专利名称：一种基孔肯雅病毒等温扩增检测试剂盒及其引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学检测领域，具体涉及一种基孔肯雅病毒等温扩增快速检测试剂盒及其引物。
背景技术：
基孔肯雅病毒是引起基孔肯雅热病的病原体，主要通过伊蚊叮咬传播。基孔肯雅热是一种人兽共患病，该疾病是以发热、皮疹及关节疼痛为主要特征的病毒急性传染病，主要流行于非洲和东南亚地区，虽然致死率很低，但在蚊媒密度较高的地区容易形成大规模爆发和流行。伊蚊在我国华南、西南等地广泛分布，成为该疾病的暴发流行的潜在诱因。仅 2006年印度报告的基孔肯雅热疑似病例超过139万，部分地区的发病率超过45%。2008年由广东出入境检验检疫局检出我国首例输入性基孔肯雅病毒病例，这提示随着人口流动性增强，基孔肯雅病毒在中国的流行已成为可能。因此，一套快速、灵敏、特异性强，且操作简便，不依赖贵重仪器设备的检测方法，可以为该疾病的防控、流行病学调查提供必要信息。目前对基孔肯雅病毒检测有多种方法，包括病毒分离培养为主的微生物学诊断方法、特异抗体的免疫学检测技术、核酸探针、聚合酶链式反应(PCR)技术等基因检测方法。 其中病原核酸检测在快速性、安全性、准确性和灵敏性等方面都有很大的提高，这些新技术不需要对微生物进行分离提纯，而直接用样本或样品核酸提取物对其基因及基因产物进行快速检测，并且与分子生物学技术及生物信息学手段相结合，向准确、快速、灵敏和自动化的方向发展。PCR(聚合酶链式反应)方法是至今使用最广泛的核酸扩增方法，它作为一种简便高效的基因扩增技术在病原菌诊断过程中发挥着重大作用。PCR方法尽管操作起来比较简单易行，扩增产物在短时间内能够大量聚集。除了 PCR方法以外，还有其他核酸恒温扩增方法，比如核酸序列扩增法(NASBA)、自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)等。这三种方法的检测水平都不少于10个拷贝，耗时1小时左右就可以将目标核酸扩增到相似的范围内。免疫学检测技术快速简便成本低廉，也能够作为基孔肯雅病毒的检测手段。根据PCR技术的原理，需要有变性、退火、延伸三个步骤，每个步骤的反应温度和时间均不相同且有十分精确的要求，甚至需要进行20-40个循环来完成，因此需要依赖相对贵重的PCR温度循环仪进行控制，不利于现场诊断的要求。核酸序列扩增法(NASBA)、自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)虽然属于等温扩增法，它们对目标序列的扩增特异性不强，使得扩增后还需要后续的实验操作手段来对于扩增产物进行检测，因此具有操作繁琐的缺点。免疫学检测技术要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则准确性不够；此外，由于基孔肯雅病毒基因组较短，仅为11. 81Λ，因此表达的蛋白与其他相关病毒，例如阿尼昂尼昂病毒产生交叉反应，因此特异性相对较低。总之，目前，基孔肯雅病毒的检测技术主要有病毒分离培养、患者血清抗体检测和RT-PCR基因检测。病毒分离属于目前检测的金标准，但由于该技术存在检测周期长的问题，不利于快速检测的要求；血清抗体检测能够快速诊断基孔肯雅病毒，但由于该病毒抗体易于阿尼昂尼昂病毒产生交叉反应，因而特异性相对较低；RT-PCR技术虽然能够很好的解决上述问题，但由于需要依赖相对贵重的仪器设备，不利于现场诊断和基层检测的要求。DNA 环介导恒温核酸扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification of DNA，简称LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，在恒温条件下能够特异、高效、快速地进行核酸扩增，具有很多的优越性。该技术具有以下优点(1)特异性强，PCR反应仅需要一对引物来识别靶DNA，达到分子检测的目的，而LAMP技术使用2对引物，一共识别靶DNA的6个不同区域，因此特异性较高；(2)灵敏度高，由于该技术使用了一种灵敏度、扩增效率高的 DNA聚合酶，因此大大提高了灵敏度，并且缩短了检测时间；(3)操作简单，是用肉眼对结果就能进行判断，并且在等温条件下反应，操作简便不依赖贵重仪器设备。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种基孔肯雅病毒等温扩增检测试剂盒及其引物，达到检测时间短、特异性强、灵敏度高、检准率高的效果，使其反应程序化，广泛应用于临床、口岸的常规检测及流行病学调查。为了实现上述目的，本发明的技术方案如下本发明的一种基孔肯雅病毒等温扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括引物、Bst DNA 聚合酶、反应液和STOR Green I荧光染料；所述反应液为IOmM脱氧核苷三磷酸、10 X反应缓冲液和150mM MgS04 ；所述引物序列是如SEQ ID NO :1_4所示的序列外引物1CGCCCTCTTTAACGGACATG ；
外引物2:AATTCGGCGCTGGCTAAG ；
内引物1TGCCTTTCTTGCTGGCTGCATATACCAGCCTGCACCCATT ；
内引物2:AGTGTGCGGTGCATTCGATGATGCAGCTGAGAATTCCCTTC ；
或如SEQID NO 5-8所示的序列
外引物3GCTGAAAACACGCAGTTGAG ；
外引物4TGGCCCCACAATGAATTTGG ；
内引物3GCGGTATGAGCCCTGTATGCTGAAGCACATGTGGAGAAGTCC ；
内引物4CAGCTAAGCTCCGCGTCCTTTCGCCGTTTGCATAGGC ；
或如SEQID NO :9-12所示的序列
外引物5CAGGCACCATCTGGCTTTA ；
外引物6CCCCCAAAGTCTGAGGAATG ；
内引物5GTTCCCTACGGCGCAGTTCAGCAGCACACAGCACCATT ；
内引物6GCCCATCTCCATCGACATACCGCGCACGACATGTCCGTTAA ；
或如SEQID NO :13-16所示的序列
外引物7CGAAGCACATGTGGAGAAGT ；
外引物8:AGACGTCACCTTTGTACACC ；
内引物7TTGGTAAAGGACGCGGAGCTTTTGCATCAGCATACAGGGC ；
内引物8:ACTGCCTATGCAAACGGCGAGTCCAGGCTGAAGACATTGG。
运用上述本发明的检测试剂盒对基孔肯雅病毒进行检测，方法如下
(1)对被检样品的预处理用常规法快速提取样本RNA ；
(2)按照以下配方配制反应液反应体系为25uL =I-IOmM的内引物1和内引物2， 0. I-IOmM的外引物1和外引物2 (其中内引物1、内引物2、外引物1和外引物2是四套引物中的一套)，I-IOmM 的 dNTPs，I-IOmM 的 MgS04，1-10M 的甜菜碱，l_5uL 粗提 DNA，1-8U Bst DNA聚合酶，1-8U反转录酶，加蒸馏水至25uL，温和混勻。(3)进行环介导恒温扩增反应在60 65°C保温0. 5至1. 5小时进行循环链置换反应。(4)分析判断反应产物结果在反应产物中加入荧光染料如市面销售的荧光染料 (SYBR Green I)，混勻，静置5min，反应产物显现绿色则为阳性，显橙色则为阴性。本发明还提供一种用于基孔肯雅病毒等温扩增检测的引物，该引物是针对基孔肯雅病毒特异的El基因所设计的，所述引物序列是如SEQ ID NO :1-4所示的序列外引物1 CGCCCTCTTTAACGGACATG ；外引物2 AATTCGGCGCTGGCTAAG ；内引物 1 TGCCTTTCTTGCTGGCTGCATATACCAGCCTGCACCCATT ；内引物 2 AGTGTGCGGTGCATTCGATGATGCAGCTGAGAATTCCCTTC ；或如SEQ ID NO :5_8所示的序列
外引物 3 GCTGAAAACACGCAGTTGAG ；外引物4 TGGCCCCACAATGAATTTGG ；内引物 3 GCGGTATGAGCCCTGTATGCTGAAGCACATGTGGAGAAGTCC ；内引物 4 CAGCTAAGCTCCGCGTCCTTTCGCCGTTTGCATAGGC ；或如SEQ ID NO 9~12所示的序列外引物5 CAGGCACCATCTGGCTTTA ；外引物6 CCCCCAAAGTCTGAGGAATG内引物 5 GTTCCCTACGGCGCAGTTCAGCAGCACACAGCACCATT ；内引物 6 :GCCCATCTCCATCGACATACCGCGCACGACATGTCCGTTAA ；或如SEQ ID NO 13-16所示的序列
外引物 7 CGAAGCACATGTGGAGAAGT ；外引物8 AGACGTCACCTTTGTACACC ；内引物 7 TTGGTAAAGGACGCGGAGCTTTTGCATCAGCATACAGGGC ；内引物 8 ACTGCCTATGCAAACGGCGAGTCCAGGCTGAAGACATTGG。本发明运用生物信息平台进行大规模基因组分析，对于多态性位点引入简并碱基和基因组分型处理，使引物设计更加完善，在引物设计时，根据LAMP技术的特殊性，充分考虑了引物二聚体AG、3’和5’末端AG、错配概率，优化了引物间距和扩增效率，大大提高了扩增反应的特异性和灵敏度。本发明的有益效果是与现有技术相比，①只需一恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备；而且，在一个反应体系之内可以同时进行反转录与靶基因的扩增，方便操作；②高特异性应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否， 假阳性率为0 ；③快速、高效扩增扩增仅需1小时即可完成，且产率高；④灵敏度高用对基孔肯雅病毒的最低检测极限达到10个拷贝以内，标本的检出率达高到99% ；⑤鉴定简便通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤。⑥用途广，可广泛用于临床、口岸的常规检测及流行病学调查。
图1是用本发明的试剂盒检测基孔肯雅病毒的反应管的颜色变化结果图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进ー步说明，但不作为对本发明的限定。实施例1 基孔肯雅病毒等温基因扩增快速检测试剂盒本发明的试剂盒由以下组分组成(1)检测引物(2) DNA 聚合酶Bst DNA 聚合酶(3)反应液IOmM dNTP (脱氧核苷三磷酸)，IOXThermoPol Buffer (反应缓冲 液)，150mMMgS04 (硫酸镁)(4)荧光染料SYBR Green I检测引物序列是如SEQ ID NO :1_4所示的序列外引物1 CGCCCTCTTTAACGGACATG ；外引物2 AATTCGGCGCTGGCTAAG ；内引物 1 TGCCTTTCTTGCTGGCTGCATATACCAGCCTGCACCCATT ；内引物 2 AGTGTGCGGTGCATTCGATGATGCAGCTGAGAATTCCCTTC ；或如SEQ ID NO :5_8所示的序列外引物3 GCTGAAAACACGCAGTTGAG ；外引物4 TGGCCCCACAATGAATTTGG ；内引物 3 :GCGGTATGAGCCCTGTATGCTGAAGCACATGTGGAGAAGTCC ；内引物 4 CAGCTAAGCTCCGCGTCCTTTCGCCGTTTGCATAGGC ；或如SEQ ID NO 9~12所示的序列外引物5 CAGGCACCATCTGGCTTTA ；外引物6 CCCCCAAAGTCTGAGGAATG ；内引物 5 :GTTCCCTACGGCGCAGTTCAGCAGCACACAGCACCATT ；内引物 6 :GCCCATCTCCATCGACATACCGCGCACGACATGTCCGTTAA ；或如SEQ ID NO 13-16所示的序列
外引物 7 CGAAGCACATGTGGAGAAGT ；外引物8 AGACGTCACCTTTGTACACC ；内引物 7 TTGGTAAAGGACGCGGAGCTTTTGCATCAGCATACAGGGC ；内引物 8 ACTGCCTATGCAAACGGCGAGTCCAGGCTGAAGACATTGG。实施例2 用本发明的试剂盒的一个优选实施例检测基孔肯雅病毒的方法按如下步骤进行步骤ー被检样品的预处理按照常规方法提取样本RNA。步骤ニ 环介导恒温扩增(LAMP)反应本实施例选用的试剂盒含以下序列的引物，如SEQ ID NO :1_4所示的序列
外引物 1 CGCCCTCTTTAACGGACATG
外引物 2 :AATTCGGCGCTGGCTAAG内引物 1 TGCCTTTCTTGCTGGCTGCATATACCAGCCTGCACCCATT内引物 2 :AGTGTGCGGTGCATTCGATGATGCAGCTGAGAATTCCCTTC。配制反应液反应体系为25uL 1. 6mM的内引物1和内引物2，0. 2mM的外引物1禾口外引物 2，1. 6mM 的 dNTPs，6mM 的 MgS04，IM 的甜菜碱，2uL 样本 RNA，8U Bst DNA 聚合酶，2U 反转录酶，加蒸馏水至25uL。将以上组分混合后63°C保温lh。步骤三分析判断反应产物结果在反应产物中加入1. 0μ 1荧光染料(STOR Green I)，混勻，静置5min。若颜色呈绿色则说明样本中存在基孔肯雅病毒，反之则颜色呈橘红色。本实施例的反应结果见图1，图1左侧管反应后颜色为橘红色，表明所检测的样本为基孔肯雅病毒阴性；右侧管反应后颜色为绿色，表明所检测的样本为基孔肯雅病毒阳性。选用其他试剂盒，含如SEQ ID NO :5_8所示的引物序列，或如SEQ ID NO :9_12所示的引物序列，或如SEQ ID NO :13-16所示的引物序列，按如上所述的检测方法对上组被检样品进行检测，都可以得到同样的结果。以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式
中的一种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。序列表<120> 一种基孔肯雅病毒等温扩增检测试剂盒及其引物<160>16<170>PatentIn version 3. 2<210>1<211>20<212>DNA<213> 外引物 1<400>1cgccctcttt aacggacatg20<210>1
<211>18<212>DNA<213> 外引物 2<400>2aattcggcgc tggctaag18<210>1<211>40<212>DNA<213> 内引物 1<400>3
tgcctttctt gctggctgca tataccagcc tgcacccatt 40<210>1<211>41<212>DNA<213> 内引物 2<400>4agtgtgcggt gcattcgatg atgcagctga gaattccctt c 41<210>1<211>20<212>DNA<213> 外引物 3<400>5gctgaaaaca cgcagttgag20<210>1<211>20<212>DNA<213> 外引物 4<400>6tggccccaca atgaatttgg20<210>1<211>42<212>DNA<213> 内引物 3<400>7gcggtatgag ccctgtatgc tgaagcacat gtggagaagt cc 42<210>1<211>37<212>DNA<213> 内引物 4<400>8cagctaagct ccgcgtcctt tcgccgtttg cataggc37<210>1<211>19<212>DNA<213> 外引物 5<400>9caggcaccat ctggcttta19<210>1<211>20
<212>DNA<213> 外引物 6<400>10cccccaaagt ctgaggaatg20<210>1<211>38<212>DNA<213> 内引物 5<400>11gttccctacg gcgcagttca gcagcacaca gcaccatt38<210>1<211>41<212>DNA<213> 内引物 6<400>12gcccatctcc atcgacatac cgcgcacgac atgtccgtta a 41<210>1<211>20<212>DNA<213> 外引物 7<400>13cgaagcacat gtggagaagtz0<210>1<211>20<212>DNA<213> 外引物 8<400>14agacgtcacc tttgtacacc20<210>1<211>40<212>DNA<213> 内引物 7<400>15ttggtaaagg acgcggagct tttgcatcag catacagggc 40<210>1<211>40<212>DNA<213> 内引物 8<400>16
actgcctatg caaacggcga gtccaggctg aagacattgg 40
权利要求
1.一种基孔肯雅病毒等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物、BstDNA 聚合酶、反应液和STOR Green I荧光染料；所述反应液为IOmM脱氧核苷三磷酸、10 X反应缓冲液和150mM MgS04 ； 所述引物序列是如SEQ ID NO 1-4所示的序列 外引物 1 :CGCCCTCTTTAACGGACATG ； 外引物 2 :AATTCGGCGCTGGCTAAG ；内引物 1 :TGCCTTTCTTGCTGGCTGCATATACCAGCCTGCACCCATT ； 内引物 2 :AGTGTGCGGTGCATTCGATGATGCAGCTGAGAATTCCCTTC ； 或如SEQ ID NO 5-8所示的序列 外引物 3 GCTGAAAACACGCAGTTGAG ； 外引物 4 TGGCCCCACAATGAATTTGG ；内引物 3 :GCGGTATGAGCCCTGTATGCTGAAGCACATGTGGAGAAGTCC ；内引物 4 :CAGCTAAGCTCCGCGTCCTTTCGCCGTTTGCATAGGC ；或如SEQ ID NO 9-12所示的序列外引物 5 CAGGCACCATCTGGCTTTA ；外引物 6 CCCCCAAAGTCTGAGGAATG ；内引物 5 :GTTCCCTACGGCGCAGTTCAGCAGCACACAGCACCATT ；内引物 6 :GCCCATCTCCATCGACATACCGCGCACGACATGTCCGTTAA ；或如SEQ ID NO 13-16所示的序列外引物 7 CGAAGCACATGTGGAGAAGT ；外引物 8 :AGACGTCACCTTTGTACACC ；内引物 7 :TTGGTAAAGGACGCGGAGCTTTTGCATCAGCATACAGGGC ；内引物 8 :ACTGCCTATGCAAACGGCGAGTCCAGGCTGAAGACATTGG。
2.一种用于基孔肯雅病毒等温扩增检测的引物，其特征在于，所述引物序列是如SEQ IDNO :1-4所示的序列外引物 1 :CGCCCTCTTTAACGGACATG ； 外引物 2 :AATTCGGCGCTGGCTAAG ；内引物 1 :TGCCTTTCTTGCTGGCTGCATATACCAGCCTGCACCCATT ； 内引物 2 :AGTGTGCGGTGCATTCGATGATGCAGCTGAGAATTCCCTTC ； 或如SEQ ID NO 5-8所示的序列 外引物 3 GCTGAAAACACGCAGTTGAG ； 外引物 4 TGGCCCCACAATGAATTTGG ；内引物 3 :GCGGTATGAGCCCTGTATGCTGAAGCACATGTGGAGAAGTCC ；内引物 4 :CAGCTAAGCTCCGCGTCCTTTCGCCGTTTGCATAGGC ；或如SEQ ID NO 9-12所示的序列外引物 5 CAGGCACCATCTGGCTTTA ；外引物 6 CCCCCAAAGTCTGAGGAATG ；内引物 5 :GTTCCCTACGGCGCAGTTCAGCAGCACACAGCACCATT ；内引物 6 :GCCCATCTCCATCGACATACCGCGCACGACATGTCCGTTAA ；或如SEQ ID NO 13-16所示的序列外引物 7 CGAAGCACATGTGGAGAAGT ；外引物 8 :AGACGTCACCTTTGTACACC ；内引物 7 :TTGGTAAAGGACGCGGAGCTTTTGCATCAGCATACAGGGC ；内引物 8 :ACTGCCTATGCAAACGGCGAGTCCAGGCTGAAGACATTGG。
全文摘要
本发明提供了一种基孔肯雅病毒等温扩增检测试剂盒及其引物，所述试剂盒包括引物、Bst DNA聚合酶、反应液和SYBR Green I荧光染料；所述反应液为10mM脱氧核苷三磷酸、10×反应缓冲液和150mM MgSO4；所述引物序列是如SEQ ID NO1-4所示的序列，或如SEQID NO5-8所示的序列，或如SEQ ID NO9-12所示的序列，或如SEQ ID NO13-16所示的序列。本发明的试剂盒检测时间短、特异性强、灵敏度高、检准率高、反应程序化、鉴定简便，广泛应用于临床、口岸的常规检测及流行病学调查。
文档编号C12N15/11GK102399903SQ20111030199
公开日2012年4月4日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者师永霞, 幸芦琴, 李小波, 石磊, 郑夔, 鲁曦, 黄吉城 申请人:广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 广州迪澳生物科技有限公司