专利名称：通过发酵制备o－乙酰基－l－丝氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及通过发酵制备O-乙酰基-L-丝氨酸的方法。
相反，几乎不知道任何用于制备二十种蛋白原氨基酸生物合成前体的相应的方法。但是，正是这些前体能够代表令人感兴趣的产物，因为它们经常具有手性中心，且可以用作合成药物活性化合物的结构单元。举例言之，专利申请WO 00/44923描述了莽草酸的制备，莽草酸是芳族氨基酸生物合成中的中间体。另一实例是专利申请EP 0994190 A2，其中报道了利用发酵制备L-高丝氨酸，其是L-甲硫氨酸的前体。
O-乙酰基-L-丝氨酸是L-半胱氨酸的生物合成前体。其本身也是氨基酸，且通过L-丝氨酸在羟基官能团乙酰化而在细菌和植物代谢中形成。该反应通过酶丝氨酸O-乙酰基转移酶[EC 2.3.1.30]催化，该酶由cysE基因编码。在细胞中，O-乙酰基丝氨酸经历进一步反应，形成L-半胱氨酸。在该反应中，乙酸官能基由硫醇官能基取代。
通过发酵制备O-乙酰基-L-丝氨酸的问题源自以下事实，即，在pH值大于4.0时，该物质极不稳定且异构化为N-乙酰基-L-丝氨酸。在pH7.6时，反应速率为1％×min-1(Tai等，1995，Biochemistry 3412311-12322)。这意谓在通常进行至少一天半的发酵后，在这些条件下无法检测到显著量的O-乙酰基丝氨酸。异构化反应不可逆，且其速率随pH增加仍进一步增加。与O-乙酰基-L-丝氨酸相反，N-乙酰基-L-丝氨酸因其氨基官能基被封阻而不再能用于肽合成。
另一问题是，O-乙酰基-L-丝氨酸在细胞中的水平极低，且经受强力调节。一方面，丝氨酸乙酰基转移酶受到L-半胱氨酸的变构抑制，因此在有μM浓度的L-半胱氨酸的存在下，O-乙酰基-L-丝氨酸的合成不可能。另一方面，异构化产物N-乙酰基-L-丝氨酸起硫调节子的诱导物的作用，因而导致O-乙酰基-L-丝氨酸与硫化物快速反应形成L-半胱氨酸。
Dassler等(2000，Mol.Microbiol.361101-1112)曾报道，超量生产膜蛋白ydeD(＝Orf299)的细胞向培养基中分泌L-半胱氨酸、2-甲基噻唑烷-2，4-二羧酸及O-乙酰基-L-丝氨酸。但是，仅可能检测出极少量，0.12g/l的O-乙酰基-L-丝氨酸，且仅在摇瓶试验中检测到。另一方面，在由于改善营养供应而能得到更高收率的发酵试验中仅得到N-乙酰基-L-丝氨酸。已经讨论过O-乙酰基-L-丝氨酸仅在pH为4-5时足够稳定的可能性。但是，由于嗜中性细菌如大肠杆菌的不良生长，所以该pH范围不适于发酵制备。
在专利申请EP 0885962 A1描述了使用Orf299在pH7.0发酵制备N-乙酰基-L-丝氨酸。在此案中，Orf299基因(在该申请中命名为SEQ.ID.NO3)与适当的cysE等位基因结合。这些等位基因编码丝氨酸乙酰基转移酶，该乙酰基转移酶经历较少的L-半胱氨酸的反馈抑制。这导致实现细胞中O-乙酰基-L-丝氨酸的产量增加，且最终由于快速异构化导致N-乙酰基-L-丝氨酸的积累。
如专利申请WO 97/15673所述，使用本身经历较少反馈抑制的cysE等位基因也未导致O-乙酰基-L-丝氨酸的积累。尽管使用此方法时，在细胞内实现了O-乙酰基-L-丝氨酸形成的增加，但在细胞外仅检测到L-半胱氨酸，从而作为产物得到。
当制备O-乙酰基-L-丝氨酸时的另一严重问题是由Dassler等(2000，Mol.Microbiol.361101-1112)报道的，即Orf299的超量生产导致细菌生长的严重损伤。这是由于因细胞内缺乏诱导物N-乙酰基-L-丝氨酸而造成无硫调节子诱导所致。
该目的如下实现在发酵培养基中培养微生物菌株，该微生物菌株衍生自野生型，且与野生型相比，其O-乙酰基-L-丝氨酸内源形成和O-乙酰基-L-丝氨酸流出增加，其中将发酵培养基中的pH调节到5.1至6.5的范围内。
在发酵期间，发酵培养基的pH优选为5.5至6.5；特别优选为5.5至6.0。
可以在本发明的方法中使用的微生物菌株的特征是它们- 显示增加的O-乙酰基-L-丝氨酸内源形成，以及- 显示增加的O-乙酰基-L-丝氨酸流出。
这种性质的菌株在本领域中已知。举例言之，如在下列文献中所述，通过引入修饰的cysE等位基因可以实现增加的O-乙酰基-L-丝氨酸内源形成，- WO 97/15673(该文献引入本文作参考)或- Nakamori S.等，1998，Appl.Env.Microbiol.641607-1611(该文献引入本文作参考)或- Takagi H.等，1999，FEBS Lett.452323-327。
这些cysE等位基因编码丝氨酸O-乙酰基转移酶，该酶经历降低的半胱氨酸的反馈抑制。结果，O-乙酰基-L-丝氨酸的形成在很大程度上与细胞内的半胱氨酸水平无关。
通过增加流出基因可以实现增加的O-乙酰基-L-丝氨酸流出，所述基因的基因产物导致O-乙酰基-L-丝氨酸的输出。
Dassler等(2000，Mol.Microbiol.361101-1112)及在EP 0885962 A1(相应于美国专利申请系列号SN09/097759(该文献引入本文作参考))描述的ydeD基因是特别优选的这种性质的流出基因。
修饰的cysE等位基因和/或流出基因可以存在于菌株中，以单拷贝或以增加的拷贝数被采用。它们可以被染色体编码，或被定位于自复制元件(element)如质粒上。
举例言之，通过使用本领域技术人员已知的适当启动子系统，可以增加基因的表答。
在本发明的优选实施方案中，所使用的微生物在具有中等拷贝数的质粒上容纳有cysE等位基因和/或ydeD基因，具有天然启动子或gapDH启动子。这种结构的实例是EP 0885962 A1详细描述的pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306。
原则上，所有可以使用遗传方法的和容易在发酵方法中培养的微生物菌株均适于制备这种性质的菌株。优选使用肠杆菌科细菌。特别优选使用大肠杆菌种的微生物。这些菌株的制备在上述文献中均曾述及且并非本发明的一部分。
如EP 08 85962 A1(相应于美国专利申请系列号SN09/097759(该文献引入本文作参考))中所述，适用于本发明的方法的菌株也适用于制备半胱氨酸和半胱氨酸衍生物。但是，在此情况下，为了得到最优量的L-半胱氨酸或其衍生物之一，需要适当供以无机硫源，如硫酸盐或硫代硫酸盐。
但是，在本发明的方法中，在发酵期间并不计量加入硫源，因为不希望将O-乙酰基-L-丝氨酸进一步转化成半胱氨酸。仅需确保在培养基中存在适量的硫源(例如硫酸盐或硫代硫酸盐)以满足半胱氨酸细胞蛋白质合成的需要。营养培养基中的适当量优选为5至50mM硫。
本发明的使用微生物菌株制备O-乙酰基-L-丝氨酸的方法在发酵罐内以本领域已知的方式进行，但在发酵期间将pH值设定得非常低。
微生物菌株在发酵罐中以连续培养、以分批培养，或者优选以补料分批培养方式生长。特别地，在发酵期间优选计量加入碳源。
优选使用糖、糖醇或有机酸作为碳源。在本发明的方法中使用的碳源特别优选是葡萄糖、乳糖或甘油。
碳源优选以适当的形式计量加入，所述形式确保在发酵期间发酵罐中的含量保持在0.1-50g/l的范围内。特别优选的范围是0.5-10g/l。
在本发明的方法中优选使用的氮源为氨、铵盐或蛋白质水解产物。当氨用作保持恒定pH的校正剂时，在发酵期间该氮源规律地进料。
可以加入的其它培养基添加剂是元素磷、氯、钠、镁、氮、钾、钙及铁的盐类，以及痕量(即μM浓度)的元素钼、硼、钴、锰、锌及镍的盐类。
还可以向培养基中加入有机酸(例如乙酸或柠檬酸)、氨基酸(例如异亮氨酸)及维生素(例如B1、B6)。
可以使用的复合营养源的实例是酵母提取物、玉米浆、大豆粕及麦芽汁。
培养温度为15-45℃。优选为30-37℃。
发酵优选在需氧生长条件下进行。用压缩空气或纯氧将氧输入发酵罐。
在1至3天的发酵期间，依照前述方法发酵的微生物以极高的效率将O-乙酰基-L-丝氨酸分泌至培养基内。
以下实施例用以进一步说明本发明。实施例中所用的细菌菌株大肠杆菌W3110/pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306依照布达佩斯条约，保藏于DSMZ(德意志微生物保藏中心，D-38142不伦瑞克)，保藏号为DSM 13495，保藏日为2000年5月19日。实施例1异构化O-乙酰基-L-丝氨酸以给出N-乙酰基-L-丝氨酸为了获得在接近发酵条件的条件下异构化反应的更精确概念，将0.9g O-乙酰基-L-丝氨酸引入100ml发酵培养基中(参见实施例3)。之后用25％氨将pH调节至7.0，并在反应温度保持在32℃的情况下，于不同时间取样。在LUNA 5μ C18(2)柱(Phenomenex，Aschaffenburg，Germany)上通过反相HPLC分析这些试样。所用洗脱液为稀磷酸(0.1ml浓磷酸/l)，流速为0.5ml/min。所得结果如
图1所示。实施例2生产菌株的预培养物作为发酵的预培养物，在30℃培养温度下，在150rpm的摇床内，将20ml LB培养基(10g胰蛋白胨/l、5g酵母提取物/l、10g NaCl/l)，其另外含有15mg四环素/l，与菌株w3110/pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306(在EP 0885962 A1，相应于美国专利申请序列号SN 09/097759(该文献引入本文作参考))一起培养。七小时后，将全部混合物移入100ml SM1培养基(12g K2HPO4/l；3g KH2PO4/l；5g(NH4)2SO4/l；0.3gMgSO4×7 H2O/l；0.015g CaCl2×2 H2O/l；0.002g FeSO4×7 H2O/l；1g柠檬酸钠×2 H2O/l；0.1g NaCl/l；1ml微量元素溶液/l，此溶液由0.15g Na2MoO4×2 H2O/l；2.5gNa3BO3/l；0.7g CoCl2×6 H2O/l；0.25g CuSO4×5 H2O/l；1.6g MnCl2×4 H2O/l；0.3g ZnSO4×7 H2O/l组成)中，其中补充以5g葡萄糖/l；0.5mg维生素B1/l及15mg四环素/l。接下来的培养在30℃及150rpm的条件下进行17小时。实施例3通过发酵制备O-乙酰基-L-丝氨酸所用发酵罐是Braun Biotech(Melsungen，Germany)提供的Biostat M装置，其最大培养容积为2l。该发酵罐含有900ml发酵培养基(15g葡葡糖/l；10g胰蛋白胨/l；5g酵母提取物/l；5g(NH4)2SO4/l；1.5g KH2PO4/l；0.5g NaCl/l；0.3g MgSO4×7 H2O/l；0.015g CaCl2×2 H2O/l；0.075gFeSO4×7 H2O/l；1g柠檬酸三钠×2 H2O/l及1ml微量元素溶液(参见以上所述)/l，5mg维生素B1/l及15mg四环素/l，用25％氨将pH调节至6.0)，将该发酵罐用实施例2所述的预培养物接种(在600nm的光密度约为3)。在发酵期间，温度设定在32℃且通过计量加入25％氨将pH保持在6.0恒定。向培养物内充入无菌压缩空气，充气速率为1.5vol/vol/min，搅拌器的搅拌速率为200rpm。氧饱和度降至50％后，通过控制装置将搅拌器的转速增至1200rpm，以仅维持50％氧饱和度(在900rpm下用校正至100％饱和度的pO2探针测定)。当发酵罐内葡萄糖含量自初始的15g/l降至约5-10g/l时，立即将56％的葡萄糖溶液计量加入。进料的流速为6-12ml/h，使发酵罐内的葡萄糖浓度维持在0.5-10g/l恒定。用YSI(Yellow Springs，Ohio，USA)提供的葡萄糖分析仪测定葡萄糖。发酵历时28小时。此段时间后，将试样移走并通过离心使细胞与培养基分开。用如实施例1所述的反相HPLC分析所得的培养物上清液。表1所示是培养物上清液内的主要代谢产物含量表1
pH高达5.5也得到类似的值。
权利要求
1.发酵制备O-乙酰基-L-丝氨酸的方法，在该方法中，在发酵培养基中培养微生物菌株，该微生物菌株衍生自野生型，且与野生型相比，其显示增加的O-乙酰基-L-丝氨酸内源形成以及增加的O-乙酰基-L-丝氨酸流出，所述方法包括将发酵培养基中的pH设置在5.1至6.5的范围内。
2.如权利要求1所述的方法，其中在发酵制备期间，发酵培养基的pH为5.5至6.5，特别优选为5.5至6.0。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中使用cysE等位基因实现与野生型相比增加的O-乙酰基-L-丝氨酸内源形成，所述等位基因编码经受较少反馈抑制的丝氨酸乙酰基转移酶。
4.如权利要求1至3之一所述的方法，其中使用ydeD基因实现与野生型相比增加的O-乙酰基-L-丝氨酸流出。
5.如权利要求1至4之一所述的方法，其中微生物菌株是大肠杆菌。
6.如权利要求1至5之一所述的方法，其中微生物菌株在发酵罐内以连续培养、以分批培养，或者优选地，以补料分批培养方式生长。
7.如权利要求1至6之一所述的方法，其中营养培养基含有硫源，其浓度为5-50mM硫。
8.如权利要求1至7之一所述的方法，其中在发酵制备期间连续计量加入碳源。
9.如权利要求8所述的方法，其中碳源选自糖、糖醇和有机酸。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中碳源选自葡萄糖、乳糖和甘油。
11.如权利要求8至10之一所述的方法，其中计量加入碳源以使在发酵期间存在的碳源为0.1-50g/l。
12.如权利要求1至11之一所述的方法，其中添加氨、铵盐或蛋白质水解产物作为氮源。
13.如权利要求1至12之一所述的方法，其中向发酵培养基中加入元素磷、氯、钠、镁、氮、钾、钙或铁的盐类及痕量(即μM浓度)的元素钼、硼、钴、锰、锌及镍的盐类。
14.如权利要求1至13之一所述的方法，其中向发酵培养基中加入有机酸(例如乙酸、柠檬酸)、氨基酸(例如异亮氨酸)和维生素(例如B1、B6)。
15.如权利要求1至14之一所述的方法，其中向发酵培养基中加入酵母提取物、玉米浆、大豆粕或麦芽汁。
16.如权利要求1至15之一所述的方法，其中培养温度为15至45℃，优选为30至37℃。
17.如权利要求1至16之一所述的方法，其中在需氧生长条件下实施所述方法。
18.如权利要求17所述的方法，其中通过由压缩空气或由纯氧将氧引入发酵罐而产生需氧生长条件。
19.如权利要求1至18之一所述的方法，其中选择的发酵时间为1至3天。
全文摘要
本发明涉及发酵制备O－乙酰基－L－丝氨酸的方法,在该方法中,在发酵培养基中培养微生物菌株,该微生物菌株衍生自野生型,且与野生型相比,其显示增加的O－乙酰基－L－丝氨酸内源形成以及增加的O－乙酰基－L－丝氨酸流出,所述方法包括将发酵培养基中的pH设置在5.1至6.5的范围内。
文档编号C12P13/00GK1370836SQ02104769
公开日2002年9月25日 申请日期2002年2月19日 优先权日2001年2月15日
发明者托马斯·迈尔, 托比亚斯·达斯勒, 奥古斯特·伯克 申请人:电化学工业有限公司(国际)