专利名称：小鼠白细胞介素-17受体样蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种白细胞介素-17受体样蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种小鼠白细胞介素-17受体样蛋白及其编码基因与应用。
尽管目前至少已克隆了7种IL-17家族成员，但有关该家族成员的受体研究却知之甚少。IL-17R是第一个被鉴定的IL-17受体家族成员，广泛表达于多种不同的组织。但是，IL-17与IL-17R的亲和力较弱，与IL-17具有的广泛的生物学功能并不匹配，并且IL-17R并不含有与先前已知蛋白相似的结构。IL-17Rh1/IL-17BR与IL-17R一样，并不含有与先前已知蛋白相似的结构域，但它们的胞外结构域具有保守的胱氨酸残基，胞内结构域含有与IL-17R相似的氨基酸残基序列，暗示它们可能具有相似的下游信号事件。研究结果表明NF-κB是它们共同介导的下游信号分子。
IL-17E/IL-25是一种结构与功能相似于IL-17A的促炎症细胞因子，主要表达于活化的TH2 T细胞。IL-17E能够诱导某些细胞因子的表达，包括IL-8，IL-4，IL-5，IL-13，ICAM-1和IL-6。同时，IL-17E还能通过其低亲和力受体IL-17ER/IL-17BR/IL-17Rh1介导转录因子NF-κB的活化。IL-17E在小鼠的增强表达能诱导小鼠生长延缓、黄疸、多器官炎症等疾病症状和一种TH2型的炎症应答。IL-17B和IL-17C是IL-17家族的另外两个细胞因子，与IL-17有27％的氨基酸一致性。IL-17B信使RNA表达在前列腺、小肠、胃。IL-17B和IL-17C能够诱导人急性单核白血病细胞系THP-1释放IL-1β和TNF-α.并能与THP-1细胞有一定的结合力。最近，Hzamas等分离和克隆了一种新的IL-17相似的细胞因子，命名为IL-17D/IL-27，该细胞因子优先表达于骨骼肌、脂肪组织和中枢神经组织，诱导内皮细胞分泌IL-6、IL-8和GM-CSF等细胞因子，并能抑制造血功能。
曾报道，IL-17A能诱导核转录因子NF-κB的活化，另外也有研究结果表明IL-17A所诱导的下游信号事件包括活化胞外调控激酶(ERK-1/ERK-2)，氮末端激酶(JNK，c-Jun)，p38有丝分裂原激酶，Raf、Stats等下游信号分子。IL-17AR的敲基因小鼠研究表明，在肿瘤坏死因子-α结合因子-6(TRAF-6)缺陷的细胞系，IL-17诱导的下游信号事件明显阻断，提示TRAF-6对于IL-17刺激的信号是必要的。由于已知的几种IL-17受体成员的胞内结构域并不含有与Toll/IL-1R相似的结构，因此寻找和鉴定未知的IL-17家族成员的潜在受体显得尤其必要。
一种小鼠白细胞介素-17受体样蛋白，它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
本发明的小鼠白细胞介素-17受体样蛋白命名为mIL-17RLM-L，是一种I型单跨膜细胞因子受体，由738个氨基酸残基组成。mIL-17RLM-L氮末端含有一个17个氨基酸组成的信号肽。
本发明采用多组织Northern Blot方法，检测了mIL-17RLM-L的mRNA组织表达分布，结果表明mIL-17RLM-L mRNA主要在小鼠肾、肺表达，在心、脑有微弱表达，在消化系统组织如小肠和结肠未检测到表达。其RNA转录本约8.5kb大小。
本发明的第二个目的是提供编码小鼠白细胞介素-17受体样蛋白的基因。
一种小鼠白细胞介素-17受体样蛋白的编码基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
本发明小鼠白细胞介素-17受体样蛋白mIL-17RLM-L的编码基因由2224个碱基组成，位于小鼠的14号染色体上。
研究表明，本发明的小鼠白细胞介素-17受体样蛋白具有使Stat5因子活化、介导细胞增殖等作用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
根据EST拼接和hIL-17RLM(595aa)的人类基因组结构，以及蛋白blast NCBI EST和trace数据库而预测到hIL-17RLM(595aa)存在一个更长的选择性剪切形式，这种选择性剪切形式同样存在小鼠的同源物，命名为mIL-17RLM-L。
根据预测的mIL-17RLM-L的cDNA序列，设计引物，将其分子克隆。以小鼠总RNA为模板，通过RT-PCR，克隆到2.2kb左右的片段，进而将其克隆到T-A载体，并测序。测序结果与预测的编码cDNA完全一致。其5’端未翻译区含有终止密码子及Kozak序列，长度为2224bp。编码一个由738个氨基酸组成的单跨膜糖蛋白。按照SignalP信号肽预测软件分析结果，其含有一个由17个氨基酸组成的信号肽MAPWLQLCSFFFTVNAC。
实施例2、mIL-17RLM-L胞内结构域的功能——活化Stat5mIL-17RLM-L胞内区含有潜在的TIR结构域，IL-17R样结构域，SH3相互作用结构域和众多的酪氨酸磷酸化位点，提示其胞内区可能具有潜在的信号潜力。本发明的发明人构建了一系列嵌合受体，通过对mIL-17RLM-L胞内区人工二聚化，证实了其传递信号的能力。
发明人将EPOR的胞外区和跨膜区与mIL-17RLM的胞内区构建一嵌合受体，借助EPO的刺激，进而检测mIL-17RLM-L的胞内区传递信号的潜力。首先进行了荧光素酶报道分析，瞬时共转染指示的受体表达质粒，Stat5应答的荧光素酶报道质粒4FTKSLN，pRL-TK载体(内对照)，转染36小时后，使用重组EPO刺激或不刺激(PBS)约30分钟后，收获细胞，进行荧光素酶报道分析。结果显示EPOR/mIL-17RLM-L嵌合受体与全长EPOR一样，在EPO的刺激作用下，能够介导Stat5的活化；并且当共转染Stat5的负显性突变体(dominant mutant)-Stat5 CYF时，EPOR/mIL-17RLM-L嵌合受体介导Stat5的活化被明显抑止；全长mIL-17RLM-L的过表达并不能介导Stat5的活化。这个结果暗示，mIL-17RLM-L的胞内区具有能够介导Stat5活化的潜力。
Stat5活化的一个重要标志是其在Jak激酶的作用下，Stat5的酪氨酸被磷酸化，然后转位入核，介导下游靶基因的表达。为了进一步检测mIL-17RLM-L的胞内区介导Stat5活化的潜力，采用免疫沉淀方法，检测EPOR/mIL-17RLM-L是否能够介导Stat5酪氨酸磷酸化。在Cos7细胞共转染嵌合受体-EPORextm/mIL-17RLM-Licd或全长EPOR或空载体(Mock)，Jak2，stat5高纯度表达质粒。在EPO刺激前30分钟，培养基中补加NaV3O4以抑制内源性磷酸化酶的水解。使用重组EPO刺激或不刺激(PBS)约30分钟后，收获细胞，制备总细胞裂解液，一部分用于免疫沉淀，另一部分直接用于Western blot以检测转染质粒的表达情况。结果表明EPORextm/mIL-17RLM-Licd嵌合受体同EPOR一样，在EPO的刺激下，能够介导Stat5酪氨酸磷酸化；而在EPO未刺激组和空载体组，并未检测到Stat5酪氨酸磷酸化。这一结果进一步表明mIL-17RLM-L的胞内区能够介导Stat5酪氨酸磷酸化。
为了进一步证实mIL-17RLM-L胞内区具有介导Stat5活化的潜力，采用gel shiftassay以分析是否EPOR/mIL-17RLM-L嵌合受体能够介导细胞核抽提物Stat5-DNA结合复合体的形成，以证实其介导Stat5活化。具体做法是共转染指示的表达质粒于Cos7细胞，在EPO的作用后，制备细胞核抽提物，进行凝胶电泳阻滞分析实验。实验结果显示EPORextm/mIL-17RLM-Licd嵌合受体同EPOR一样，在EPO的刺激下，能够介导Stat5-DNA结合复合体的形成；而在EPO未刺激组和空载体组，并未检测到Stat5-DNA结合复合体的形成。采用冰冷的未标记的特异性结合Stat5的DNA探针，能够竞争性抑止Stat5-DNA结合复合体的形成。这一结果表明mIL-17RLM-L胞内区具有介导特异性Stat5-DNA结合复合体形成的特性。
为了进一步确定Stat5-DNA结合复合体的特异性和Stat5具体成分，分别借助抗Stat5ab，Stat5b，Stat1和Stat3特异性抗体，进行了Supershift分析实验。结果显示抗Stat5ab或Stat5b能够显著超迁移这个DNA结合复合体，而Stat1或Stat3特异性抗体却并不能超迁移这个DNA结合复合体，暗示EPOR/mIL-17RLM-L嵌合受体所介导的Stat5-DNA结合复合体主要为Stat5b-DNA复合体。这一结果进一步表明了mIL-17RLM-L胞内区具有活化Stat5信号的潜力。
实施例3、mIL-17RLM-L胞内结构域介导细胞增殖的作用通常，I型细胞因子受体应答其偶连配体具有传递细胞增殖的信号能力。借助[3H]-Thymidine整合，进行了细胞增殖分析实验。结果表明EPORextm/mIL-17RLM-Licd嵌和受体稳定表达的细胞系和EPOR稳定表达的细胞系一样，能够应答EPO的刺激，出现细胞增殖现象，并且这种增殖效应为EPO浓度依赖的方式和刺激时间依赖的方式。这暗示mIL-17RLM-L的胞内结构域具有传递细胞增殖的信号潜力。
序列表<160>2<210>1<211>2224<212>DNA<213>小鼠属小鼠种BALB/c品系(Mus musculus strain BALB/c)<400>1caactgggcg agcgtacggc catggccccg tggctgcagc tctgctcctt cttcttcact 60gtcaacgcct gtctcaacgg ctcgcagctg gcagtggccg cgggcggctc cggccgcgcg120aggggcgcgg acacctgtgg ctggagggga gtggggccgg ccagcaggaa cagcggactg180cacaacatca ccttcagata cgacaactgt accacctact tgaatcccgg cgggaagcat240gcgattgctg atgctcagaa catcaccatc agccagtacg cttgccacga ccaggtggca300gtcaccattc tttggtcccc aggggccctt ggcattgaat tcctaaaagg attccgagtc360atcctggagg agctgaagtc ggagggcaga cagtgccaac agctgattct aaaggacccc420aaacagctca acagcagctt cagaaggact ggaatggaat ctcagccttt cctgaatatg480aaatttgaga cggattactt tgtaaagatt gtccctttcc cttccattaa aaatgaaagc540aattaccatc ccttcttctt cagaacacgg gcctgtgacc tgttgttaca acctgacaac600ttggcctgta agcctttctg gaagcctcga aacctgaata tcagccagca tggttctgac660atgcacgtgt ccttcgacca tgccccgcag aacttcggct tccgtggctt ccatgttctc720tataagctca agcacgaagg ccccttcagg cggaggactt gcaggcagga ccagaataca780gagacaacca gctgcctcct 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700 705Asp Pro Pro Thr Leu Pro Ser Lys Leu Leu Ala Ser Gly Val Ser710 715 720Arg Glu His Gly Cys His Ser His Thr Asp Glu Leu Gln Ala Leu725 730 735Ala Pro Leu738
权利要求
1.一种小鼠白细胞介素-17受体样蛋白，它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于所述蛋白质具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。
3.一种小鼠白细胞介素-17受体样蛋白的编码基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述小鼠白细胞介素-17受体样蛋白的编码基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.权利要求1所述的小鼠白细胞介素-17受体样蛋白在使Stat5因子活化中的应用。
6.权利要求1所述的小鼠白细胞介素-17受体样蛋白在介导细胞增殖中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种小鼠白细胞介素－17受体样蛋白及其编码基因与应用。本发明的目的是提供一种新的小鼠白细胞介素－17受体样蛋白及其编码基因。一种小鼠白细胞介素－17受体样蛋白，它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。一种小鼠白细胞介素－17受体样蛋白的编码基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的小鼠白细胞介素－17受体样蛋白具有使Stat5因子活化、介导细胞增殖的作用。
文档编号C12N15/24GK1465594SQ0212354
公开日2004年1月7日 申请日期2002年7月1日 优先权日2002年7月1日
发明者熊世勤, 常智杰, 傅新元 申请人:清华大学