专利名称：改进的β-葡萄糖苷酶基因及其重组酶的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种编码β -葡萄糖苷酶基因及其重组质粒和构建方法，克隆、突变及其高效表达，涉及分子生物学、生物信息学、酶学以及基因工程等领域。具体涉及对原始黑曲霉的葡萄糖苷酶基因进行生物信息学分析和基因的定向改造，以及重组酶的制备。
背景技术：
β -葡萄糖苷酶(β -glucosidase)又称β _D_葡萄糖苷水解酶，别名纤维二糖酶、 龙胆二糖酶和苦杏仁苷酶。是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖的酶。葡萄糖苷酶按其底物特异性可以分为三类第一类是能水解烃基葡萄糖苷或芳香基-葡萄糖苷的酶，此类β -葡萄糖苷酶能水解的底物有纤维二糖、对硝基苯-β -D-葡萄糖苷等；第二类是只能水解烃基-β -葡萄糖苷的酶，这类β -葡萄糖苷酶能水解纤维二糖等；第三类是只能水解芳香基-葡萄糖苷的酶，这类酶能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等类似物。而根据葡萄糖苷酶的基因序列的不同，又可分为葡萄糖苷酶A和葡萄糖苷酶B之分。葡萄糖苷酶在自然界广泛分布，几乎在所有的生物体中都有存在，但来源不同，其性质各异(J Biological Chemistry，1996，271 (39) 23749-23755)οβ-葡萄糖苷酶在植物纤维原料制备燃料乙醇及食品工业中具有重要的应用。 目前，影响木质纤维资源生物转化技术实用化的主要障碍之一就是纤维素降解酶的生产效率和使用效率都很低，从而导致纤维素酶的使用成本要占到酶糖化纤维材料总成本的 25飞0%。在用于制备生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，如木霉属、曲霉属、青霉属等，其中木霉特别是里氏木霉突变株产生的纤维素酶的活力较高、酶系较全、应用最为广泛。但木霉纤维素酶的高活力主要表现在含有高活力的内切型和外切型葡聚糖酶，而β-葡萄糖苷酶的活力明显。研究表明，天然纤维素的有效降解需要由纤维素酶系中内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和葡萄糖苷酶这三大主要组分充分发挥协同作用才能完成，仅用木霉纤维素酶降解时，纤维素二糖会大量积累在水解液中，并强烈反馈抑制内切型和外切型葡聚糖酶的催化活性。所以，低活力的葡萄糖苷酶是造成酶水解纤维资源得率低、酶用量大、成本高的关键因素之一。此外，葡萄糖苷酶可作为风味酶应用于(果)酒、茶叶、果汁中起到增香作用；可应用于乳品工业中分解乳糖；也可应用于催化葡萄糖发生转移反应和缩合反应合成功能性低聚糖等。因此，高活力、低成本的葡萄糖苷酶制备技术已成为国内外在这些领域中的研究热点(Phytochemistry, 1988，27: 1973-1976)。黑曲霉是葡萄糖苷酶的高产菌株。但是，通过营养条件和培养条件的优化，黑曲霉葡萄糖苷酶的活力仍不能满足工业上的需要，而且成本较高。研究表明，对葡萄糖苷酶的基因进行克隆、改造和重组表达被认为可以从根本上显著提高β -葡萄糖苷酶活力的最有效方法。到目前为止，在GenBank和DDJB数据库中已有两条黑曲霉β -葡萄糖苷酶基因序列(力^/7和力^/J )被报道。国内外也有实现了 β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中表达的研究报道，但均未进行高效表达的研究(J Biol Chem.，2000，275: 4973-4980)。研究表明，外源蛋白表达的差异，一方面是受到表达条件的影响，另一方面，由外源基因本身的特性决定。从现有的国内外研究现状来看，对外源基因表达的优化基本上集中在发酵条件的优化。主要包括(1)酵母菌的生长密度，培养温度和ρΗ;(2)甲醇诱导的浓度和诱导时间。通过这些培养条件的优化，提高了外源目的蛋白的表达量。但实际上，要显著提高外源目的蛋白的表达量，其上游技术至关重要。其技术主要包括(1)基因内部结构的优化。外源基因在巴斯德毕赤酵母中能否表达或表达高低首先受到外源基因内部结构的影响，也是表达成功的前提和首要因素。其中，外源基因在宿主中表达时，同一种氨基酸可有广6个密码子，但不同的宿主对编码同一氨基酸的密码子使用频率不同，有些密码子使用频率很高，有些几乎不使用，高效表达的基因倾向于使用部分特定的同义密码子，这些密码子即为改种生物高效表达基因的优越密码子。这就是密码子的偏爱性。目前，国内外都有学者对毕赤酵母部分密码子的用法进行了分析。以Arg为例，编码6种密码子在酵母高效表达基因、低效表达基因使用频率明显不同，密码子CGA和CGG使用频率为0，密码子CGC 几乎不使用，而AGA使用频率最高。研究表明，在酵母中表达较高的基因往往是采用酵母本身所偏爱的密码子；那些富含毕赤酵母稀有密码子的外源基因在毕赤酵母中很难得到高效表达。在不改变氨基酸组成的前提下，将编码外源蛋白的密码子优化为酵母的偏爱密码子， 可以实现外源蛋白在酵母体内表达或表达量的显著提高。到目前为止，对黑曲霉葡萄糖苷酶基因进行定向改造以及该重组酶的高效表达在国内外还未见研究报道。
发明内容
解决的技术问题本发明的目的是大幅度提高黑曲霉葡萄糖苷酶基因的表达水平，获得在毕赤酵母中超量表达的黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因力^·/ II，以及对重组β-葡萄糖苷酶的制备进行研究。因此提供了一种改进的β-葡萄糖苷酶基因及其重组酶的制备。技术方案
改进的β -葡萄糖苷酶基因，核苷酸序列bglll如SEQ ID NO. 1所述。包含上述核苷酸序列的重组质粒。包含上述核苷酸序列的重组质粒pPICZ α -bglll。包含SEQ ID NO. 1所述β -葡萄糖苷酶基因的重组质粒制备方法，步骤为-.bgl II 的合成设计一组98条寡核苷酸，所述98条寡核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 99 所述；黑曲霉的葡萄糖苷酶基因力^/ II的获得，采取两步PCR扩增技术；第一步，反应体系50 μ L 5 μ L的全部98条寡核苷酸引物100 ηΜ，4 μ L dNTP Mixture，各2. 5 mM，5 μ L 10 X PCR Buffer, 2. 5 U Ex iTaq,加水补足 50 μ L，反应条件为94°C预变性 5 min， 94°C变性 30 s，59°C退火 3 min，72°C延伸 1 min，30 个循环，72°C延伸 10 min ；第二步，PCR 扩增基因力^·/ II，反应体系50 μ L 包含上面的反应物2 μ L，引物SEQ ID NO. 2,10 μΜIyL,引物 SEQ ID NO. 99，10 μΜ 1 μ L, dNTP Mixture，各 2.5 mM，4 μ L，5 X PCR Buffer 10 μ L，2. 5 U Ex iTaq,加水补足50 μ L，反应条件为94°C预变性5 min，94°C变性30 s， 59°C退火30 s，72°C 3 min，30个循环，72°C延伸 10 min ；重组质粒pPICZ α-bglll 的构建 将获得的改造后的基因bgl II和pPICZ α -A分别用内切酶I.Sac II进行分步酶切， 并分别割胶回收，浓缩后16°C连接过夜，宿主菌使用ToplOF’的感受态细胞，涂布在LLB平板，LLB平板含25 μ g/mL Zeocin,倒置平板过夜，挑选单菌落到5 mL液体LLB中，液体LLB 中含 25 μ g /mL Zeocin, 37°C, 200 rpm 培养 8 h，得到重组质粒 pPICZ α-bglll。含有上述重组质粒的宿主细胞为毕赤酵母。利用含有上述改进的葡萄糖苷酶基因宿主细胞制备重组酶的方法，发酵培养基为质量浓度为 85% 的 H3PO4 26. 7 mL, CaSO4 · 2H20 0. 93 g, K2SO4 18. 2 g, MgSO4 · 7H20 14. 9 g, KOH 4. 13 g, Glycerol 50 mL, 100 mM K2PO4-KH2PO4 缓冲液 100 mL，加入超纯水至 IL ；PTMl 微量元素=CuSO4 ·5Η20 6.0 g，NaI 0. 08 g, MnSO4 ·Η20 3.0 g, NaMoO4 ·2Η20 0. 2g, H3BO3 0. 02 g, CoCl2 0. 5 g, ZnCl2 20. 0 g, FeSO4 · 7Η20 65. 0 g, H2SO4 5. 0 mL，加入超纯水至1 L，用0.22 ym的滤膜过滤除菌；诱导表达β-葡萄糖苷酶的适宜条件为发酵培养基的PH值6. 0，发酵温度，DO值(溶解氧)在30%左右，并适时添加PTMl，组氨酸和甲醇，诱导时间为108 h。具体方案内容为
包括原始基因的克隆、基因的分析和定向改造以及重组酶的制备。1.参照Genebank上已发表的黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因序列(登录号为 AJ132386)设计引物，以提取的黑曲霉的RNA为模板进行RT-PCR，获得目的基因，并将基因克隆到PMD-18T载体，再以克隆得到的基因为模板，PCR获得去除信号肽的基因，并将去除信号肽的基因克隆到毕赤酵母表达载体PPICZ α，得到重组质粒pPICZ α -bgll，转化毕赤酵母诱导表达后酶活达到4 U/mL (具体见实施例1)。2.根据以下原则对黑曲霉葡萄糖苷酶基因O^/ I)序列进行人工进化1)选用在毕赤酵母中使用频率较高的密码子；2)由于毕赤酵母糖基化程度较低，bgl I基因中的糖基化位点保持不变；幻为降低mRNA二级结构的最小自由能(MFE)，在碱基编排过程中去除了富含GC区和富含AT区域；4)使得GC含量接近毕赤酵母自身实际含量；5)提高翻译终止效率。在DNAWorks软件的辅助下，以毕赤酵母密码子使用频率表为基准，以提高该基因密码子使用频率为主要目的，采用高度或中度使用频率的密码子对力W I的密码子进行优化。并通过设计一组98条用于新基因合成的寡核苷酸，运用DNA合成仪经过化学合成获得这组寡核苷酸引物，该组寡核苷酸引物在同一条链上是相邻的，而与其互补的链有若干碱基是重叠的，重叠区域的解链温度控制在60°C左右。用两步PCR法获得全新的黑曲霉 β-葡萄糖苷酶基因力^/ II (具体见实施例2)。3.为进一步提高降低制备β-葡萄糖苷酶的成本，本研究优化了以基础盐工业培养基为原料的发酵条件。结果表明，在基础盐培养基的发酵培养时，诱导表达葡萄糖苷酶的适宜条件为初始PH值6.0，发酵温度^-30°C，DO值(溶解氧)在30%左右，适时加入 PTMl和组氨酸，并加入甲醇诱导，最终β-葡萄糖苷酶的活力达到137 U/mL (具体见实施例3)。有益效果通过对基因的定向改造和重组菌的高密度发酵，改造后的黑曲霉葡萄糖苷酶基因力^/ II在毕赤酵母中的表达量较原始基因力^/ I提高了 33. 6倍，酶活达到137 U/mL (图-2)。
图1 为重组质粒 pPICZ α -bglll ；
图2为5 L发酵罐的高密度发酵结果，Δ表示菌的浓度(0D_)，〇表示β-葡萄糖苷酶的活性，*表示蛋白浓度；
图3为重组酵母表达β -葡萄糖苷酶的蛋白电泳图，1 7泳道分别为48h，60h，72h, 84h, 90h, 96h, 108h发酵液样品；第8泳道为Mark。
具体实施例方式实施例1 黑曲霉β -葡萄糖苷酶基因的克隆及重组质粒pPICZ α -bgll的构建和表达
1.1 RNA提取(精编分子生物学实验指南(第四版)北京科学出版社，2005): (1)耗材处理所用的塑料耗材经0.1%的DEPC溶液37°C浸泡处理。过夜后，经1.05 kg/cm3、121°C条件下灭菌30 min以去除残余的DEPC。研钵、玻璃器皿在200°C下干热法烘 8 h以上灭活RNA酶。(2)提取方法采用 Invitrogen Micro-to-midi Total RNA purification system,具体方法如下用IXPBS洗涤新鲜的菌丝体3 4次，抽干后用锡纸包好后放入液氮中冷冻。(a)用液氮预冷研钵。取出冷冻好的黑曲霉菌丝体，称好200 mg放入研钵中，用研杵研磨，其间不断加入液氮直至研磨成粉状(无明显可见颗粒，如没有研磨彻底会影响RNA 的收率和质量)。(b)向研钵中加入500 μ 1 RNA Lysis Solution，将研磨成粉末状的样品完全覆
盖，室温静置，直至样品完全融化，再继续研磨至裂解液呈透明状。(c)把研磨好的液体转移到1. 5 mL离心管中，用ImL注射器反复吸取3 4次， 然后在25°C、12，000 rpm的条件下离心2 min，将悬浮液转移至新的1. 5 mL离心管。(d)加入70%乙醇于样品中，反复吸取5次混勻。(e)将一半的勻浆液(约 500 μ L)加入到 RNA Spin Cartridge，在 25°C、12，000 rpm的条件下离心15 s，弃清液，将剩余的样品加入同一根离心管中重复离心。(f)加 700 μ L Wash Buffer I 于 Cartridge 中，在 25°C、12，000 rpm 的条件下离心 15 s，弃清液和 Tube，将 Spin Cartridge 装入一个干净的 RNA Wash Tube (2 mL)。(g)在 Cartridge 中加入 500 μ L Wash Buffer II，在 25°C、12，000 rpm 的条件下离心15 s，弃清液。(h)重复步骤(g) —次，再离心1 min。(i)从 Tbue 中取出 Cartridge，装入一个 RNA Recovery Tube 中。
(j)添加 50 yL RNase-free water 到离心管的膜上，静置 1 min，在 25°C、12，000 rpm的条件下离心2 min，弃除Cartridge。(k)立即使用或于-80°C冰箱保存。用紫外分光光度计测定RNA含量A26(1/A28Q。
1.2引物设计
参照Genebank上已发表的黑曲霉β -葡萄糖苷酶基因序列(登录号为AJ132386)设计引物。(引物 1 :CCCGAATTCATGAGGTTCACTTTGATCG ；引物 2 CCCAAGCTTTTAGTGAACAGTAGGCAG) 1. 3 RT-PCR
RT 反应体系为 10 μ L，含有 MgCl2 2 μ L, 10XRT Bufferl μ L, RNase Free dH20 3. 75 μ L, dNTP Mixture 1 μ L, RNase Inhibitor 0. 25 μ L, AMV Reverse Transcriptase, 0. 5μ L, Oligo dT-Adaptor primer 0.5 μ L, total RNA 彡 500 ng。进行反转录条件为 42°C 20 min, 99°C 5 min, 5°C 5 min。PCR 反转录反应液 40 μ L。含有 5 X PCR Buffer 10 μ L, dH20 28.75 μ L, TaKaRa EX Taq HS, 0. 25 yL，引物 1 (10 μΜ) 0. 5 yL，引物 2 (10 μΜ) 0. 5 μ L，加入上述 RT 反应液进行PCR，条件为94°C预变性 5 min，94°C变性 30 s，58°C退火 30 s，72°C 2.5 min, 30 个循环，72°C延伸10 min，取5 μ L反应产物电泳检测。反应结束后，PCR反应产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收与目的片断大小相近的条带。
1. 4 TA克隆
采用 TaKaRa 公司的 PMD-18T Vector。反应体系 10 yL，其中 pMD_18T Vector DNA IyL, Insert DNA 4μ L, Solution I 5 yL，16°C反应过夜。转化大肠杆菌 JM109 的感受态细胞，并涂布在含X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上，37°C培养，观察菌落颜色进行平板筛选，挑选若干白色菌落至5 mL LB培养基(含Amp)中，37°C下培养8 h，提取重组质粒进行测序验证，得到含有原始基因力^/ I的重组质粒PMD-18T-bglI。
1. 5重组质粒pPICZ α -bgll的构建和表达
设计去除黑曲霉β -葡萄糖苷酶基因信号肽的引物(弓丨物3 CCCGAATTCGCTGATGAATTGGCCTACTCCC ；引物 4 CCCCCGCGGTTAGTGAACAGTAGGCAGAGACGCC),以上述构建好的pMD18-T-bgl I质粒为模板进行PCR扩增，使用TaKaRa公司的I^rime STAR HS DNA 聚合酶，反应体系 50 yL。包含 PMD_18T_bglI 0.5 μ L，引物 3 (10 μ]\02μ ，引物 4 (10 μΜ) 2 μ L, dNTP Mixture (各 2· 5 mM) 4μ L,5XPCR Buffer 10 μ L,Prime STARHS 0· 5μ L,力口 ddH20 M 50 μ L。反应条件94°C预变性5 min，94°C变性 30 s，58°C退火 30 s，72°C 2.5 min, 30 个循环，72°C延伸10 min，取5 μ L反应产物电泳检测。将获得的目的基因和pPICZ α -A分别用内切酶I.Sac II进行分步酶切，并分别割胶回收，浓缩后16°C连接过夜。宿主菌使用ToplOF’的感受态细胞，涂布在LLB平板 (含25Pg/mL Zeocin),倒置平板过夜，挑选单菌落到5 mL液体LLB (含25Pg/mL Zeocin) 中，37°C，200 rpm培养8 h。提取重组质粒进行测序验证，得到含有原始基因I的重组
7质粒pPICZa-bgll。使用/ ^ I对重组质粒pPICZa-bgll进行单酶切。电泳检测，酶切完全后，纯化酶切产物，用10 μ L ddH20重悬浓缩后的DNA。取80 μ L感受态毕赤酵母细胞与10 4 1^线性化的重组质粒？？扣2(1^^11混合， 转入预冷的0.2 cm电转杯中。冰浴5 min0根据所使用装置推荐的毕赤酵母参数进行电击。电击结束后，立即加入1 mL预冷的1 M山梨醇，将内容物转移至灭菌离心管中。30°C 水浴静置1 2 h后，将200 μ L转化后的细胞涂布在含500 Pg/mL Zeocin YPDS平板上， 30°C倒置培养2 4 d。挑取单菌落，在MMH及MDH平板上按顺序点转化子。以GSll5/HIS+ Muts Ablumin 及GS115/ HIS+ Mut+β-gal为对照菌株。30°C培养2天。在MDH上生长正常而在MMH上生长缓慢或不生长的转化子为阳性转化子。挑取阳性转化子。将阳性转化子接种到YPD平板上活化，培养2 d，接单菌落到10 mL BMGY液体培养基中，30°C，200 rpm摇床培养48 h，当OD6tltl达到2 6之间时，离心，弃上清，用无菌超纯水洗涤菌体1 2次。将用BMMY诱导培养基稀释菌体至OD6tltl=I,用4层纱布代替棉塞，于30°C，250 rpm摇床培养。定时取样1 mL菌液，同时补加1 mL ΒΜΜΥ、0. 5% (V/ V)甲醇。样品于12000 rpm下离心5 min，取上清检测酶活，酶活测定采用pNPG(对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷)法测定(Arch. Biochem. Biophys. , 1964，108: 22-29)。
实施例2 黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的定向改造及重组质粒pPICZa-bglll的构建 2.1黑曲霉葡萄糖苷酶基因的定向改造
毕赤酵母表达系统是近年来发展很快的一个真核表达系统，非常适合真核蛋白的表达，表现在其很强的真核蛋白质修饰功能上，能对蛋白质进行翻译后正确的加工、折叠和糖基化修饰等。不同宿主间密码子使用频率的差异是影响基因在异源宿主中表达效率的主要因素。与其他微生物一样，毕赤酵母表达外源基因具有密码子偏好性。来源于黑曲霉的 β -葡萄糖苷酶基因bglY中存在有很多毕赤酵母利用率较低的稀有密码子，从而使得bgl I不能获得更高效的表达。因此，为实现bgl I在毕赤酵母中的高效表达，在不改变氨基酸序列的前提下，本研究首先对力^/ I进行了密码子优化(生物工程学报，2000，16(3): 308-311)。在DNAWorks 软件的辅助下(Nucleic Acids Res.，2002，30(10) e43)，以毕赤酵母密码子使用频率表为基准，以提高该基因密码子使用频率为主要目的，采用高度或中度使用频率的密码子对β-葡萄糖苷酶基因(力W I)的密码子进行优化。经优化后，
II的密码子在毕赤酵母中的最适使用频率从0. 64增加到0. 84。高频密码子使用率在60% 以上。平均GC含量从56. 49%下降至44. 61%，与酵母自身GC含量相近。通过对mRNA 二级结构进行分析，对位于基因1294 bp和1478 bp处的基因进行优化，避免了由于出现回文序列而导致翻译提前终止的可能。同时对葡萄糖苷酶基因 (,bgl I)中出现的重复序列进行了优化，破坏影响核糖体结合和mRNA稳定的茎环结构。并以来源于黑曲霉的葡萄糖苷酶基因I)序列为基础，使用DNAMAN软件，设计了一组98条寡核苷酸，运用DNA合成仪经过化学合成获得这组寡核苷酸。人工进化的黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因力^·/ II的获得采取两步PCR扩增技术。第一步，反应体系50 yL:5 μ L的全部98条寡核苷酸引物(100 ηΜ)，4 μ L dNTPMixture (各 2. 5 mmol/L) ,5μ L 10 X PCR Buffer, 2. 5 U Ex Taq，加水补足 50 μ L，反应条件为94°C预变性 5 min，94°C变性 30 s，59°C退火 3 min，72°C 1 min，30 个循环，72°C延伸 10 min ；第二步，PCR扩增基因力^·/ II，反应体系50ul 包含上面的反应物2 yL，引物SEQ ID NO. 2,10 μΜ 1 μ L，引物 SEQ ID NO. 99，10 μΜ 1 μ L, dNTP Mixture (各 2· 5 mM)4y L, 5 X PCR BufferlOy L, 2. 5 U Ex Taq，加水补足 50 μ L，反应条件为94°C预变性 5 min, 94°C变性 30 s，59°C退火 30 s，72°C 3 min，30 个循环，72°C延伸 10 min，取 5 μ L 反应产物电泳检测。
2.2重组质粒pPICZ α -bglll的构建
将获得的改造后的基因力^/ II和pPICZ α-A分别用内切酶I.Sac II进行分步酶切，并分别割胶回收，浓缩后16°C连接过夜。宿主菌使用ToplOF’的感受态细胞，涂布在 LLB平板(含25 Pg/mL Zeocin)，倒置平板过夜，挑选单菌落到5 mL液体LLB (含25 μδ/ mL Zeocin)中，37°C，200 r/min培养8 h。提取重组质粒进行测序验证，得到含有优化后的基因知7 II的重组质粒pPICZa-bglll (图-1)。
实施例3 重组质粒pPICZ a -bglll转化毕赤酵母及重组酶的制备
3.1表达载体的酶切线性化及其质粒的回收
将鉴定正确的阳性转化子大量培养，采用大提质粒的方法提取重组质粒 pPICZ a-bglll。使用/ ^ I对重组质粒pPICZ a-bglll进行单酶切。电泳检测，酶切完全后，纯化酶切产物，用10 μ L ddH20重悬浓缩后的DNA。
3.2毕赤酵母的电击转化
将毕赤酵母菌株GS115活化后，接种到500 mL YPD培养基中，30°C培养至OD6tltl为1. 3 1.5。4°C, 1500 rpm条件下离心5 min，收集细胞，分别用500 mL、250 mL预冷的灭菌水洗涤细胞。4°C，1500 rpm条件下离心，用20 mL预冷的1 M山梨醇悬浮、洗涤细胞。最后用 1 mL预冷的1 M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5 mL。取80 μ L上述细胞与10 μ L线性化的重组质粒pPICZ a-bglll混合，转入预冷的0.2 cm电转杯中。冰浴5 min。根据所使用装置推荐的毕赤酵母参数进行电击。电击结束后，立即加入ImL预冷的1 M山梨醇，将内容物转移至灭菌离心管中。30°C水浴静置1 2 h后，将200 μ L转化后的细胞涂布在含 500 Pg/mL Zeocin YPDS 平板上，30°C倒置培养 2 4 d。
3. 3重组毕赤酵母的筛选和鉴定
挑取单菌落，在MMH及MDH平板上按顺序点转化子。以GS115/HIS+ Muts Ablumin及 GS115/ HIS+ Mut+β-gal为对照菌株。30°C培养2天。在MDH上生长正常而在MMH上生长缓慢或不生长的转化子为阳性转化子。挑取阳性转化子。
3. 4重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达
将阳性转化子接种到YPD平板上活化，28°C培养2 d，接单菌落到10 mL BMGY液体培养基中，30°C，200 r/min摇床培养48h，当OD6tltl达到2 6之间时，离心，弃上清，用无菌超纯水洗涤菌体1 2次。将用BMMY诱导培养基稀释菌体至0D_=1，用4层纱布代替棉塞， 于30°C，250 r/min摇床培养。定时取样1 mL菌液，同时补加1 mL ΒΜΜΥ,Ο. 5% (V/V)甲醇。样品于12000 rpm下离心5 min，取上清贮存于4°C用于检测酶活。
3. 5重组毕赤酵母的高密度发酵
发酵培养基(FM21) :(85% wt) H3PO4 26. 7 mL，CaSO4 · 2H20 0. 93 g，K2SO4 18. 2 g, MgSO4 ·7Η20 14. 9 g，K0H 4. 13 g, Glycerol 50 mL, 100 mM K2PO4-KH2PO4 缓冲液 100 mL，力口入超纯水至1L。PTMl 微量元素=CuSO4 · 5H20 6. 0 g, NaI 0. 08 g, MnSO4 · H2O 3. 0 g, NaMoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3 0. 02 g，CoCl2 0.5 g，ZnCl2 20. 0 g，FeSO4 · 7H20 65. 0 g，H2SO4 5. OmL，加入超纯水至1L，用0.22μπι的滤膜过滤除菌。
3. 5. 1种子培养
1)将重组毕赤酵母在YPD琼脂板上划线培养。2)至菌落长到2 mm左右，挑取单克隆菌落加入到10 mL YPD培养液(种子培养基) 中，28°C，190 rpm震荡培养16 M h。3)将上述培养物加入到300 mL BMGY培养液中，28°C，190 rpm震荡培养24h左右，OD600 7。3. 5. 2生物量的累积
1)调校设备校准发酵罐的PH计、溶氧计(在时进行)，并进行蠕动泵的流量校准。2)配制2. 5 L FM21培养基，加入5L发酵罐，121°C，30 min高压灭菌培养基、发酵
罐及管道。3)待发酵罐内培养基冷却到室温时，用观％的氨水调节FM21培养基的pH值为 6. 0，而后加入0. 8%(V/V) PTMl微量元素。4)将上述300 mL BMGY培养菌种加入发酵罐，开始发酵罐培养，此为第一阶段， 即甘油培养扩增菌体。5)此阶段每隔6 h取样1次，测0D_和细胞湿重，分析酵母菌生长状态，肉眼和镜下观察菌液，排除杂菌污染，并留上清用于蛋白及酶活分析。6)约18 h后DO值上升至接近100%，说明培养基中甘油已消耗殆尽，转入补充甘油阶段以进一步增加菌体密度。7)在高压灭菌后的50%甘油中加入1. (V/V) PTMl微量元素，混勻后，以18.2 mL/h/L初始发酵液即M6 mL/h的速率加入到发酵罐中，至菌体湿重达180 220 g/L。在接种20小时左右，向发酵液中加入组氨酸，至终浓度为0. 1%。8)此阶段适时调整发酵罐的搅拌速度，维持DO值(溶解氧)在30%以上；自动调控温度、PH是其值分别为28°C、6. 0。9)停止补加甘油后，观测DO值上升至接近100%后，继续维持“甘油饥饿”状态 30min，转入甲醇诱导表达阶段。3. 5. 3甲醇诱导β -葡萄糖苷酶的合成1)在甲醇中加入1. 2% PTMl微量元素，混勻后，以3. 6 mL/h/L初始发酵液即108 mL/h 的速率加入到发酵罐中诱导表达，维持此低速率2 3 h，以使酵母适应以甲醇为唯一碳源的环境。2)在首次流加甲醇的同时，向发酵液中加入组氨酸，至终浓度为0. 1%。3)当酵母适应以甲醇为唯一碳源的环境后，DO值即保持稳定，继续维持此低速率补加甲醇lh。补加甲醇的速率升为7.2 mL/h/L初始发酵液即216 mL/h，以此速率维持2 h。4)升高补加甲醇的速率为llmL/h/L初始发酵液即330 mL/h,同时监测DO值和发酵液温度并判断甲醇是否过量(停补甲醇观测DO值变化，若停补甲醇后，DO值在Imin内上升幅度大于10%，说明碳源受限，反之说明甲醇过量)，若碳源受限，则加快补甲醇的速率， 若甲醇过量则应调慢补甲醇的速率，直到合适的速度。5)开始诱导表达后，每隔6 h取样1次，测0D_和细胞湿重，分析酵母菌生长状态，并留上清用于蛋白分析(图3)。6)此阶段适时调整发酵罐的搅拌速度，维持DO值(溶解氧)在30%以上；自动调控温度、PH使其值分别为30°C、5. 0。7)当发现酶活和目的蛋白量维持稳定，即结束发酵，最终酶活达到137 U/mL (图 _2)。
权利要求
1.改进的β-葡萄糖苷酶基因，其特征在于核苷酸序列bglII如SEQ ID NO. 1所述。
2.包含权利要求1所述核苷酸序列的重组质粒。
3.包含权利要求1所述核苷酸序列的重组质粒PPICZα -bglll。
4.包含SEQID NO. 1所述β -葡萄糖苷酶基因的重组质粒制备方法，其特征在于步骤为bgl II的合成设计一组98条寡核苷酸，所述98条寡核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 99所述；黑曲霉的β-葡萄糖苷酶基因II的获得，采取两步PCR扩增技术； 第一步，反应体系50 μ L 5 μ L的全部98条寡核苷酸引物100 ηΜ，4 μ L dNTP Mixture, 各 2. 5 mM，5 μ L 10 X PCR Buffer, 2. 5 U Ex Taq，加水补足 50 μ L，反应条件为94°C预变性 5 min，94°C变性 30 s，59°C退火 3 min，72°C 1 min，30 个循环，72°C延伸 10 min ；第二步，PCR扩增基因bgl II，反应体系50 μ L 包含上面的反应物2 μ L，引物SEQ ID NO. 2， 10 μΜ 1 μ L，引物 SEQ ID Ν0· 99，10 μΜ 1 μ L, dNTP Mixture,各 2.5 mM,4 μ L，5 XPCR Buffer 10 μ L,2. 5 U Ex Taq，加水补足50 μ L，反应条件为:94°C预变性5 min，94°C变性 30 s，59°C退火 30 s，72°C 3 min，30 个循环，72°C延伸 10 min ；重组质粒pPICZa -bglll的构建将获得的改造后的基因II和pPICZa -A分别用内切酶feoR I.Sac II进行分步酶切，并分别割胶回收，浓缩后16°C连接过夜，宿主菌使用 ToplOF'的感受态细胞，涂布在LLB平板，LLB平板含25 μ g/mL Zeocin，倒置平板过夜，挑选单菌落到5 mL液体LLB中，液体LLB中含25 μ g /mL Zeocin, 37°C, 200 rpm培养8 h, 得到重组质粒pPICZ a -bglll。
5.含有权利要求3所述重组质粒的宿主细胞为毕赤酵母。
6.利用含有权利要求1所述改进的葡萄糖苷酶基因宿主细胞制备重组酶的方法， 其特征在于发酵培养基为质量浓度为85%的H3PO4 26. 7 mL, CaSO4 · 2H20 0. 93 g，K2SO4 18. 2 g,MgSO4 ·7Η20 14. 9 g，K0H 4. 13 g, Glycerol 50 mL, 100 mM K2PO4-KH2PO4 缓冲液 100 mL，加入超纯水至 IL ；PTMl 微量元素=CuSO4 · 5H20 6. 0 g, NaI 0. 08 g, MnSO4 · H2O 3. 0 g, NaMoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3 0. 02 g, CoCl2 0. 5 g, ZnCl2 20. 0 g, FeSO4 · 7H20 65. 0 g, H2SO4 5.0!^，加入超纯水至11^，用0.22 ym的滤膜过滤除菌；诱导表达β-葡萄糖苷酶的适宜条件为发酵培养基的PH值6. 0，发酵温度28-30°C，DO值在30%左右，并添加诱导量的 PTMl，组氨酸和甲醇，诱导时间为108 h。
全文摘要
改进的β-葡萄糖苷酶基因及其重组酶的制备，改进的β-葡萄糖苷酶基因核苷酸序列bglII如SEQIDNO.1所述。本发明同时提供了以基础盐为培养基的该重组菌表达β-葡萄糖苷酶的方法。通过对基因的人工进化和高密度发酵，改造后的黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因bglII在毕氏酵母中的表达量较原始基因bglI提高了36倍。本发明可用于β-葡萄糖苷酶基因的分子改造及其重组毕赤酵母基因工程菌的高密度发酵，能显著提高β-葡萄糖苷酶的表达水平。
文档编号C12N9/42GK102399803SQ20111030193
公开日2012年4月4日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者周潭澈, 李迅, 赵林果 申请人:南京林业大学