专利名称：肽载体的制作方法
背景技术：
本发明涉及一种可以使得基因转移而不具有细胞特异性且不会诱发宿主免疫反应的肽载体。
已知主要将病毒载体通过使用其细胞内渗能力而用于将基因导入活体。这些病毒载体例如包括腺病毒、疱疹病毒、反转录病毒等。
腺病毒是一种非包膜的双链DNA病毒且导致人体内轻微的上呼吸道感染、角膜结膜炎、肠胃炎等。腺病毒基因组约有36kb且易于通过使用常规的重组DNA技术控制。通过使腺病毒的尾丝染色纽(fiberknob)蛋白与细胞表面上的柯萨奇和腺病毒(coxackie & Adenovirus)受体(CAR)结合来启动病毒的细胞内渗。随后借助于细胞表面上整联蛋白(αvβ 3、αvβ 5)与壳体五邻体基质的相互作用、通过披网格蛋白的胞吞将病毒体导入细胞。然后在内体的低pH条件下引发病毒体衣壳蛋白的构象变化，从而使得病毒体衣壳蛋白释放到胞质中。在所述的蛋白质释放后，衣壳蛋白易位至核，其中进行其复制和转录。可以将基因的转录分成两种不同类型，即在复制前表达的早期基因(E)和在复制后表达的晚期基因(L)。用于基因疗法的腺病毒缺乏E1基因区而产生不完全的复制，由此将其用于含有插入其中的其它DNAs的形式中。因此，可以培养重组腺病毒载体以便使诸如HEK293这样可以连续表达E1基因的细胞系增加。
带有包膜的反转录病毒是一种单链RNA病毒，它带有约7～10kb的二倍体基因组且包括分别称作gag、pro、pol和env的4个基因组。基因组中的每一个编码结构衣壳蛋白、病毒蛋白酶、整合酶、逆转录酶、包膜和糖蛋白等。反转录病毒带有称作长末端重复序列(LTR)的包装信号(ψ)和顺式作用序列。开始通过使包膜糖蛋白与其细胞表面受体结合且随后通过使病毒包膜与细胞膜融合、由此将壳体核摄入所述细胞可以对细胞进行反转录病毒感染。一旦衣壳进入胞质，则壳体内侧的逆转录酶产生双链原病毒基因组，该基因组与整合酶形成一种复合体并移至核膜。当核膜在有丝分裂过程中消失时，所述的复合体开始进入核。导入核的原病毒基因组借助于整合酶插入宿主的染色体以便通过使用宿主转录仪表达病毒基因组。重组反转录病毒载体不表达任何病毒基因，这使得它与上述腺病毒载体区别开来，此时其全部基因被替代成除LTRs和ψ序列外的标记或治疗基因。为了培养这类重组反转录病毒，应以反式形式表达gag、pol和env的病毒基因，可以通过使用以稳定方式表达这些基因的细胞系来达到这一目的。
腺结合病毒属于细小病毒科且是一种带有短单链DNA基因组的简单病毒。腺结合病毒由两个属于rep(控制)和cap(结构)的可读框(ORF)和两个末端反向重复序列(ITRs)组成。末端反向重复序列是包壳和整合入宿主基因组所需的唯一部分，从而将其稳定地整合入第19条人染色体。然而，该病毒不具有自我生长能力，由此它仅能够在有诸如腺病毒或疱疹病毒等这样的辅助病毒存在的情况下生长。通过与带有在末端反向重复序列之间插入的转录单位的质粒和含有rep和cap可读框的质粒一起共转染来形成重组腺结合病毒，而此时需要用诸如腺病毒这样的辅助病毒进行轻感染。在对重组腺结合病毒进行纯化步骤后，可以将其用于基因疗法的应用。
单纯疱疹1型病毒是一种带有包膜的双链DNA病毒。它编码80或80个以上来自其152kb基因组的基因且在其包膜糖蛋白(gB、gC)与从全部类型的细胞膜中发现的胞外磷酸乙酰肝素结合时具有显著宽范围的宿主。当这种病毒进入宿主细胞时，宿主的病毒包膜糖蛋白gD和成纤维细胞生长因子(FGF)受体是必不可少的。可以将单纯疱疹病毒载体分成两种类型，即重组单纯疱疹病毒载体和扩增子载体，其中重组单纯疱疹病毒载体带有直接插入其基因组的转录单位；而扩增子载体是一种用辅助病毒感染的质粒，其中所述的质粒含有转录单位、复制起点和包装信号。使扩增子载体进行滚环复制，从而产生在包装过程中带有插入的多拷贝基因的单纯疱疹病毒。
上述那些病毒载体具有其自身的优点和缺点。对上述这些病毒载体来说常见的问题包括对可以被它们所感染的细胞范围有限制、即在可以接受它们的细胞存在限制，并且会通过宿主免疫反应产生失活。当这些类型的载体具有这类局限时，它们不适用于所有类型的细胞。
因此，已经作了许多努力来克服这些难题且这些努力中的大部分涉及使用细胞类型特异性启动子改变病毒感染特异性细胞的天然向性或仅在特异性细胞中表达转基因。然而，在任何这些努力中均没有令人满意的结果。
发明概述本发明的一个目的是提供一种不具有细胞特异性的肽载体。
本发明的另一个目的是提供一种不会诱发宿主细胞免疫反应的肽载体。
本发明的另一个目的是提供一种生产肽-DNA复合体的方法，该方法包括下列步骤使序列ID.No.1的肽和序列ID.No.2的DNA共价连接并使序列ID.No.3的DNA与序列ID.No.2的DNA杂交。
本发明的另一个目的是提供一种导入并表达所需基因的方法，该方法包括用一种包括前导肽、接头DNA和所需基因的肽载体感染靶细胞的步骤。
为了实现这些目的和其它目的，本发明提供了一种包括前导肽、接头DNA和所需基因的肽载体。
发明详述本发明涉及一种可以使得基因转移而不具有细胞特异性且不会诱发宿主免疫反应的肽载体。
本发明的肽载体由前导肽、接头DNA和所需的基因组成。所述的前导肽(seq.ID.No.1)具有如下所示的结构，通过分析预计在例如反转录病毒、副粘病毒(paramixovirus)等这样带有包膜的各种病毒中具有细胞膜融合能力的蛋白质来推定其氨基酸序列。通过细胞膜将该序列直接导入细胞。
<前导肽seq.ID.No.1>
Ac-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gly-Arg-Arg-Cys1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16突变 Ile Leu Arg Lys LeuIleArgGlaAsnSer*N-末端乙酰化(Ac)将乙酰基连接到N-末端胺基上以便消除与其它分子的反应。
*C-末端Cys将半胱氨酸(Cys)连接到C-末端上以便结合带有S-S键的接头DNA。
N-末端的4个氨基酸是非极性的且带有脂族侧链，使得它易于进入细胞膜；而接下来的两个(第5位和第6位)氨基酸是极性的且它们不带电荷，使得它们在插入第1-第4位氨基酸时可以维持其稳定性。第7-第15位氨基酸主要选自具有pKa值在10或10以上的碱性氨基酸，从而可以通过细胞内部的负电荷使它们嵌入细胞。第13位氨基酸可以是具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(Asn、Gln和Ser等)或带有具有非极性的脂族侧链的氨基酸(Ala、Leu和Ile等)或带有碱性侧链的氨基酸(Arg等)；这些氨基酸中的任意一种都不会影响其总体功能。可以将具有这类结构的肽最终用于带有膜结构的所有类型的细胞，此时将它不通过与膜受体结合而通过直接透入细胞膜导入细胞。
由15-18个碱基组成的接头DNA与前导肽和所需的基因连接且具有如下结构。
接头-1(seq.ID.No.2)5’-Cys-CTA-ATA-CGA-CTC-ACT-AT-3’接头-2(seq.ID.No.3)3’-GA-TAT-GCT-GAG-TGA-T-5’就接头-1而言，半胱氨酸与5’末端接合以便与前导肽结合；而就接头-2而言，通过使用T4聚激酶使磷酸基与5’末端连接以便与所需的基因结合。
接头DNA互补双链中仅一条链(接头-1，seq.ID.No.2)与前导肽共价结合，由此当该接头与所需的基因结合时，仅不与前导肽共价结合的另一条链(接头-2，seq.ID.No.3)可以与所需的基因共价结合，从而可以在核的内环境中易于将它从前导肽中分离。因此，所分离基因的两端是单链，此后能够方便地将它整合入宿主染色体的内部。
通过使用碱性磷酸酶除去5’末端上的磷酸基可以防止所需基因在其与所述载体结合过程中与接头-1 DNA结合。
为填补在用限制酶消化过程中形成的突出端而通过使用Taq聚合酶进行填补和末端腺苷酸化这一步骤使得结合更为便利，此时末端腺苷酸化与接头DNA在与载体结合过程的T突出端互补。
可以将具有诸如用于疗法这样的各种目的和用于特异性特征表达等的基因用作所需的基因。可以对选择的符合各目的的基因适当选择启动子和增强子。
根据来源于复合体的急性毒性的程度来确定由载体和转基因组成的复合体的适宜注射浓度。无论是传递还是表达转基因均可以通过从大脑、小脑、肝、肾、心脏、肺、肌肉和睾丸等中对DNA和mRNA取样并实施PCR和RT-PCR技术而观察到。
附
图1解释了本发明肽载体与所需基因之间的结合机理。
通过参照下列实施例来更具体地描述本发明，但这些实施例并不用来限定本发明的范围。
附图简述附图1表示本发明肽载体与所需基因之间的结合机理。
附图2表示通过PCR检测到的由脑和肌肉组织中的肽载体转移的标记基因mRNA的表达水平。
优选实施方案的具体描述实施例1肽载体的合成通过Fmoc-固相法合成前导肽(Seq.No.1)。
使半胱氨酸与接头-1 DNA(Seq.No.2)连接以便与所述前导肽结合且通过T4聚激酶使磷酸基与接头-2 DNA(Seq.No.3)的5’末端连接以便与标记基因结合。
在37℃下使分别为2nmols的前导肽与接头-1 DNA在缓冲溶液(50mM Tris、0.1mM EDTA、10mM DTT，pH 10.5)中反应1小时以便通过S-S键结合。在向上述溶液中添加2nmols的接头-2 DNA后，在60℃下进一步反应30分钟以便进行在5’末端激酶化(kinated)的接头-1 DNA与接头-2 DNA的杂交。然后将所得的溶液等分成100pmols(20pmols/μl)并维持在-20℃以下。实施例2标记基因的制备使用Quagen试剂盒从培养的用pCX-GFP转化的大肠杆菌中提取质粒。将提取的质粒用Bam H1和Sal I处理以便除去含有GFP的部分，然后使用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳。切下标记部分的带并用二氧化硅处理。
用碱性磷酸酶处理5μg的纯化GFP基因以便除去5’磷酸基。在碱性磷酸酶反应完成后，通过使用苯酚/氯仿/异戊醇溶液进一步纯化反应体系，然后用异丙醇和乙醇进行沉淀和纯化。为了填补在用限制酶消化过程中形成的突出端，通过使用Taq聚合酶进行填补和末端腺苷酸化。接着再次使用苯酚/氯仿/异戊醇溶液以及异丙醇和乙醇进行纯化。实施例3载体与标记基因的结合在16℃下，通过使用T4连接酶使获自实施例1的100pmols载体与获自实施例2的2μg标记基因在结合缓冲溶液(50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP，pH 7.5)中的结合反应进行4小时。实施例4mRNA的提取和使用RT-PCR的测定在从脑和肌肉组织中提取mRNA并合成cDNA后用PCR来研究注入各组织中的转基因的表达情况。
在第1、第3和第5天给雄性小鼠(200g重)经静脉内注射获自实施例3的转基因、注射剂量为500ng/天，然后在第6天对小鼠实施安死术。通过使用mRNA纯化试剂盒(ambion，Cat No.1918)从小鼠的脑和肌肉组织样品中提取mRNA。
向上述体系中加入1μg提取的mRNA、50pmols的寡脱氧胸苷酸或随机引物和核糖核酸酶抑制剂(40个单位)并通过添加蒸馏水将总体积调节至50μl、在96℃下变性10分钟并在60℃下退火30分钟。向其中加入由1.25mM dNTP、2mMs DTT、核糖核酸酶抑制剂(40个单位)和MMLV逆转录酶(200个单位，ambion)组成的反应缓冲液并在42℃下反应1小时。在该反应完成后，用异丙醇和乙醇使反应体系沉淀和纯化并重新悬浮于蒸馏水中。
在合成cDNA后，使用GFP特异性引物[GFP-f(Seq.ID.No.4)、GFP-r(Seq.ID.No.5)]进行PCR，应用Taq聚合酶(Takara)进行。在PCR完成后，在2％琼脂糖凝胶上进行电泳以便找到一条带。
<GFP特异性引物>
GFP-f5’-TGAAGGTGATGCAACATACGG-3’(Seq.No.4)GFP-r5’-GTCTTGTAGTTCCCGTCATC-3’(Seq.No.5)PCR的结果如附图2中所示泳道1是脑、泳道2是肌肉、泳道3和4是阴性对照、泳道5是阳性对照且泳道6是大小标记。大小标记从上到下为1353、1078、872、603、310、281、271、234、194、118和72bp。
正如从附图2中可以观察到的，在泳道1(脑)和泳道2(肌肉)的234bp位置上观察到了GFP cDNA的强带。因此，可以观察到它在脑和肌肉组织中被有效地表达。
本发明的肽载体不同于常见的病毒载体，它可以将基因传递到所有类型的细胞而没有组织特异性向性且不会诱发宿主的免疫反应，这是由于其小尺寸相当于半抗原的水平所导致的。
可以将本发明的肽载体广泛用于各种领域例如用于基因疗法、一般细胞培养过程中的基因转染和转导的动物或植物的生产；从而加速人类基因组计划完成后进行的与基因功能相关的研究。
序列表<110>CHAE，Young Jin<120>肽载体<130>01PG037<150>KR 2001-6587<151>2001-02-10<160>5<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>N-末端Gly被乙酰化，第2个a.a可以被Ile取代，第4个a.a可以被Leu取代，第10个a.a可以被Arg取代，第11个a.a可以被Lys取代，第13个a.a可以被Leu、Ile、Arg、Gln、Asn和Ser之一取代。<400>1Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gly Arg Arg Cys1 5 10 15<210>2<211>17<212>DNA<213 人工序列<220><223> 接头-1 DNAc的5′末端与Cys形成酯键序列表<400>2ctaatacgac tcactat 17<210>3<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>接头-2 DNA<400>3tagtgagtcg tattag 16<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>GFP-f特异性引物<400>4tgaaggtgat gcaacatacg g 21<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>GFP-r特异性引物序列表<400>5gtcttgtagt tcccgtcatc 20
权利要求
1.一种肽载体，它包括前导肽、接头DNA和所需的基因。
2.根据权利要求1所述的肽载体，其中所述的前导肽包括序列ID.No.1。
3.根据权利要求1-2所述的肽载体，其中所述的接头DNA包括序列ID.Nos.2和3。
4.一种包括序列ID.No.1的肽和序列ID.Nos.2和3的DNA的肽-DNA复合体。
5.一种生产肽-DNA复合体的方法，该方法包括下列步骤使序列ID.No.1的肽和序列ID.No.2的DNA共价连接并使序列ID.No.3的DNA与和序列ID.No.2的DNA杂交。
6.一种导入并表达所需基因的方法，该方法包括用一种包括前导肽、接头DNA和所需基因的肽载体感染靶细胞的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的前导肽包括序列ID.No.1。
8.根据权利要求6-7所述的方法，其中所述的接头DNA包括序列ID.Nos.2和3。
全文摘要
本发明涉及一种包括前导肽、接头DNA和所需基因的肽载体。这种肽载体可以使得基因转移而不具有细胞特异性且不会诱发宿主的免疫反应。
文档编号C12P21/02GK1374321SQ02104729
公开日2002年10月16日 申请日期2002年2月9日 优先权日2001年2月10日
发明者蔡莹镇 申请人:蔡莹镇