专利名称：甘露多糖抗病强身保健饮料的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌多糖保健饮料。更具体地说，本发明目的在于利用一种具有异常肥大荚膜的细菌，通过发酵工程生产荚膜多糖用作保健饮料或食品。由于此种菌多糖安全无毒而有明显免疫功能，其组成为甘露糖和葡萄糖的聚合物，适合于食品和医药用途；此种菌多糖又适合于在发酵罐中工业化生产，所产菌多糖产量高而质量均一，成本远低于香菇多糖而保健功能相似，因而是一种廉价生产多糖所新资源。
目前，医学界已公认一些菌类如香菇、茯苓、云芝多糖等有抗肿瘤作用，其作用机制与一般抗肿瘤药不同，不具细胞毒杀作用，主要是增强机体免疫力功能或诱导干扰素的产生，因而毒性很小(中国医科大学主编实用医药词典，P.196“多糖”条目，人民卫生出版社)。
菌类多糖是由微生物将十个分子以上单糖缩合而成的生物高分子聚合物。近代生物技术研究发现，生物多糖对动植物的生长发育有多方面生理功能。有些多糖是人和动物的生物机能调节分子，主要表现为免疫力增强和刺激生长作用，对巨噬细胞和T淋巴细胞、自然杀伤细胞、T细胞、B细胞等机体保卫细胞均有明显刺激作用，使这些细胞活性增强。生物多糖能促进巨噬细胞分泌白细胞介素I和肿瘤坏死因子，促进T淋巴细胞产生白细胞介素II，激活LAK细胞，诱导白细胞产生干扰素。多糖对细胞免疫功能的促进和诱生许多细胞因子，是多糖发挥药效作用的机制之一(杨洁彬等，乳酸菌——生物学基础及应用，P.247，中国轻工业出版社，1999)。
因此，微生物产生的菌多糖保健功能已日益引起科学界和社会重视。生物工程科学者认为，继基因工程、蛋白质工程之后将是多糖工程的发展。国外学者预言今后若干年将是多糖时代，多糖将使人类的健康水平提高到新的阶段。
由于人们对菌多糖保健功能的认知，近十几年来我国市场上出售的一些保健口服液大都与菌多糖有关，例如“太阳神”、“生命力”等口服液即为从香菇或猴头菇中提取的菌多糖。然而，这些食用菌类都是名贵食品，用以提取保健多糖资源有限，成本必然很高而且难以大规模工业化生产，因而难以为人民大众食用。
近代生物工程技术兴起后，科学界注意到可利用产多糖的细菌通过发酵工程工业化大量生产菌多糖，比从食用菌中提取多糖成本低廉而保健功能相似。在自然界众多细菌类中，开发多糖类用作药物，研究最多的是从产荚膜细菌中得到的各种荚膜多糖，有的已在医药上用以防治感染，有的多糖用于抗肿瘤、抗凝血、抗病毒、抗辐射、抗变性反应等(杨洁彬等，同上书，1996)。
自然界中许多细菌在其生命活动过程中的一定条件下，可以在细胞壁外产生由多糖组成的粘液膜包围整个菌体，称为荚膜。在能产生荚膜的细菌中，有些是病原菌(如肺炎双球菌、炭疽杆菌等)。在非病原菌中能产生荚膜的细菌主要是固氮菌类，包括根瘤菌、自生固氮菌等农田土壤常见细菌。然而，在这些产荚膜的非病原菌中能开发利用以生产多糖保健品的还不多。
本发明的任务在于从自然界能产生荚膜的非病原菌中寻找产荚膜多糖量多、质好而适于工业化生产、成本低廉的细菌菌种。
本发明经过多年研究，从众多产荚膜的非病原菌中筛选到一种荚膜异常肥厚而富含多糖的细菌，编号为928。
928菌的菌体为粗长杆状，大小为1-1.2×4-7微米，革兰氏染色不定；在营养贫乏的培养基中菌体外包有椭圆形肥大荚膜，大小为5-7×7-10微米。培养后期在菌体中形成粗大的长椭园形芽孢，大小为1.5-1.8×3-3.5微米。此菌生理特性异常，不仅能利用空氧中的氮气为氮素营养，并能从难溶性磷钾矿物中吸取磷钾养分元素，因此在早年研究此菌时曾俗称为钾细菌(陈廷伟钾细菌，农业出版社，1959；陈廷伟、陈华癸钾细菌的形态生理及其对磷钾矿物的分解能力，《微生物》2卷3期，1960)。据此，928菌能在无氮素而只含难溶性磷钾矿物及蔗糖的培养基中生长，在营养极为贫乏的条件下，菌体外甚至包有2-3层肥厚荚膜，因而菌液粘稠。这些都是其它细菌不具有的异常生理特性。此菌经中国科学院微生物研究所专家分类鉴定，其学名为胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)该菌种已在国家知识产权局认可的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，登记编号为CGMCC No.0684。为便于叙述，以下本文将此菌株简称为928菌。
928菌在含有蔗糖而氮磷钾有效养分贫乏的固体培养基上形成无色、透明、凸起如半粒玻璃珠状菌落，在上述液体培养液中形成胶水状粘稠菌液，此时发酵液中的蔗糖已被转化聚合成为荚膜多糖。经中国林科院分析中心及中国农科院研究生院生化研究室检测，928菌多糖主要由甘露糖(含量约40％)和葡萄糖(含量约21％)聚合而成的多糖，二者摩尔比M＝2∶1，其分子量约为1万kd，此类多糖适合于食品和医药工业用途。
由于928菌能利用空气中氮气而不需有机氮源生长，在牛肉膏和蛋白胨培养基中反而生长不好，因此是属于不感染动物的非病原菌类。又因培养基中不含任何蛋白质成分，928菌发酵液无异味而具有甜香气味。经北京临床药学研究所进行的“928饮料急性毒性试验”证明，对小白鼠一日内3次喂服相当人用300倍的928菌液饮料，连续观察7天，动物全部正常健康存活，未显示任何急毒性反应，试验证明928菌饮料安全无毒。
为了测试928菌发酵液中的多糖增强免疫功能的效果，我们委托医学研究部门先后进行3次动物试验。
(1)由军事医学科学院微生物流行病研究所免疫室进行了“928菌液对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能影响”的实验。实验结果表明，喂饲“928菌液”的实验小鼠巨噬细胞吞噬功能比对照组增强4.5倍，其中雄性组比对照增强2.87倍，雌性组比对照增强6.13倍。体重测定结果表明，喂饲928菌液实验组小鼠体重比对照组增重29-535％，其中雄性组增重29.17％，雌性组增重535％。实验结果证明，928菌发酵液对小鼠巨噬细胞的吞噬功能和体重增长均有明显促进作用，对雌性小鼠的效果更为明显。
(2)由北京医科大学基础医学院生理教研室进行了“928菌液对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能影响”实验。
实验结果表明，小鼠巨噬细胞吞噬碳粒能力因喂饲不同浓度菌液而有差异。喂5％及50％菌液对吞噬指数改变无影响，而100％928菌液可明显提高吞噬指数，与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。50％菌液加5％山杏汁组也可提高吞噬指数，但不如298菌源液显著(P＜1)。各组之间体重及肝脾重量无明显改变。此次实验结果再次证明，928菌发酵液中的多糖可提高小鼠吞噬细胞清除异物的能力，即可增强其巨噬细胞的吞噬功能，表明增强其非特异性免疫功能。
(3)继后，北京医科大学生理教研室又进一步选用2个基本的免疫学实验(吞噬试验和溶血斑试验)作为观察指标，检测928菌液对小鼠免疫功能的影响。同时，在正常对照组(A)(喂无菌水)外，其余5组每天都强迫小鼠在冷水中游泳5分钟，使小鼠免疫功能低下以观察喂不同浓度928菌液的免疫功能是否比对照组(B)(冷水游泳，不喂菌液)增强。
实验结果表明，冷水游泳对照组(B)的吞噬指数低于正常对照(A)(不游泳)，而喂50％菌液或50％菌液加5％山杏汁实验组的小鼠吞噬指数明显高于游泳对照组(B)，与不游泳对照组(A)吞噬指数相近或更高。溶血空斑(PFC)试验结果表明，游泳对照组B的PFC明显低于正常对照组(B)，喂5％或50％菌液组的PFC稍有提高，而喂100％928菌原液的实验组可明显提高PFC，与游泳对照组(B)有极显著差异(P＜0.01)。
此次实验第3次证明928菌液中的多糖可提高小鼠吞噬细胞功能，增强抗体形成细胞的生成，对动物的非特异免疫功能及体液免疫功能皆有增强作用。值得注意的是，实验结果还表明在动物机体处于不良环境(冷水游泳刺激)体力衰退情况下，喂饲928菌液多糖可增强机体名疫系统的抗病功能从而保持正常健康，证明928菌多糖具有低抗不良环境和增强免疫力的抗病保健功效，和我国首批开发的保健药品蜂王浆实验效果相似。
通过军事医学科学院及北京医科大学三次动物试验证明，928菌发酵液中的菌多糖确有增强动物机体免疫力的保健功效。对于此菌的微生物学特性及发酵生产条件，我们已研究四十多年，国内早已作为生物肥料用于大面积农田，但至今尚未见报道此菌产生的荚膜多糖还有增强免疫力的保健功能。
目前，本发明已通过实验证明928菌的荚膜多糖有增强免疫力的功能，而且对人体安全无毒，其发酵生产条件也早已成熟(用于生物肥料已大量发酵生产多年)，如今是应当将其开发利用于保健饮品的时候了。
实施本项发明技术措施包括928菌种培养发酵和由此发酵液产生的甘露多糖液配加果汁或提纯为多糖制成口服液等不同剂型产品两大部分，其中菌种培养发酵为技术关键部分，其余不同剂型多糖产品都按公众已知的生产技术制成。
1.928菌种培养发酵(1)菌种培养条件无氮培养基蔗糖2％、磷酸氢二钾(K2HPO4)0.05％，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.02％，酵母膏0.04％，碳酸钙(CaCO3)0.1％，PH＝7.2-7.4琼脂2％，121℃灭菌30分钟。制成斜面后接种，30℃培养48小时，保存菌种用。
(2)菌种发酵培养条件发酵培养基蔗糖2％、K2HPO40.05％，(NH4)2SO40.05％，MgSO4·7H2O0.02％，MnSO40.01％，CaCO30.1％，pH＝7.4，121℃灭菌30分钟。
菌种振荡培养培养基同上，在三角瓶中，转速200转/分，培养温度30℃±1℃，培养时间16小时。
种子罐及发酵罐培养基同上，罐压0.5kg/cm2，通气量0.5-1∶1立方米/吨，搅拌速度200转/分，温度30℃。
发酵工艺流程 菌数含量按常规细菌学平板计数方法进行，本发明发酵生产主要产品为菌多糖，按已知多糖检测方法(张维杰编复合多糖生化研究技术，上海科学出版社，1987)测定。
2.不同剂型928多糖保健饮料制作928菌多糖用作保健饮料的优点首先在于其中含有宝贵的甘露聚糖和葡聚糖等荚膜多糖，具有明显免疫强身功能；其次是可以通过发酵工程工业化生产菌多糖，比提取香菇多糖产量高而成本低廉，第三是该多糖液无色、透明、无异味适合于与配加任何果汁，使饮料风味不减而又有免疫功能。
实施例1甘露多糖保健液用公众能掌握的发酵技术生产928菌发酵液(含甘露聚糖等多糖8-12克/升)经装瓶后灭菌，制成无色透明保健强身饮料，每日服100-200毫升(含甘露多糖1-2克)，适用于体虚、康复、老人日常服用。
实施例2甘露宝口服液将实施例1生产的928菌发酵液脱水90％浓缩加工加成富含甘露聚糖的口服液(含甘露多糖2-4克/20毫升)，适用于体虚、免疫功能低下和术后康复者作补品服用。
实施例3甘露果汁将实施例1生产的甘露多糖液加50％果汁，制成甘甜可口而老幼咸宜免疫强身保健饮料。
实施例4甘露精将实施例1生产的甘露多糖液经公知的多糖提纯方法(张维杰编复合多糖生化研究技术)，提炼成甘露多糖干粉再制成胶囊，适用于强体力活动的运动员和工人保健及年老体虚康复病人服用。
权利要求
1.一种含细菌多糖的保健饮料，其特征在于它利用特有巨大荚膜的胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)，经发酵工程生产富含甘露聚糖等多糖而有增强免疫力功能，比香菇多糖产量高而成本低廉，是一种廉价生产菌多糖的新资源。
2.根据权利要求1所述生产的甘露多糖发酵液，经浓缩十分之一加工成“甘露宝”口服液。
3.根据权利要求1所述生产的甘露多糖液配加50％果汁，制成甘露保健果汁。
4.根据权利要求1所述生产的甘露多糖液，经提炼加工成纯甘露多糖粉，制成“甘露精”保健胶囊。
全文摘要
一种利用发酵工程生产富含甘露聚糖的抗病强身保健饮料——甘露宝。特点在于选用一种有异常肥大荚膜细菌发酵生产荚膜多糖，安全无毒而有显著免疫功能，适合工业化生产；所产多糖产量高而质量均一，成本远低于香菇多糖而保健功能相似；其多糖组成和分子量适于食品和医药用途，因而是一种大有开发利用价值的生产多糖保健饮料新资源。
文档编号A23L2/38GK1410007SQ02100559
公开日2003年4月16日 申请日期2002年2月5日 优先权日2001年9月28日
发明者陈廷伟, 祁弘 申请人:陈廷伟, 祁弘, 陈向东