专利名称：人胸腺素α原胸腺九肽融合蛋白、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白，具体涉及人胸腺素α原胸腺九肽融合蛋白。本发明还涉及该融合蛋白的制备方法及其医药用途。
按照本发明的第一个目的，本发明的发明人采用基因工程方法成功地制得人胸腺素α原胸腺九肽融合蛋白。该融合蛋白的cDNA序列如下5’-cggaattc atg gaa gct aag tct cag ggt ggt tct aacggt ggt tct ggttca gac gcagcc gta gac acc agc tcc gaa atc acc acc aag gac tta aag gag aag aag gaa gtt gtg gaagag gca gaa aat gga aga gac gcc cct gct aac ggg aat gct aat gag gaa aac ggg gagcag gag gct gac aat gag gta gac gaa gaa gag gaa gaa ggt ggg gag gaa gag gag gaggaa gaa gaa ggt gat ggt gag gaa gag gat gga gat gaa gat gag gaa gct gag tca gct acgggc aag cgg gca gct gaa gat gat gag gat gac gat gtc gat acc aag aag cag aag gcc gacgag gat gac taa ggatcc cg-3’
根据本发明的目的之二，本发明的人胸腺素α原胸腺九肽融合蛋白可用以下方法制得，主要包括以下步骤(a)合成富含A，T的引物；(b)用(a)中合成的引物作为模板合成融合蛋白cDNA；(c)将(b)中得到的cDNA克隆到表达载体中；(d)用所述的表达载体转化原核细胞；(e)培养所述的原核细胞，将所述细胞破碎后，从上清液中回收所表达的融合蛋白。
利用从人胎儿胸腺细胞中提取的总RNA，特殊设计合成的上游引物，反转录获得了人胸腺素α原胸腺九肽融合蛋白的cDNA，将其克隆到pBV220质粒中，经序列分析表明，与预期序列完全一致。然后转化大肠杆菌，例如DH5α，从而得到大肠杆菌中以可溶形式表达的融合蛋白。经活性测定，它可抑制氢化可的松对体外培养Wistar鼠胸腺细胞的损伤。
本发明人发现，不同热诱导时间对融合蛋白表达有影响，以热诱导6小时为佳。
本发明中的表达载体为pBV220和具有类似特性的载体。
所述的原核细胞常用大肠杆菌，如大肠杆菌为DH5α、JM109等。这些细胞可通过商业途径获得。
图2表示胸腺素α原胸腺九肽融合蛋白酶切鉴定。
图3表示胸腺素α原胸腺九肽融合蛋白以可溶形式表达，以pBV220DH5α为对照。
按照本发明的第三个目的，实验证明本发明制备获得的人胸腺素α原胸腺九肽融合蛋白在特性和功能方面可能兼具人胸腺素α原和胸腺九肽的活性，即调节机体免疫力、调节细胞增殖和调节机体合成与分泌细胞因子的作用。此外，该融合蛋白在抗病毒(例如肝炎病毒)、抗肿瘤方面也有较广阔的应用前景。
质粒pBV220，中国预防医学科学院病毒所惠赠，有关该质粒的详细材料参见张智清，姚立红，侯云德.含PRPL启动子的原核高效表达载体的组建及其应用。病毒学报，1990，6111-116。
1.2.LB培养基配方见参考文献分子克隆实验指南，第二版，1992，科学出版社，金冬雁等，第908页。
1.3.酶及其他试剂限制性内切酶EcoRI，BamHI，T4DNA连接酶均购自Promega公司，总RNA提取及反转录等试剂也由Promega公司提供，其他均为标准试剂。
1.4.引物合成本发明人设计出人胸腺素α原胸腺九肽融合蛋白的富含A，T的适合引物，从而使以上述引物合成的cDNA在原核生物细菌，特别是大肠杆菌中高效表达。
引物I5’cggaattc atg gaa gct aag tct cag ggt ggt tct aac ggt ggt tct ggt ggt tcagac gca gcc gta gac acc 3’共74个碱基(含EcoRI位点)。
引物II5’cgggatcc tta gtc atc ctc gtc ggt c 3’(含BamHI位点)。
其中引物I为上游引物，引物II为下游引物，所述引物均用美国ABI公司的391EP DNA合成仪合成。
1.5.人胎儿胸腺细胞的培养取四月龄流产胎儿胸腺，制备成单个细胞，悬浮于RPMI1640培养基中，细胞密度为1×107/ml，在20μg/ml PHA和500U/ml IL-2的联合刺激下，于37℃，5％CO2下培养24小时。
1.6.胸腺细胞总RNA的提取和反转录PCR取刺激培养的胸腺细胞，按照Promega公司的总RNA试剂盒的方法，提取总RNA，溶于无菌去离子水。取一定量的RNA，加下游引物和dNTP，在42℃下反转录30分钟。进一步加入上游引物和Taq DNA聚合酶后，进行如下步骤先在94℃变性2分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，再在94℃1分钟，50℃ 1分钟和72℃ 1分钟进行30个循环，最后于72℃延伸7分钟。
1.7.按照Sambrook等人(分子克隆实验指南，第二版，1992，科学出版社，金冬雁等)的方法进行DNA重组及鉴定。按Sanger双脱氧末端终止法进行序列分析。
1.8.人胸腺素α原胸腺九肽融合蛋白对氢化可的松损伤的保护作用取雄性Wistar鼠，体重约100g左右。无菌取胸腺制备单细胞，调节细胞浓度为7×106/ml，于含10％小牛血清的RPMI1640培养基中培养。实验分对照组、氢化考的松组(H，10-7mol/L)、氢化考的松(10-7mol/L)+融合蛋白组(10-7mol/L)(H+I)。于37℃、5％CO2条件下培养5h。之后取细胞计数，并用MTT反应测定570nm下OD值，以此反映细胞数量的多少及细胞活性的高低，了解融合蛋白对氢化考的松损伤的影响。
2.结果与讨论2.1.融合蛋白cDNA的扩增体外培养的人胚胎胸腺细胞，经PHA和IL-2联合刺激，提取总RNA经反转录后进行30个PCR循环，琼脂糖凝胶电泳可观察到扩增出一条明显的DNA特异带，该带与胸腺素α原cDNA以及分子量标准比较，分子量基本与预期一致。结果见
图1。
2.2.融合蛋白cDNA的克隆、筛选及测序常规低熔点琼脂糖回收RT-PCR产物，用EcoRI和BamHI双酶切处理，在T4 DNA连接酶作用下，克隆入经相同酶处理的pBV220质粒中，转化常规CaCl2处理的感受态细菌DH5α。经培养后，在含氨苄青霉素的琼脂平板上挑选菌落，用EcoR1和BamH1双酶切鉴定，可见酶切出一条特异带，其分子量与RT-PCR产物一致，结果见图2。
2.3.挑选阳性转化子，用Promega公司的质粒纯化系统提取质粒，用GibcoBLRL公司的双链测序系统测序，测的融合蛋白序列与预期一致，见序列表1。
2.4.融合蛋白表达及活性初步测定将克隆有融合蛋白cDNA的细菌大量培养超声破碎，将上清液和沉淀物分别进行SDS-PAGE电泳，结果表明融合蛋白出现于上清中，表明它以可溶形式表达，不形成包涵体。将表达上清液与胸腺细胞一起温育培养，结果表明融合蛋白对氢化考的松损伤有一定的保护作用。结果见表1。
表1 胸腺素α原胸腺九肽融合蛋白对氢化考的松损伤的保护作用组别 细胞数(×106) MTT反应对照 6.38±0.53 0.310±0.021H4.99±0.23*0.279±0.015*H+I 6.57±0.38# 0.326±0.015#*P＜0.05，与对照组相比；#P＜0.05，与H组比较。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所<120>人胸腺素α原胸腺九肽融合蛋白、其制备方法及用途<160>3<210>1<211>391<212>DNA<400>1cggaattc atg gaa gct aag tct cag ggt ggt tct aacggt ggt tct ggt ggttca gac gcagcc gta gac acc agc tcc gaa atc acc acc aag gac tta aag gag aag aag gaa gtt gtg gaagag gca gaa aat gga aga gac gcc cct gct aac ggg aat gct aat gag gaa aac ggg gagcag gag gct gac aat gag gta gac gaa gaa gag gaa gaa ggt ggg gag gaa gag gag gaggaa gaa gaa ggt gat ggt gag gaa gag gat gga gat gaa gat gag gaa gct gag tca gct acgggc aag cgg gca gct gaa gat gat gag gat gac gat gtc gat acc aag aag cag aag gcc gacgag gat gac taa ggatcc cg-3’
<210>2<211>74<212>DNA<400>2cggaattc atg gaa gct aag tct cag ggt ggt tct aac ggt ggt tct ggt ggt tca gac gcagcc gta gac acc<210>3<211>27<212>DNA<400>3cgggatcc tta gtc atc ctc gtc ggt c
权利要求
1.人胸腺素α原胸腺九肽融合蛋白，其特征在于具有序列表中序列1所示的cDNA的序列。
2.制备权利要求1所述融合蛋白的方法，包括以下步骤(a)合成富含A，T的引物；(b)用(a)中合成的引物作为模板合成融合蛋白cDNA；(c)将(b)中得到的cDNA克隆到表达载体中；(d)用所述的表达载体转化原核细胞；(e)培养所述的原核细胞，将所述细胞破碎后，从上清液中回收所表达的融合蛋白。
3.按照权利要求2的制备方法，其特征在于所说的引物为引物I5’cggaattc atg gaa gct aag tct cag ggt ggt tct aac ggt ggt tct ggt ggt tcagac gca gcc gta gac acc 3’共74个碱基；引物II5’cgggatcc tta gtc atc ctc gtc ggt c 3’。
4.按照权利要求2的制备方法，其特征在于所说的表达载体为pBV220。
5.按照权利要求2的制备方法，其特征在于所说的原核细胞为大肠杆菌。
6.按照权利要求5的制备方法，其特征在于所说的大肠杆菌为DH5α或JM109。
全文摘要
本发明涉及人胸腺素α原胸腺九肽融合蛋白及其制备方法和医药用途。该融合蛋白的cDNA为序列表中序列1所示，制备方法包括合成富含A、T的引物、用合成的引物为模板合成融合蛋白cDNA、将得到的cDNA克隆到表达载体中、用所述的表达载体转化原核细胞、培养所述的原核细胞和分离纯化所表达的融合蛋白等步骤。该融合蛋白具有调节机体免疫力、细胞增殖和机体细胞因子的合成与分泌等作用，在抗病毒、抗肿瘤方面也有较广阔的应用前景。
文档编号C12N15/63GK1440983SQ0210487
公开日2003年9月10日 申请日期2002年2月26日 优先权日2002年2月26日
发明者刘佃辛, 王先远, 马清钧, 金宏 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所