒸馏水即可。
2、培养方法在光照强度为50 000 Lux左右的植物生长箱或5～10月在自然太阳光照条件下，温度维持在25～35℃左右。将植物种子放置在培养皿中浸种催芽，待根系长3cm以上便以泡沫塑料作为载体，移栽到前述配方的水培培养基上，每日向培养基中加入一定量的H2O2，培养时间在3周以内，一般就能形成“刺猬根”。
培养的最佳方法是进行2裂或多裂分根培养，即将植物的根系分成几个部分进行培养。例如，将Ca3(PO4)2与其他养分分别置于不同的器具中进行植物培养，即是将Ca与Ca3(PO4)2置于一个培养钵中，而将其他养分置于另一培养钵中，将植株的根系分成两半，各置一半，这样，前一培养钵中就会形成“刺猬根”。
对培养得到的根毛长度用显微尺检测，并进行显微照相或普通照相。
实施例1以拟南芥为材料，用下列营养配方进行培养。2.9mM NaNO3，2.0μM(NH4)2SO4，1.0g/L Ca3(PO4)2，1.0233mM K2SO4，1.9980mMCaCl2·2H2O，1.6458mM MgSO4·7H2O，89.5μM FeSO4·7H2O，89.5μM EDTA，9.1μM MnCl2·4H2O，0.5μM(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2μM ZnSO4·7H2O，18.5μM H3BO3，0.2μM CuSO4·4H2O，0.5ml 3％H2O2/L·日。用琼脂作为载体，培养2～3周。
实验结果得到长度3mm以上的根毛，显微照相见
图1。
实施例2以小黑麦为材料，用下列营养配方进行培养。2.5mM NaNO3，1.0μM(NH4)2SO4，0.8233mM K2SO4，2.90mM CaCl2·2H2O，1.6mMMgSO4·7H2O，79.5μM FeSO4·7H2O，79.5μM EDTA，8.0μM MnCl2·4H2O，0.4μM(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2μM ZnSO4·7H2O，15.5μM H3BO3，0.1μMCuSO4·4H2O，100μM 3％H2O2/L·日。培养2～3周。
实验结果得到长度3mm以上的根毛，显微照相见图2。
实施例3以百脉根为材料，用下列营养配方进行培养。2.8mM NaNO3，1.3μM(NH4)2SO4，2.0g/L Ca3(PO4)2，1.0mM K2SO4，2.0mM CaCl2·2H2O，1.6mM MgSO4·7H2O，90.8μM FeSO4·7H2O，90.8μM EDTA，9.0μMMnCl2·4H2O，0.5μM(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2μM ZnSO4·7H2O，18.5μMH3BO3，0.2μM CuSO4·4H2O，150μl 3％H2O2/L·日。培养2～3周。
实验结果得到长度1-2mm以上的根毛，显微照相见图3。
实施例4以玉米为材料，用下列营养配方进行培养。2.8mM NaNO3，0.3μM(NH4)2SO4，1.0g/L Ca3(PO4)2，1.0mM K2SO4，3.8mM CaCl2·2H2O，1.6mM MgSO4·7H2O，90.8μM FeSO4·7H2O，90.8μM EDTA，9.0μMMnCl2·4H2O，0.5μM(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2μM ZnSO4·7H2O，18.5μMH3BO3，0.2μM CuSO4·4H2O，150μl 3％H2O2/L·日。培养2～3周。
实验结果得到长度1-2mm以上的根毛，显微照相见图4。
实施例5以白三叶草为材料，用下列营养配方进行培养。2.9mM NaNO3，0.1μM(NH4)2SO4，1.5g/L Ca3(PO4)2，1.0mM K2SO4，3.9mM CaCl2·2H2O，1.6mM MgSO4·7H2O，90.8μM FeSO4·7H2O，90.8μM EDTA，9.0μMMnCl2·4H2O，0.5μM(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2μM ZnSO4·7H2O，18.5μMH3BO3，0.2μM CuSO4·4H2O，150μl 3％H2O2/L·日。培养2～3周。
实验结果得到长度1-2mm以上的根毛，显微照相见图5。
实施例6以小麦为材料，用下列营养配方进行培养。2.7mM NaNO3，0.3μM(NH4)2SO4，1.4g/L Ca3(PO4)2，1.0mM K2SO4，3.3mM CaCl2·2H2O，1.6mM MgSO4·7H2O，90.8μM FeSO4·7H2O，90.8μM EDTA，9.0μMMnCl2·4H2O，0.5μM(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2μM ZnSO4·7H2O，18.5μMH3BO3，0.2μM CuSO4·4H2O，150μl 3％H2O2/L·日。培养2～3周，即能形成1～2mm长以上的根毛。
实验结果得到长度1-2mm以上的根毛，显微照相见图6。
权利要求
1.一种植物细胞培养基，含有1.0nM～6.0mM钙盐，1.0nM～6.0mM硝酸盐，两者的浓度分别按钙离子和硝酸根离子计，和1.0ng～5.0g/L水难溶性磷酸盐。
2.权利要求1所述的植物细胞培养基，其中钙盐为CaCl2·2H2O，硝酸盐为NaNO3，磷酸盐为Ca3(PO4)2或FePO4。
3.权利要求2所述的植物细胞培养基，还含有1.0nl～10.0ml3％H2O2/L或相应量浓度的其他过氧化物。
4.权利要求3所述的植物细胞培养基，其中过氧化物为过氧化钠或过氧化钾。
5.权利要求2或3所述的植物细胞培养基，还可含有下述一种或多种化学物质1.0nM～8.0mM MgSO4·7H2O，1.0nM～200.0μM FeSO4·7H2O，1.0nM～200.0μM EDTA，1.0nM～40.0μM MnCl2·4H2O，1.0nM～12.0μM (NH4)6Mo7O24·4H2O，1.0nM～20.0μM ZnSO4·7H2O，1.0nM～40.0μM H3BO3，1.0nM～20.0μM CuSO4·4H2O，1.0nM～6.0mM(NH4)2SO4，1.0nM～3.0mM Na2SiO3，1.0nM～5.0mM K2SO4。
6.一种培养植物细胞的方法，其特征在于使用权利要求1、2、3、4或5所述的培养基进行培养。
7.权利要求4所述的方法，其特征在于在培养过程中向培养基中间隔地加入权利要求3、4所述植物细胞培养基中的过氧化物，或者向培养基中通气或者采取其他方法使培养基的溶氧量增加。
全文摘要
本发明公开了一种植物细胞培养基及使用培养基培养植物细胞的方法,属于植物组织和植物细胞培养技术领域。该培养基应用水培技术,含有1.0nm～6.0mm钙盐,1.0nm～6.0mM硝酸盐和1.0ng～5.0g/l磷酸盐；优选的钙盐为CaCl
文档编号C12N5/04GK1422948SQ01140210
公开日2003年6月11日 申请日期2001年12月5日 优先权日2001年12月5日
发明者刘国栋 申请人:刘国栋