专利名称：细胞质型1,6-二磷酸果糖酶基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中基因的启动子及其应用，特别是涉及细胞质型1，6-二磷酸果糖酶基因启动子及其应用。
背景技本基因工程的最终目的是按人们的意愿在特定组织或器官中特异性地表达外源基因，利用特异性表达的启动子有助于该目的实现。目前，一些具有不同表达特征与特性的启动子已从植物中分离出来，一批顺式调控元件，如与光调节有关的元件(Kuhlemeier et al.1989)、器官特异性表达的元件(Rosahl et al.1987)、组织特异性表达的元件(Gilmartin et al.1990)、以及与温度调节有关的元件(Callis et al.1988)已被鉴定。这些特异性表达启动子或顺式调控元件与外源基因的结合，可以使外源基因在特定的器官或组织中表达(Claes et al.1991)。
高等植物中，由核基因编码的细胞质型1，6-二磷酸果糖酶(cyFBPase)与磷酸蔗糖合酶是蔗糖合成的限速酶。细胞质型1，6-二磷酸果糖酶催化1，6-二磷酸果糖转变为6-磷酸果糖和无机磷酸，与磷酸果糖激酶及焦磷酸1，6-二磷酸转移酶共同作用，调控蔗糖合成途径中的一个必需单糖的生成(An et al.1990)。对水稻中细胞质型1，6-二磷酸果糖酶表达模式的研究表明，在叶片和叶鞘中均有其转录产物，且叶鞘中的转录产物在抽穗后增加，抽穗之前的花序和根中都没检测到转录产物(Taniguchi et al.2000a)。目前，在水稻中应用的组成型启动子主要为CaMV 35S、Adh1、actin1、ubiquitin启动子，CaMV 35S启动子在单子叶植物中的表达较低，使其利用受到了限制；其它三个启动子的表达都需要包含第一个内含子，使启动子区的序列比较长，且在启动子区含有多个基因工程中常用的酶切位点，给亚克隆造成了很大的麻烦。
发明内容
本发明的目的是提供细胞质型1，6-二磷酸果糖酶基因的启动子。
本发明所提供的细胞质型1，6-二磷酸果糖酶基因启动子，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)序列表中序列1的缺失体DNA序列；3)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
序列表中序列1的DNA由1195个碱基组成。自5’端的第232-237位核苷酸为I盒；自5’端的第624-628位核苷酸为CGTCA盒；自5’端的第984-992位核苷酸为TATA盒；自5’端的第1007-1016位核苷酸为两个串联的CGTCA盒。如果将编码1，6-二磷酸果糖酶的读码框自5’端的第一个核苷酸命名为+1的话，本发明启动子自5’端的编号也可以用-1195到-1来表示。
所述缺失体DNA序列为序列表中序列1自5’端分别缺失了93bp、427bp、551bp个核苷酸而形成的缺失体DNA序列。
含有本发明启动子及其缺失体部分序列的表达载体、细胞系均属于本发明的保护范围。
本发明启动子的发现和其表达模式及功能的阐明，对于植物特别是禾本科单子叶植物，如水稻、玉米、小麦、大麦或谷子等代谢的精细调控和生物技术育种具有重要意义，为今后在植物中特异性表达外源基因提供了新型有效的启动子或顺式元件。水稻叶肉细胞特异性表达的启动子可以用来研究及改善植物代谢及源库关系，最终达到改善品质或者提高产量的目的。对于一些以叶片为主要侵染部位的病虫害，也可以用叶肉细胞特异性的启动子来调控抗性基因的表达，增加作物的抗性。
水稻cyFBPase启动子ATG上游-1102，-768bp及-644bp的序列就可以使报告基因在水稻中有很强的组成性表达，序列非常短；并且在这段序列中无常用酶切位点，为其在水稻表达载体的构建方面提供了很大的优势，可作为替代CaMV 35S，actin1，Ubiquitin等组成性启动子用于各种基因操作。
对转基因植株种子的分析表明，cyFBPase启动子在成熟胚乳中没有表达，这种模式可以部分地解决食品安全性的问题。
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
图1为Genome walking中第一轮及第二轮扩增结果。
图2为pA嵌合基因质粒结构模式图。
图3为pA转基因植株中的GUS活性检测结果。
图4为转基因水稻不同组织切片，显示cyFBPase启动子在转基因水稻中表达的组织化学定位。
图5为不同器官的GUS活性，显示cyFBPase启动子在转基因水稻不同器官中的表达。
图6为不同的cyFBPase启动子5’端缺失的植物表达载体图谱。
图7为不同缺失体转基因水稻成熟叶片的组织化学定位。
图8为pB、pC、pD三个缺失体转基因水稻叶鞘、茎、根的组织化学定位。
图9为GUS基因在四个缺失体转基因植株根、茎、叶鞘中的活性比较。
图10为GUS基因在种子中的表达活性检测。
图11为四个缺失体未抽出叶片及花粉的组织化学定位，显示GUS基因的表达。
图12为GUS基因在其它器官的活性表达检测。
具体实施例在本发明的实施例中所用到的材料包括大肠杆菌(Escherichia coli)株系DH5α；双元载体pCAMBIA 1391Z(在T-DNA左右边界区内带有可供植物选择用潮霉素抗性基因)；水稻(Oryza sativa L.)品系明恢63(MH63)、8706；烟草(Nicotianatobacum)品系中华大烟草；购自BIOLAB、SIGMA、GIBCO、BOEHRINGER、BIO-RAD、QIAGEN、及华美公司的限制性内切酶、修饰酶等试剂。
实施例1、水稻基因组文库的构建水稻品种MH63在无蔗糖的MS培养基上发芽，生长两周后，从叶片中提取DNA。大约2.5μg水稻总DNA分别被产生平端的5种酶(DraI、EcoRV、PvuII、ScaI、StuI)酶解过夜，完全酶解的DNA片段分别用酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇各抽提一次，乙醇沉淀。四种酶消化的片段(DraI、EcoRV、ScaI、StuI)与接头(adapter)在16℃连接过夜，产生4个文库，记为DraI、EcoRV、ScaI、StuI。
实施例2、分离启动子用Genome walking方法分离启动子，具体按Genome walkerTM(K1807)试剂盒进行。首先用基因特异性引物1(GSP1)5’TCT GCT CGT TCA GCA CGT ACC GCG TGATCG3’和接头引物1(AP1)5’GTA AAT ACG ACT CAC TAT AGG GC3’按下列条件扩增94℃ 4min后，94℃ 2sec，72℃ 3min走7个循环；然后94℃ 2sec，67℃ 3min走35个循环；最后67℃延伸7min。第一轮扩增后，取5μl产物检测，从DraI、EcoRV、StuI的文库中分别得到1.8kb、2.5kb和0.8kb的片段。
PCR产物按1∶50稀释后，取1μl用于第二轮扩增。所用引物为基因特异性引物2(GSP2)5’GTC CGG TAC GCG TCC GCC TCG TGA TCC ATC 3’和接头引物2(AP2)5’ACT ATA GGG CAC GCG TGG T 3’按下列条件扩增94℃ 4min后，94℃ 2sec，72℃ 3min走5个循环；然后94℃ 2sec，65℃ 3min走25个循环；最后65℃延伸7min。PCR产物用QIAGEN凝胶回收试剂盒回收后，连接到PCRII载体上。序列分析表明来自不同文库的产物是同一个片段，但与1，6-二磷酸果糖酶基因的cDNA相比不具同源性。因此，又设计了两个基因特异性引物(GSP3)5 CAC GTC CAG CTT CTT CTG CTCCTC TCC3’和(GSP4)5 GAC GAA CTT GCA GCC AAG CAC GAT GTG3’进行第二次Genomewalking扩增，在第一轮扩增后，分别从DraI、EcoRV、StuI中得到1.6kb、2.8kb、0.7kb的扩增片段；第二轮扩增后，分别从DraI、EcoRV、ScaI中得到1.4kb、2.6kb、2.8kb的扩增片段(结果如图1所示，图中A为第一轮扩增结果，B为第二轮扩增结果，1，61kb Marker；2DraI；3EcoRV；4ScaI；5StuI)，其中1.4kb的片段被克隆到PCRII载体中，测序后与1，6-二磷酸果糖酶基因cDNA序列比较，此片段与细胞质型1，6-二磷酸果糖酶基因cDNA重叠的那段序列中没有发现任何碱基差异，证明此片段为细胞质型1，6-二磷酸果糖酶基因5’端上游启动子序列。此克隆记为DraI-1，由1195个核苷酸组成，为序列表中的序列1。对cyFBPase启动子序列进行分析，没有发现典型的CCAAT盒，TATA盒在984-992bp处。一个保守CGTCA盒在624-628处有一个拷贝，在1007-1016bp存在两个串联重复拷贝，此元件在35S启动子中出现两次，在小麦组氨酸H3启动子中出现一次，可能与启动子的特异性表达有关。在232-237bp处存在一与光诱导有关的I盒(GATAAG)，在这段上游序列中没有发现典型的G盒和AT富含区。
实施例3、水稻启动子cyFBPase-PromoterGUS植物表达载体的构建及其在转基因水稻中的表达特异性分析为了鉴定cyFBPase启动子的表达特性，把cyFBPase基因翻译起始位点上游-1195bp的序列插入双元表达载体pCAMBIAP-1391Z中，即用引物1(正向序列)5’-AAG GAT CCG CAC CAC TCT CCT CAG-3’和引物2(反向序列)5’-AAG GAT CCA CAGGAA ACA GCT ATG ACC-3’从DraI-1的克隆中扩增出1195bp的cyFBPase启动子5’端上游序列，因上述两引物均含有BamHI酶切位点，所以用此酶酶解PCR产物，然后克隆到pCAMBIA1391Z载体中，用EcoRI酶解检测方向，构建成cyFBPase-PromoterGUS植物表达载体，记为pA。pA嵌合基因质粒结构模式如图2所示，其中35S-pro、FBP-pro指35S CaMV、水稻cyFBPase启动子；Nos-ter为NOS终止子；Hygromycin为潮霉素筛选抗性基因；GUS为E.coli β-葡萄糖苷酸酶报告基因。
对pA载体的12株不同来源转化株的GUS活性进行了荧光定量分析，结果表明，转基因水稻成熟叶片中GUS活性比在非转化植株中高5-430倍，活性最低的为316.8pmol.min-1.mg-1，最高为30,286.4pmol.min-1.mg-1，平均达7,031.5pmol.min-1.mg-1(如图3所示，图中WT阴性对照；2、4、6、8、9、10、11、16、18、20、21、36为转基因植株。)
将转基因水稻不同组织作切片，对GUS活性进行组织化学检测，以便在细胞学上对GUS基因的表达进行定位。结果如图4所示，图中a成熟叶片；b叶鞘；c茎；d根；e稃片；f穗轴；g穗茎上部，从图中可以看出，在转pA载体的水稻成熟叶片中，GUS基因仅仅在叶肉细胞中表达，而在皮层细胞、表皮细胞、泡状细胞和维管组织中均无表达。在叶鞘中的表达模式与叶片中相似，GUS基因的表达也仅限于叶肉细胞，其它组织中没有表达。在茎、根中未检测到GUS活性。在开花期花的稃片中，GUS基因在外层的类叶肉细胞中有一定量的表达，在穗轴及穗茎上部，GUS基因的表达也仅限于类叶肉细胞中，但在穗茎的下部(被旗叶的叶鞘包裹的部分)，GUS基因则没有表达。未转化株在所采用的检测条件下均无蓝色反应，排除了背景的干扰，说明cyFBPase基因启动子是叶肉细胞特异性表达。
为了进一步研究cyFBPase启动子在不同器官中的调控，对转基因水稻不同器官的GUS活性进行了荧光定量分析。结果如图5所示，图中1幼穗；2稃片；3穗轴；4穗茎上部；5穗茎下部；6茎；7未抽出叶片；8成熟叶片；9叶鞘；10根。可以看出，在转基因水稻的成熟叶片、叶鞘、穗轴中GUS均有较强的表达，随着叶片成熟度的增加，GUS活性也有所提高，但不显著。在开花期的稃片、穗茎上部也有一定的GUS活性。但在穗茎下部、未抽出的幼叶、幼穗、根、茎中均未检测到GUS活性，与前面的组织化学检测结果相一致。
在该实施例中，GUS活性定量检测及组织化学染色按Jefferson等人的方法进行(Jefferson et al.1987)，对转基因植物的根、茎、叶等组织进行徒手切片，经染色后用70％酒精脱色，最后用OLYMPUS显微镜进行观察照相。
实施例4、本发明启动子的缺失实验1、cyFBPase启动子5’端缺失体植物表达载体的构建为了鉴定启动子区内对特异性表达有调控作用的区段，对1195bp的这段序列进行缺失，构建了一系列缺失体的植物表达载体。两个缺失体分别用引物3(正向序列)5’-TTA AGC TTA ATC CTC GGT TCA AGT TC-3’，引物4(正向序列)5’-TTA AGC TTAACA ACT TCT ACC TTG-3’和实施例3中的引物2从DraI-1的克隆中扩增出-1102bp，-644bp 5’端上游序列，并克隆到pCAMBIA1391Z载体中，记为pB与pD。质粒pC(-768bp)通过用XhoI和BamHI酶解pA，把所要片段插入pCAMBIA1391Z载体中得到其中载体。用XhoI和BamHI酶切pA，把正确的片段插入pCAMBIA1391Z中，产生-768bp的缺失体pC，如图6所示，其中pA指最长的启动子；pB，pC，pD分别代表三个缺失体。所标数字指从cyFBPase翻译起始位点(ATG)开始的上游序列。
2、cyFBPase启动子5’端缺失体在转基因水稻中的表达A、在成熟叶片中的表达通过基因枪法将所构建的缺失体转入水稻。对三个缺失体pB、pC、pD而言，获得的独立来源的潮霉素抗性植株分别为35、37、45株，共95株检测到了GUS活性。
对转基因植株成熟叶片中的GUS活性测定结果表明，自翻译起始位点上游-1195bp缺失至-1102bp时，启动子的活性提高了3倍，进一步缺失至-644bp时，启动子在成熟叶片中的GUS活性与pA的相比提高了近7倍，推测在-1195-1102bp和-1102至-644bp之间分别存在一个对其活性起作用的负调控元件。
缺失体转化植株叶片的组织化学染色结果如图7所示，图中pA、pB、pC、pD为四个缺失体的成熟叶片，从图中可以看出，在pB转化株成熟叶片上，GUS基因不仅在叶肉细胞中有表达，而且在叶片表皮细胞、泡状细胞以及维管组织包括韧皮部、木质部、维管束鞘中均有很强的表达。GUS基因在pC、pD转基因水稻中的表达与pB相似，也是在所有的细胞中都有表达。这表明，当从-1195bp缺失至-1102bp时，启动子表达从叶肉细胞特异性转变为非特异性，此区段可能含有对叶肉细胞特异性表达起调控作用的元件。
B、在根、茎、叶鞘中的表达将各缺失启动子报告基因转化植株的根、茎、叶鞘等不同部位进行组织化学检测，结果如图8所示，图中a、b、c、d分别为pB缺失体的成熟叶片、叶鞘、茎、根；e、f、g、h分别为pC缺失体的成熟叶片、叶鞘、茎、根；i、j、k分别为pD缺失体的成熟叶片、茎、根。从图中可以看出，pB在叶鞘中的表达与叶片中相似，GUS基因也是在所有的细胞中表达。在转基因水稻的茎中，GUS活性在维管组织中有较强的表达，在表皮细胞中表达很弱；在根中，GUS基因在内皮层的部分细胞中有很强的表达，但在表皮、外皮层、韧皮部、木质部、髓心细胞中GUS基因的表达很弱。其它的缺失体pC、pD的表达模式与pB相似，GUS基因几乎在根、茎的所有细胞内表达。进一步说明pB、pC、pD的表达已经从叶肉细胞特异性表达转变为组成型表达，pA启动子-1195-1102bp之间93bp的区段是该启动子叶肉细胞特异性表达所必需的。进一步缺失至-768bp，GUS基因在各器官中的活性则继续升高，对于同一器官而言，pC转化株中的GUS活性均比pB要高许多，但pD与pC的差异不大(如图9所示，图中C茎；L成熟叶片；LS叶鞘；R根)。进一步证明了从-1195-1102bp的93bp的区段和-1102-768bp的344bp存在对该基因活性起调控作用的负调控元件。
C、在种子中的表达对于pA(-1195bp)转化株，GUS基因在种子中的表达很低，其活性除了在开花后15天超过对照之外，在其它时期都接近本底水平，对于另外三个缺失体pB、pC、pD，开花后5天的种子中能检测到GUS活性，从5天到20天，其活性一直是升高的，30天后则开始下降，成熟种子中的活性很低或几乎没有，与GUS组织化学染色的结果一致(结果如图10所示)。
D、在其它器官中的表达对未抽出的叶片以及花粉的GUS染色结果表明，在pA载体的转化植株中，幼嫩叶片中没有GUS基因的表达；在pB、pC、pD缺失体的转化株中，尽管GUS活性比成熟叶片低，但在叶肉细胞、维管束鞘细胞中有明显的兰色反应，在木质部、韧皮部的表达活性非常弱，仍可以看到GUS基因有一定量的表达。在pA植株的花粉中，没有GUS基因的表达；经过缺失后，可以看到在三个缺失体的花粉中都有表达(如图11所示，图中a、b、c、d分别为pA、pB、pC、pD四个缺失体的未抽出叶片；e、f、g、h分别为pA、pB、pC、pD四个缺失体的花粉)。
对其它器官如稃片、穗轴、穗茎等的GUS活性也进行了检测，如图12所示，图中1幼穗；2稃片；3穗轴；4穗茎上部；5穗茎下部；6未抽出叶片。从图中可以看出，pA载体转基因植株在未抽出的幼穗、幼叶中未检测到活性，与组织切片的结果是一致的；其它三个缺失体的转化株在开花期的稃片、穗轴、穗茎上部的表达相对都很强，在幼穗及幼叶中也有一定量的表达。pB载体的转基因植株比pA植株相应的器官要强，而pC、pD的又比pB的强，这与在成熟叶片、叶鞘、茎、根等器官中检测到的结果是一致的。
本发明启动子的缺失实验表明，翻译起始位点ATG上游的这1195bp调控区已足够导致基因在水稻叶肉细胞中特异性表达，因此这1195bp的片段含有使该基因特异性表达的所有顺式调控元件。
实施例5、cyFBPase启动子在转基因烟草中的特性用农杆菌介导法把pA载体转入烟草，再生的植株先用GUS基因特异性的引物作PCR进行初步筛选，阳性株移至温室。
筛选所用的GUS引物为正向序列5’-CAG GAA GTG ATG GAG CAT CAG-3’反向序列5’-TCG TGC ACC ATC AGC ACG TAA-3’结果表明，cyFBPase启动子不能指导报告基因在烟草中表达，暗示在双子叶烟草中没有相应的反式因子与其结合，因而此启动子没有功能。推测cyFBPase基因在双子叶植物与单子叶植物的分化过程中，除了其启动子中的顺式元件发生改变外，与之作用的反式因子也发生了很大变化，最终导致这些反式因子与顺式元件不能交叉识别。
序列表<160>1<210>1<211>1195<212>DNA<213>稻属水稻(Orysa sativa L.)<400>1aaaggtacac tcgattacat tgccggtaat aggcatatag tagttgcgta ccatgtcgag60ttgatcatga gttcatgacc agccccgtgt gaaatcctcg gttcaagttc tttccgagtt 120gcatatacca tcgctttacc tcagcggaca ataaatgagc agggactttt tactcggatt 180atccgtcgca tatgcttgtc aaaagatacg aaaggcagac gaatccagta ggataagtca 240tatgggggtg tgttttattt ctgaaaaaaa tggtaagttt gaggaaagtt gggagtttgg 300aaaaaaagtt aagtttatgt gtatagtaaa gtttttgatg tattatgatg tgatggaaag 360tcagaaatag gggaagacta aacacagcca tggtaaagca gctcttcccc gagctgaccg 420gaagctcgag cagcctagcg tgaaggtaaa gcgtccagtc gcctgcgagt ccccctcccg 480ccctgtagct ctcactcgaa gtcgaacccg gtgccatatt ccacgcgtaa atgctaggcc 540attaaaggca aacaacttct accttggaga gttggaggct tggagcccat ttgcgagacc 600ccctctccgg ttaaccgttt cgccgtcaca tcgggcgcac agcttaacac gacgtacttg 660gtcataatct cgcaccatcc gcgtcggcgt cggcgtcggc gcctctgctc aacaacaact 720acacccccgc tagcttgctg cgttgccgta gtacgtggcg gtacagggca aagccgtgct 780cgcctctagt agctcgactt agctcgggcc tcgatcacct ggggggcgaa acgcgacgac 840cacagacgca cacggccacc gcgctaccag ccatcgcgga tagaggggat aggcctccgc 900gccgattccg ttggagctcc tcgcccctcg gctcccagcc tcactttctc ccctcgctac 960ctcccaaaac ccctaaaaaa aacgcccaat acgtacaccg cgcccgcgtc acgtcacctc 1020accgggtcag ttcccgcgcc gtgtgaccaa tactcaacac ttaaaccgcg cgctttttag 1080ccgacccgag cagccggaga gtgaggcgag gcgaagcgaa gggaagagcg cgaggcagag 1140taagcagacg agaagaacag cgcgcggcgc ggtagctgag gagagtggtg cggag 119权利要求
1.细胞质型1，6-二磷酸果糖酶基因启动子，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)序列表中序列1的缺失体DNA序列；3)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于它具有序列表中序列1的DNA序列。
3.根据权利要求1或2所述的启动子，其特征在于自5’端的第232-237位核苷酸为I盒；自5’端的第624-628位核苷酸为CGTCA盒；自5’端的第984-992位核苷酸为TATA盒；自5’端的第1007-1016位核苷酸为两个串联的CGTCA盒。
4.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于所述缺失体DNA序列为序列表中序列1自5’端分别缺失了93bp、427bp、551bp个核苷酸而形成的缺失体DNA序列。
5.含有权利要求1所述启动子的表达载体。
6.含有权利要求1所述启动子的细胞系。
7.权利要求1所述的启动子在植物育种中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述植物为禾本科单子叶植物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述植物为水稻、玉米、小麦、大麦或谷子。
10.权利要求1所述的启动子在植物代谢调控及分子育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了细胞质型1，6－二磷酸果糖酶基因启动子及其在植物代谢调控及分子育种中应用。本发明所提供的细胞质型1，6－二磷酸果糖酶基因启动子，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)序列表中序列1的缺失体DNA序列；3)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。细胞质型1，6－二磷酸果糖酶基因启动子全长具有叶肉细胞特异性表达模式，而其不同的缺失体则表现出组成性表达模式，本发明启动子系列的发现和其表达模式及功能的阐明，为植物代谢的精细调控和生物工程提供强有力的工具。在植物分子育种中具有重要意义。
文档编号C12N15/52GK1498966SQ0214679
公开日2004年5月26日 申请日期2002年11月8日 优先权日2002年11月8日
发明者储成才, 司丽珍, 宋德林 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所