专利名称：核酸杂交的方法与装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸杂交的方法与装置，特别是涉及一种以控制温度区域为核酸杂交与瓦解氢键两区，以加速核酸杂交的方法与装置。
然而，这6小时的检测时间，仍然无法适应某些疾病的实际需求，例如，有些疾病从诊断发现到死亡的时间，不超过一至两日。所以，仍在发展中的生物芯片技术，研究人员纷纷将焦点摆在将生物芯片所需的检测反应时间缩短的议题上。
要缩短检验时间，就必须从检验过程的主要耗时的技术上着手，其中，在上述的6小时检测时间当中，PCR技术约需1.5小时，核酸杂交约需4小时，这两项技术过程占了整个生物芯片检测过程约92％的时间。所以，如何缩短这两项技术的检测时间成为重点。目前，已有许多研究人员作了相当多的努力，本发明将焦点锁在最耗时的核酸杂交技术上。
如杂交助体(Hybridization Helper)技术，其原理为利用一段核酸序列(即为Helper)，其与检体核酸互补于探针(probe)核酸与检体核酸杂交区域的上或下游处，利用此一段核酸助体(Helper)与检体核酸杂交的特性，来把检体核酸拉直(解除原本凌乱卷曲的不利杂交构型)，以便进行杂交反应。
另外，还有一种技术，称为核酸沉淀试剂(Nucleic acidprecipitating reagents)。其原理为利用不同的盐类缓冲液，使检体核酸易于沉淀于探针核酸附近，借助这样的方法来增加检体核酸的部分区域浓度，以促进杂交反应的进行。
还有一种技术，称为树枝状的核酸序列(Branched oligonucleoridemultimer)技术。其原理为先利用一段探针，此段探针固定于芯片表面，用来捕捉检体核酸。再利用一段树枝状的核酸序列(Branchedoligonucleoride multimer，其与检体核酸互补)接到检体核酸之上；最后再以标示有萤光或放射线的核酸侦测子互补杂交于树枝状的核酸序列上。由于一个树枝状的核酸序列可以有数十甚至于数百个侦测子杂交其上，可大大强化侦测强度，故可缩短杂交时间。
另外，一种称为电控杂交(Electrically controlled hybridization)的技术，则利用核酸带负电的原理，将正电极固定于核酸探针附近。如此即可将检体当中的核酸吸引至探针附近，以形成小区域高浓度检体核酸，最后实现加速杂交的目的。
此外，一种称为巨结构排除(Volume exclusion agents)的技术，其利用有机分子以形成网状巨结构，而此网状巨结构可排除部分杂交缓冲液，使得检体核酸的部分区域浓度大增，进而促进杂交反应的进行。
一种称为两性碳氢化合聚合物(Amphipathic hydrocarbon polymer，简称AHP)的技术，与上一个技术类似，其利用两性有机分子(亲水性及厌水性)形成网状巨结构。此网状巨结构可排除部分杂交缓冲液，使检体核酸的部分区域浓度大增，进而促进杂交反应的进行。
一种称为高度平行整合的微流体生物信道阵列(Highly parallelintegrated microfluidic biochannel arrays)的装置，其结合检体前处理、PCR、杂交、漂洗(Washing)与信号检测等功能于一体，不过，其并未针对杂交的速度上作改进。
最后，还有一种称为动态杂交系统(Dynamic hybridization system)的装置，其利用半渗透膜将探针核酸固定于半渗透膜上，另一方面，以气动或真空压缩等方式驱动流体(内含检体核酸)朝半渗透膜方向流动。由于流体经过渗透膜时检体核酸将会有延迟通过的现象，故检体核酸将于半渗透膜附近造成积聚现象，这样即可提高检体核酸的浓度，以提高杂交速率。因为，不是与探针核酸互补的检体核酸可以从半渗透膜的孔洞中通过。
上述的杂交速率增加方法，多半是以提高检体核酸浓度的方式，或将检体拉直，或利用树枝状结构等，这些让核酸杂交加速的方法，仍有许多的限制，例如不少须在大尺度下才能运作。因此，如何让核酸杂交更快速且也可在小尺度下完成，仍是研究人员持续关注的研究方向。
本发明的另一个目的在于提供一种核酸杂交的方法，利用增加具有核酸物质流体的热能，让原先卷曲的核酸成为线形，即可让核酸杂交的速度增加。
为实现上述目的，本发明提供一种核酸杂交的方法，包含下列步骤提供一具第一温度的核酸杂交区，该核酸杂交区具有一固定有复数个核酸探针(probe)的第一渠道；提供一具第二温度的氢键瓦解区，该氢键瓦解区具有一与该核酸杂交区形成连通的第二渠道，且该第二渠道与该第一渠道形成一连通管；将一含有该复数个核酸的流体导入该连通管；及，驱动该流体反复通过该第二渠道与该第一渠道。
其中，驱动该流体的方法为运用一双向驱动装置，如双向气动泵或双向液动泵。在时间上将该流体停留于该第一渠道一第一时间(如3分钟)，之后再驱动该流体流至该第二渠道并停留一第二时间(如10秒)。在第一渠道停留期间，通过驱动该流体来回流动以增加流体的动能。
依据本发明所公开的技术，本发明还提供一种核酸杂交的装置，包含一氢键瓦解区，具有一第一渠道，用以瓦解复数个核酸的氢键；一核酸杂交区，具有一固定有复数个核酸探针(probe)的第二渠道并与该第一渠道形成一连通管；一温度控制元件，用以控制该氢键瓦解区与该核酸杂交区分别维持在一第一温度与一第二温度；以及，一双向驱动元件，用以驱动注入该连通管中一含有该复数个核酸的流体来回流动。
其中，运用于杂交的核酸探针可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、缩氨酸(peptide)、缩氨酸核糖核酸，或者缩氨酸核糖核酸的衍生物。而温度控制元件则可让氢键瓦解区以及核酸杂交区维持稳定的温度，其中的热源可选择电热器、微波、激光或者光来提供。
下面，结合具体实施例，并配合附图，对本发明的上述和其它目的、特征、和优点，作进一步详细说明。
具体实施例方式
首先，本发明的运作原理是通过增加含核酸物质的流体动能以及热能，让核酸杂交的速度增加。更具体地说，设法将含核酸的检体来回流动，即可增加核酸萃取的速度；此外，配合以增加热能的方式，来瓦解核酸分子的分子内氢键，使原先卷曲的核酸分子成为线形，即可利于杂交的进行。
本发明利用上述原理，设计了两个不同的核酸反应区域的方式来实现本发明的目的，其中，第一个区域为核酸杂交区，第二个区域为氢键瓦解(denature)区。通过加热的方式让氢键瓦解区的温度较高，以实现瓦解核酸的分子内氢键的目的；核酸杂交区则有较低的温度，将已获得热能而成为线形的核酸送至此，即可让与核酸探针互补的核酸相互杂交，并加快杂交速度。另外，利用一个可驱动流体来回流动的元件来增加流体的动能，让在核酸杂交区的核酸分子通过不断地来回流动以达到增加核酸动能的目的。如此，即可让杂交核酸获得动能以及热能，而能实现本发明的加速核酸杂交的目的。
所以，本发明的核酸杂交方法，包含了两个阶段的循环，一个阶段为增加核酸分子的热能，也就是瓦解核酸分子间的氢键的阶段。这一阶段完成后，即可进行下一个阶段，也即，核酸杂交阶段。在核酸杂交阶段中，通过将检体(含已瓦解氢键的核酸分子)快速来回流动，即可与在核酸杂交区当中固定的核酸探针快速反应，而达到快速杂交的目的。因此，检体置于氢键瓦解区的时间只要足够将氢键完全瓦解即可，而检体置于核酸杂交区的时间，只要适当的控制，让存在的经瓦解氢键的核酸分子能够适度反应即可。由于经瓦解氢键的核酸分子，到达温度较低的核酸杂交区后，会逐渐回复原来的状态，所以必须反复执行这两个阶段，直到核酸杂交达到所要求的水准。
许多核酸探针，由于其分子结构上可与如玻璃基板结合，因此易于达到固定的目的。固定的核酸探针分子，与来回流动的含目标核酸(且已经过氢键瓦解)的检体，可快速反应。检体的来回流动速度，可通过控制可让流体来回流动的元件来轻易达成。此元件可以是双向泵，例如双向气动式泵或者双向液动式泵均可。实际应用上，以双向气动式泵较佳。在核酸杂交区的来回流动速度，则可控制在每秒0.1次至每秒50次之间。
在第一阶段，也就是检体存在于氢键瓦解区的阶段，可以控制在10秒左右，时间的长短可根据氢键瓦解区的当中的管径大小而定。在第二阶段，也就是检体存在于核酸杂交区的阶段，可以控制在3分钟左右，甚至更短。至于氢键瓦解区的温度，可控制在摄氏80～100度左右，也就是可让核酸分子的分子内氢键瓦解的温度；最佳的温度在摄氏90度。核酸杂交区的温度，可控制在摄氏20度至68度之间，最佳的温度在摄氏40度左右。
具体的方法如
图1所示，可将含核酸的检体从注入孔11或注入孔21注入；较为理想的是从氢键瓦解区10当中的注入孔11注入，这样，即可先让检体获得较高温度，而让核酸先行展开为线形。在氢键瓦解区10当中，含有蜿蜒的渠道12，由于本发明的方法在于使核酸获得动能及热能，因而，渠道的大小即不受限制，而可以制成宏观尺度(macro scale)的渠道或者微观尺度(micro scale)的渠道；同时，渠道的形状也不受限制。
在核酸杂交区20当中，同样也有注入孔21与蜿蜒的渠道22。从图1可发现，核酸杂交区20的渠道22与氢键瓦解区10当中的渠道12为相通，可让渠道当中的检体来回流动。同样地，渠道22的形状与尺度都不受限制。在核酸杂交区20当中，渠道22的表面则固定有许多核酸探针。当经过增加热能而成为线形的核酸，流至含有许多固定于渠道表面的核酸探针处，即会与之产生杂交。再通过来回流动，以增加流经核酸探针的检体动能，即可以双重效果来加快核酸杂交的速度。
其中，核酸探针的固定是通过探针上的高分子基与基板的亲近性而能固定在基板上。基板的选择，则可依据探针可固定于其上为原则。
依据上述的方法，本发明公开一种核酸杂交的装置，请参考图2的示意图，其包含了微泵40、阀件30、核酸的氢键瓦解区10、核酸杂交区20与温度控制元件50。其中，氢键瓦解区10与核酸杂交区20分别具有第一渠道与第二渠道，此两渠道相通为一连通管，并分别具有一第一开口与第二开口，用来注入检体，并作为驱动检体来回流动的出入口。
从图2中可知，上述的动能供应即靠微泵40来实现，包括了将含核酸的检体从氢键瓦解区10送至核酸杂交区20当中，以及，将在核酸杂交区20当中将渠道当中的检体快速来回流动。而阀件30的功用则在于控制微泵40的流动方向，以控制检体从氢键瓦解区10流向核酸杂交区20或者由核酸杂交区20流向氢键瓦解区10。阀件30也可以整合至微泵40当中。
其中，微泵40可运用双向泵，当检体在氢键瓦解区10获得足够热能后，也即，检体当中的核酸成为线形后，再让检体流至核酸杂交区20时，须控制微泵40能够来回提供微量的动能，以利当中的检体能来回流动。如此，通过微泵40的协助，将可使本发明的核酸杂交装置，能更有效率地达到核酸杂交的目的。
其中，本发明欲运用于杂交的核酸探针可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、缩氨酸(peptide)、缩氨酸核糖核酸，或者缩氨酸核糖核酸的衍生物。而温度控制元件50则可让氢键瓦解区10以及核酸杂交区20维持稳定的温度，其中的热源可选择电热器、微波、激光或者光来提供。
应用本发明的核酸杂交的方法与装置，可使杂交时间由公知技术的4小时缩短到30分钟以内，甚至更短的时间，理论上更可达到10分钟以内。
本发明的核酸杂交方法与装置，其结构简单、价格低廉，且无须主动元件的参与。
虽然本发明以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉本领域的相关技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作适当的更动与润饰，因此本发明的保护范围须以权利要求所确定的保护范围为准。
权利要求
1.一种核酸杂交的方法，包含下列步骤提供一具第一温度的核酸杂交区，该核酸杂交区具有一固定有复数个核酸探针的第一渠道；提供一具第二温度的氢键瓦解区，该氢键瓦解区具有一与该核酸杂交区形成连通的第二渠道，且该第二渠道与该第一渠道形成一连通管；将一含有该复数个核酸的流体导入该连通管；及驱动该流体反复通过该第二渠道与该第一渠道。
2.如权利要求1所述的核酸杂交的方法，其中该第一温度在摄氏20度至68度之间。
3.如权利要求1所述的核酸杂交的方法，其中该第一温度为摄氏40度。
4.如权利要求1所述的核酸杂交的方法，其中该第二温度在摄氏80度至100度之间。
5.如权利要求1所述的核酸杂交的方法，其中该第二温度为摄氏90度。
6.如权利要求1所述的核酸杂交的方法，其中驱动该流体的方法为运用一双向驱动装置。
7.如权利要求6所述的核酸杂交的方法，其中该双向驱动装置为一双向气动泵与双向液动泵任选其一。
8.如权利要求1所述的核酸杂交的方法，其中该流体是由该氢键瓦解区与该核酸杂交区任选其一导入该连通管。
9.如权利要求1所述的核酸杂交的方法，其中驱动该流体反复通过该第二渠道与该第一渠道的步骤，是将该流体停留于该第一渠道一第一时间，之后再驱动该流体流至该第二渠道并停留一第二时间。
10.如权利要求6或9所述的核酸杂交的方法，其中该液体于该第一渠道停留该第一时间时，该双向驱动元件驱动该流体来回流动以增加该流体的动能。
11.一种核酸杂交的装置，包含一氢键瓦解区，具有一第一渠道与一第一开口，用以瓦解复数个核酸的氢键；一核酸杂交区，具有一第二开口与一固定有复数个核酸探针的第二渠道，该第二渠道与该第一渠道形成一连通管；一温度控制元件，用以控制该氢键瓦解区与该核酸杂交区分别维持在一第一温度与一第二温度；及一双向驱动元件，通过该第一开口与该第二开口驱动已注入该连通管中一含有该复数个核酸的流体来回流动。
12.如权利要求11所述的核酸杂交的装置，其中该复数个核酸探针为一脱氧核糖核酸、一核糖核酸、一缩氨酸、缩氨酸核糖核酸与缩氨酸核糖核酸的衍生物，任选其一。
13.如权利要求11所述的核酸杂交的装置，其中该温度控制元件为一固定的热源。
14.如权利要求13所述的核酸杂交的装置，其中该固定的热源由电热器、微波、激光与光任选其一提供。
15.如权利要求11所述的核酸杂交的装置，其中该第一温度是在摄氏20度至68度之间。
16.如权利要求11所述的核酸杂交的装置，其中该第一温度为摄氏40度。
17.如权利要求11所述的核酸杂交的装置，其中该第二温度是在摄氏80度至100度之间。
18.如权利要求11所述的核酸杂交的装置，其中该第二温度为摄氏90度。
19.如权利要求11所述的核酸杂交的装置，其中该双向驱动元件为一双向气动泵与一双向液动泵任选其一。
20.如权利要求11所述的核酸杂交的装置，其中该流体是由该第一开口与该第二开口任选其一导入该连通管。
21.如权利要求11所述的核酸杂交的装置，其中该双向驱动元件，是驱动该流体停留于该第一渠道一第一时间，之后再驱动该流体流至该第二渠道并停留一第二时间。
22.如权利要求11或21所述的核酸杂交的装置，其中该流体在该第一渠道停留该第一时间时，该双向驱动元件驱动该流体来回流动以增加该流体的动能。
23.如权利要求11所述的核酸杂交的装置，其中还包含一阀件，用以控制该双向驱动元件驱动该液体来回流动的方向。
全文摘要
本发明提供了一种核酸杂交的方法与装置，本发明通过提供一温度较高的氢键瓦解区与一温度较低且固定有核酸碳针的核酸杂交区，将含有核酸的检体导入氢键瓦解区后，让检体当中的核酸获得热能后由原先的卷曲形状成为线形，即可将其导入核酸杂交区；在核酸杂交区当中，通过驱动流体反复流动，以增加流体的动能，即可让核酸杂交的速度倍增；本发明所提供的核酸杂交装置，包含了一氢键瓦解区、一核酸杂交区、一双向驱动泵、一温度控制元件，通过温度控制元件的控制，氢键瓦解区与核酸杂交区即可获得稳定的温度，通过双向驱动泵，流体即可获得所需的动能。
文档编号C12Q1/68GK1440977SQ0210652
公开日2003年9月10日 申请日期2002年2月26日 优先权日2002年2月26日
发明者钟永强, 张耀嵩, 石明正 申请人:财团法人工业技术研究院