专利名称：人工线虫抗凝蛋白及其编码基因与该基因的高效表达方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域中人工线虫抗凝蛋白及其编码基因与该基因的高效表达方法。
背景技术：
血栓是血管腔内血液发生凝固或血液中的某些有形成分互相凝集形成的固体凝块。影响血栓形成的因素可分为血管和血液两大类。血管因素主要与血管内膜的完整性受破坏有关。血液因素则包含多种凝血因子和血小板的互相作用，导致血液内纤维蛋白的形成与聚集的血小板和其它有形成分共同形成血栓。血液内的凝血因子包括因子I至因子XII等多种，其中最常见的抗凝药物影响的是因子II、VII、IX和X。
干扰血液凝固过程的药物，称为抗凝药，已被临床上广泛用于血栓塞性疾病的预防与治疗。目前在临床上使用的抗凝剂，如肝素，水蛭素，双香豆素，抗凝血酶III等，使用过程中均显示拌有一些不良反应，如肝素所致的血小板减少性紫癜。因此，寻找新的有效的，且不良反应少的抗凝剂具有重要意义。
从狗线虫中提取的抗凝蛋白C2具有明显的抗凝作用(见美国专利5866543)，其作用与抑制活化的因子VIIa有关，但对因子IIa(凝血酶)的活性无影响。该蛋白是由91个氨基酸残基组成的多肽，可延长凝血时间，活性优于肝素。目前该蛋白已通过生物提取和基因工程表达的方式获得，但表达效率均较低，难以形成规模化生产。
毕赤酵母表达系统是用于表达外源蛋白的最成功的表达系统之一，近年来发展非常迅速，目前已有几百种蛋白在该表达系统中得以表达。毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母菌，其生长迅速，培养条件简单，可以高密度连续培养，遗传操作与酿酒酵母相似，技术已相当成熟，是工业生产中常用的高表达菌种。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的人工合成的线虫抗凝蛋白及其编码基因。
本发明提供的线虫抗凝蛋白，是具有序列表中序列4氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列4的氨基酸残基序列相同活性的由序列4衍生的蛋白质。
序列表中序列4的蛋白质由84个氨基酸残基组成。
本发明选用了毕赤酵母菌优选密码子，并用计算机模拟计算了翻译起始区和线虫抗凝蛋白基因5’端二级结构最小生成自由能，设计并合成了线虫抗凝蛋白基因序列。
线虫抗凝蛋白的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由255个核苷酸组成，编码序列表中序列4的蛋白质。
含有本发明线虫抗凝蛋白编码基因的表达载体、细胞系均属于本发明的保护范围。
本发明的第二个目的是提供一种高效表达上述人工合成的线虫抗凝蛋白基因的方法。
为实现这一目的，本发明采用以下技术方案线虫抗凝蛋白基因的高效表达方法，是将上述人工合成的线虫抗凝蛋白基因导入到毕赤酵母菌中，表达获得线虫抗凝蛋白，具体的说包括以下步骤1)合成线虫抗凝蛋白基因序列；2)将合成的基因片段与载体pPIC9K连接，得到表达质粒，转化毕赤酵母菌后获得表达工程菌；3)培养工程菌，表达产物分泌到培养液中，获得目标蛋白。
为了使表达更加高效，毕赤酵母菌的表达过程中用甲醇进行诱导。诱导过程中的甲醇终浓度优选为1％-5％。
用本发明的方法得到的线虫抗凝蛋白占培养液总蛋白的92％以上，表达过程操作简单，产品成本较低，可用于规模化生产。
本发明的线虫抗凝蛋白具有显著的抗凝血作用，对于开发新的抗凝药物具有重要意义。
图1为本发明线虫抗凝蛋白PCR扩增后的电泳图谱。
图2为载体pGEM-ACP2的图谱。
图3为pGEM-ACP2表达质粒的图谱。
图4为pGEM-ACP2表达质粒酶切凝胶电泳图谱。
图5为诱导前后培养液电泳图。
图6为目标产物的活性鉴定。
具体实施例方式
实施例1、表达基因的合成1、小片段的人工合成将序列1线虫抗凝蛋白基因分为二段，第一段序列为cDNA正链，第二段序列为cDNA互补链。在第一段的3’端外加8个与第二段3’互补的碱基，总长150个碱基，为序列表中的序列2，在第二段的3’端外加8个与第一段3’端互补的碱基，总长147个碱基，为序列表中的序列3。在两片段5’端分别加上NdeI和NotI酶切位点，用DNA合成仪合成。
将DNA合成仪合成的片段，用单一循环的PCR反应连接合成序列1的全序列线虫抗凝蛋白基因，如图1所示，表明得到的序列正确。
实施例2、线虫抗凝蛋白体外表达1、切取该PCR片段，装入pGEM-T-EASY质粒内，构建pGEM-ACP2克隆载体，其结构图谱如图2所示。
2、pGEM-ACP2表达质粒的构建采用购自美国Invitrogen公司的高效表达质粒pPIC9K，用NdeI和NotI分别酶切pGEM-ACP2质粒和pPIC9K质粒，凝胶电泳收集目标片段，用T4连接酶16℃过夜连接。经常规方法的转化，挑菌，扩增获得表达质粒pGEM-ACP2，其结构图谱如图3所示。如图4所示，酶切鉴定，证明表达质粒的结构正确。
3、将质粒pGEM-ACP2用SacI线性化.采用浙江新芝公司电基因导入仪，将线性化的pGEM-ACP2导入GS115毕赤酵母菌(购自Invitrogen公司)内，经培养，挑选，筛选等过程，获得抗G418mg/ml的单克隆菌。
4、挑选单克隆菌，接种于5ml培养基中，30℃过夜，然后转入250ml培养基中，继续培养至OD600＝10-20，收集菌体，用无碳源培养基稀释至OD600＝50，继续培养24小时，加入甲醇至终浓度为1％诱导表达，每隔24小时加甲醇一次，至96小时。离心取上清液，进行凝胶电泳分析和功能测定。取10ml上清液，用12％SDS-PAGE电泳，并经考马斯亮兰染色。结果可见，在15KD的位置，有诱导的蛋白表达，并根据BSA对照，估测表达量为150mg/L。
在本实施例中，培养单克隆菌体时用甲醇进行诱导意义很大，在没有诱导之前，培养液中目标蛋白的含量很低，如图5所示，诱导后的培养液中有显著的目标蛋白带，大小与序列4的蛋白相同，而诱导前的培养液中没有显著的目标蛋白带。
实施例3、本发明线虫抗凝蛋白的功能测定取5支试管，分别标为磷酸缓冲液、甲醇诱导前上清、甲醇诱导后上清1、上清2、上清3，加入对应液体10ul/管，然后加入新鲜采集的兔动脉血90ul/管，混匀，记录血液凝固时间，结果如图6所示，其中血凝抑制率的计算公式为反应1小时时，测定组血液凝固管数/磷酸缓冲液组血液凝固管数，磷酸缓冲液组和诱导前上清分别于1.62分和1.58分形成血凝块，诱导后上清于12小时后仍无血凝块形成，表明表达产物具有良好的抗凝活性。
序列表<160>4<210>1<211>255<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1aaggctacca tgcagtgtgg tgagaatgag aagtacgact cctgcggtag caaggagtgt 60gacaagaagt gtaagtacga cggtgttgag gaggaggacg acgaggagcc aaatgtccca120tgcctagttc gtgtctgtca ccaagactgc gtttgcgagg agggtttcta cagaaacaag180gacgacaagt gtgtttctgc tgaggactgc gagcttgaca atatggactt catttaccca240ggtactcgaa actga 255<210>2<211>150<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gaagcttacg taaaggctac catgcagtgt ggtgagaatg agaagtacga ctcctgcggt 60agcaaggagt gtgacaagaa gtgtaagtac gacggtgttg aggaggagga cgacgaggag120ccaaatgtcc catgcctagt tcgtgtctgt 150<210>3<211>147<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3attcgcggcc gctcagtttc gagtacctgg gtaaatgaag tccatattgt caagctcgca 60gtcctcagca gaaacacact tgtcgtcctt gtttctgtag aaaccctcct cgcaaacgca120gtcttggtga cagacacgaa ctaggca147<210>4<211>84<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>4Lys Ala Thr Met Gln Cys Gly Glu Asn Glu Lys Tyr Asp Ser Cys1 5 10 15Gly Ser Lys Glu Cys Asp Lys Lys Cys Lys Tyr Asp Gly Val Glu20 25 30Glu Glu Asp Asp Glu Glu Pro Asn Val Pro Cys Leu Val Arg Val35 40 45Cys His Gln Asp Cys Val Cys Glu Glu Gly Phe Tyr Arg Asn Lys50 55 60Asp Asp Lys Cys Val Ser Ala Glu Asp Cys Glu Leu Asp Asn Met65 70 75Asp Phe Ile Tyr Pro Gly Thr Arg Asn80 8权利要求
1.线虫抗凝蛋白，是具有序列表中序列4氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列4的氨基酸残基序列相同活性的由序列4衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的线虫抗凝蛋白，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质。
3.线虫抗凝蛋白的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述线虫抗凝蛋白的编码基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.含有权利要求3或4所述基因的表达载体。
6.含有权利要求3或4所述基因的细胞系。
7.线虫抗凝蛋白基因的高效表达方法，是将权利要求3的基因导入到毕赤酵母菌中，表达获得线虫抗凝蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于包括以下步骤1)合成线虫抗凝蛋白基因序列；2)将合成的基因片段与载体pPIC9K连接，得到表达质粒，转化毕赤酵母菌后获得表达工程菌；3)培养工程菌，表达产物分泌到培养液中，获得目标蛋白。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于毕赤酵母菌的表达过程中用甲醇进行诱导。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于诱导过程中的甲醇终浓度为1％-5％。
全文摘要
本发明公开了人工线虫抗凝蛋白及其编码基因与该基因的高效表达方法，本发明提供的线虫抗凝蛋白，是具有序列表中序列4氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列4的氨基酸残基序列相同活性的由序列4衍生的蛋白质。线虫抗凝蛋白的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的线虫抗凝蛋白具有显著的抗凝血作用，对于开发新的抗凝药物具有重要意义。
文档编号C12N15/81GK1498900SQ02146789
公开日2004年5月26日 申请日期2002年11月8日 优先权日2002年11月8日
发明者刘凤鸣, 折志刚 申请人:刘凤鸣