专利名称：一种去除卵母细胞核的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中一种去除卵母细胞核的方法。
在上述过程中，去核是否完全是核移植成功的关键环节之一，去核不完全将导致其与供体核融合后产生的重构胚染色体套数异常，最终胚胎因发育受阻而流产或死亡。
目前在培育克隆动物中普遍使用的去核方法是物理的机械去核法，其过程如
图1所示，是用显微操作的方法将特殊加工的毛细玻璃管插入到MII期的卵母细胞内，吸除核物质，得到去核卵。常用的机械去核方法主要有以下几种1.盲吸法将卵母细胞固定在持卵针上，极体就会位于时钟2点的位置，去核针插入透明带内，吸去极体及其下部的1/4-1/3的胞质。因为没有确切的看到核物质，所以称其为“盲吸法”。用这一方法去核，必然会有一部分卵的核没有去掉或没有完全去掉，因为第一极体在卵周隙中是可以自由游动的，而且随着极体排出时间的延长，其与染色体的相对位置会发生很大变化，因而以第一极体作参照，估计染色体的位置来去核，准确性不高。
2.Hochest33342染色法Hochest33342是一种DNA活性荧光染料，可与DNA特异结合，经紫外光激发后发蓝色荧光，因此卵母细胞经Hochest33342染色后在紫外显微镜下可被准确去核。但是紫外光照射卵母细胞如果超过15sec，就会对卵胞质产生损伤，特别是对线粒体的伤害尤为严重，从而影响重构胚的发育。
3.极化显微镜(Pol-scope)下去核法极化显微镜是将液晶与电光控制及软件结合起来的光学系统，利用圆偏振光显示双折射结构，与样品的定位无关，从而加速了对双折射结构的定量光观察。Liu等用Pol-scope能清楚地观察到几种不同的品系小鼠(C57B6、CF-1、CD-1和B6C3F1)和仓鼠卵母细胞的纺锤体，去核效率达100％，并且仅有5.5％的卵胞质线粒体被吸去，由于卵胞质的容量是影响重构胚发育的重要因素，所以有利于重构胚的发育。虽然在Nomarski imaging系统下可以模糊地看到几种品系小鼠纺锤体和中期板结构，但对于大多数动物来说，如绵羊、牛、猪、以及其他一些品系的小鼠(如B6C3F1)，该光学系统则不起作用，因为这些动物的卵母细胞中含有大量的脂肪使其在光镜下呈黑色，影响核物质的观察。然而，Liu等研究又发现，用Pol-scope也能清楚地观察到人和牛的卵母细胞中的纺锤体和中期板，这说明用Pol-scope观察不受卵母细胞中脂肪颗粒多少的影响。但是这套装置价值昂贵，应用范围有限，不利于大量推广。
4.蔗糖显示法Wang等发现用2.5％的蔗糖处理小鼠的卵母细胞3-5分钟后，可以看到染色体部位反射光明显增加，并向卵周隙突起。这样就可以在光镜下直接去核，且准确率100％。最近由杨向中领导的课题组在牛的核移植中也运用了这一方法，他们将蔗糖浓度提高到0.3M时取得了较好的效果。
以上四种去核方法均需要熟练的显微操作技术，设备昂贵、速度极慢、效率很低，从而大大限制了核移植技术的广泛使用。采用物理去核法，即使是熟练操作也会造成20％的细胞死亡，而且在此过程中，对卵母细胞的损伤是很大的，除了移走染色体外，还不可避免地造成细胞质含量的减少和一些重要的、存在于胞质中的核相关蛋白的丢失，并会对细胞骨架造成极大的伤害，有损于细胞质对移植核重编程的支持能力，有可能导致胎儿的流产、畸形或死亡。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种去除卵母细胞核的方法，首先用能够将染色体与极体牢固结合的化学物质处理卵母细胞，然后再用能够诱导极体排出的化学物质处理卵母细胞。
在上述过程中，所述能够将染色体与极体牢固结合的化学物质优选的是脱羧秋水仙碱，其浓度一般是4-6μg/mL，作用时间为1.5-2.5小时；所述能够诱导极体排出的化学物质优选的是放线菌酮或者是放线菌酮与脱羧秋水仙碱的混合物，放线菌酮单独使用时的浓度较好的是40-60μg/mL，放线菌酮与脱羧秋水仙碱混合使用时的浓度较好的是放线菌酮的浓度是40-60μg/mL，脱羧秋水仙碱的浓度是4-6μg/mL。
本发明巧妙地将第一次或第二次减数分裂时的卵母细胞用脱羧秋水仙碱对纺锤体的纺锤丝进行固定，使其不能与极体分离，随后卵母细胞在放线菌酮的诱导作用下排出极体，并将染色体一并带出，极体在之后的发育过程中自然退化，达到去除卵母细胞核的目的。卵母细胞中的全部染色体以极体的形式完全排出，同物理方法相比卵母细胞质损失少，对细胞的机械伤害小，尤其是对细胞骨架无伤害，有利于以后重构胚的正常生长发育。图2是自然条件下极体的释放过程，图3是用本发明方法去核与极体的释放过程，图中，1是GV期的卵母细胞，2是MI期的卵母细胞，3是MII期的卵母细胞，4是MI期或MII期的卵母细胞，5是用脱羧秋水仙碱与放线菌酮处理的卵母细胞，6是排出了极体的卵母细胞，7是去核卵细胞。
本发明的方法具有操作简单、实用性强、对卵母细胞的损伤小、去核率高等特点，并且所使用药物对卵母细胞的毒性小，去核过程可逆，所得卵母细胞的各项参数均适合于移植核的重新程序化，去核率可达90％以上。
应用本发明的方法去除卵母细胞的细胞核，省时、高效，可同时处理大量的卵母细胞，使克隆动物的培育过程大大简化，提高克隆的效率。
图2为自然条件下极体的释放过程。
图3为用本发明方法去核与极体的释放过程。
图4为去核的卵母细胞。
权利要求
1.一种去除卵母细胞核的方法，首先用能够将染色体与极体牢固结合的化学物质处理卵母细胞，然后再用能够诱导极体排出的化学物质处理卵母细胞。
2.根据权利要求1所述的去除卵母细胞核的方法，其特征在于所述能够将染色体与极体牢固结合的化学物质是脱羧秋水仙碱。
3.根据权利要求2所述的去除卵母细胞核的方法，其特征在于所述脱羧秋水仙碱的浓度是4-6μg/mL，作用时间是1.5-2.5小时。
4.根据权利要求1所述的去除卵母细胞核的方法，其特征在于所述能够诱导极体排出的化学物质是放线菌酮。
5.根据权利要求4所述的去除卵母细胞核的方法，其特征在于所述放线菌酮的浓度是40-60μg/mL。
6.根据权利要求1所述的去除卵母细胞核的方法，其特征在于所述能够诱导极体排出的化学物质是放线菌酮与脱羧秋水仙碱的混合物。
7.根据权利要求6所述的去除卵母细胞核的方法，其特征在于所述放线菌酮的浓度是40-60μg/mL；所述脱羧秋水仙碱的浓度是4-6μg/mL。
全文摘要
本发明公开了一种去除卵母细胞核的方法，目的是使卵母细胞核能够简单、无害地被去除。本发明所采用的技术方案是首先用能够将染色体与极体牢固结合的化学物质处理卵母细胞，然后再用能够诱导极体排出的化学物质处理卵母细胞。在上述过程中，能够将染色体与极体牢固结合的化学物质优选的是脱羧秋水仙碱，能够诱导极体排出的化学物质优选的是放线菌酮或者是放线菌酮与脱羧秋水仙碱的混合物。应用本发明的方法去除卵母细胞的细胞核，省时、高效，可同时处理大量的卵母细胞，使克隆动物的培育过程大大简化，提高克隆的效率。
文档编号C12N5/12GK1473928SQ0212603
公开日2004年2月11日 申请日期2002年8月9日 优先权日2002年8月9日
发明者戴蕴平, 李宁, 杜卫华 申请人:戴蕴平, 李宁